DB46-T220-2012-檳榔苗黃化病植原體PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范-海南省

ICS65.020B16DB46備案號(hào)：33827-2012海南省地方標(biāo)準(zhǔn)DB46/T220—2012檳榔苗黃化病植原體PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范TechnicalspecificationforPCRdetectionofarecanutyellowleafphytoplasmaofseedling海南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局發(fā)布DB46/T220—2012前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則起草。本標(biāo)準(zhǔn)的附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B為資料性附錄。本標(biāo)準(zhǔn)由海南省質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局提出。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：羅大全、車海彥、溫衍生、徐雪蓮。本標(biāo)準(zhǔn)首次發(fā)布于2012年4月。IDB46/T220—2012檳榔苗黃化病植原體PCR檢測(cè)技術(shù)規(guī)范12范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了檳榔苗黃化病植原體的檢測(cè)技術(shù)規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檳榔苗中檳榔黃化病植原體的檢測(cè)。規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標(biāo)準(zhǔn)。3.1Ct值檳榔苗以染色體DNA為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)技術(shù)已用來檢測(cè)和鑒定植原體。根據(jù)16SrRNA基因保守序列設(shè)計(jì)通用引物，應(yīng)用巢式PCR（nested–PCR）技術(shù)檢測(cè)。根據(jù)16SrRNA基因序列設(shè)計(jì)翠菊黃化組（16SrⅠ組）植原體特異性引物/探針組合，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR的檢測(cè)。臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（最高轉(zhuǎn)速在12000rpm以上）、全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)、PCR儀、全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)、全自動(dòng)滅菌器、電子分析天平（萬分之一）、旋渦混合器、水平電泳裝置，微量可調(diào)移液器（0.1-1000μL)。1DB46/T220—2012用于巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的試劑和緩沖液配制，參見附錄A。7檢測(cè)方法7.1檳榔心葉總DNA提取稱取抽樣的檳榔植株剛抽出的心葉0.5g，加入適量液氮研磨呈粉狀，再加入1mLDNA提取緩沖液充分研磨，然后加入80μL10%十二烷基肌氨酸鈉，混勻，在55℃溫育1~2h，4℃6000rpm離心10min，取上清液；加入2/3體積異丙醇到上清液中，輕輕混勻，-20℃保持至少30min，4℃8000rpm離心15min，棄上清；加入600μLTE緩沖液、30μL10%十二烷基硫酸鈉和12μL蛋白酶K（5mg/ml），輕輕徹底懸浮沉淀，37℃溫育30-60min；加100μL5MNaCl混勻，再加入84μLCTAB/NaCl溶液混勻，65℃溫育10min；加入等體積氯仿：異戊醇（24：1）混勻，4℃6000rpm離心5min，重復(fù)直至無中間白色層；取上清液，加入等體積苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），混勻，4℃6000rpm離心5min；取上清液，加入2/3體積異丙醇，混勻，-20℃保持至少30min，4℃12000rpm離心10min，棄上清液；加入500μL70%乙醇洗滌，4℃12000rpm離心10min，洗滌兩次；取沉淀，加入50μLTE混勻溶解。加入5μLRNaseA(10μg/μl)，37℃30min,除去RNA。7.2巢式PCR檢測(cè)下述反應(yīng)均需同時(shí)設(shè)植原體16SrDNA質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)經(jīng)確認(rèn)的健康檳榔植株葉片作為陰性對(duì)照，設(shè)滅菌雙蒸水作為空白對(duì)照。7.2.1引物序列引物采用植原體16SrDNA通用引物R16mF2/R16mR1和R16F2n/R16R2，引物序列見表1。表1巢式PCR檢測(cè)的引物序列PCR反應(yīng)條件為：94℃，預(yù)變性2min；94℃變性1min；45℃退火45s，72℃延伸1min；共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。以R16mF2/R16mR1作為第一引物對(duì)，R16F2n/R16R2作為第二引物對(duì)，進(jìn)行巢式PCR(nested-PCR)擴(kuò)增，直接PCR以7.1中提取的總DNA為模板，巢式PCR以直接PCR產(chǎn)物稀釋50倍后的樣品為模板。PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與直接PCR擴(kuò)增相同。2DB46/T220—2012表2（續(xù)）組分加樣量（μL）10mmol/LdNTPs2.51.010μmol/L上游引物10μmol/L下游引物TaqDNA聚合酶（5U/μL）模板DNA1.00.21.0補(bǔ)滅菌雙蒸水至最終反應(yīng)體系25μL取5μLPCR產(chǎn)物在1％瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL溴化乙錠）中電泳。利用MarkerDL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，在120V電場(chǎng)強(qiáng)度下電泳約20min，最后用全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)照相。7.2.3PCR產(chǎn)物序列RFLP圖譜分析將第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，序列結(jié)果利用植原體分類鑒定的在線專用數(shù)據(jù)庫(kù)-iPhyClassifier（http://plantpathology.ba.ars.usda.gov/cgibin/resource/iphyclassifier.cgi）進(jìn)行RFLP圖譜分析。7.2.4結(jié)果判定巢式PCR檢測(cè)結(jié)果判定見表3。表3巢式PCR檢測(cè)結(jié)果判定簡(jiǎn)表判定條件第二輪PCR產(chǎn)物在1.2kb處是否有條帶出現(xiàn)（見圖B.1）譜分析結(jié)果與檳榔黃化病檢測(cè)樣品含黃化病植原體檢測(cè)樣品不含黃化病植原體檢測(cè)結(jié)果無效，重新進(jìn)行巢式PCR檢測(cè)。下述反應(yīng)均需同時(shí)設(shè)植原體16SrDNA質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，設(shè)經(jīng)確認(rèn)的健康檳榔植株葉片作為陰性對(duì)照，設(shè)滅菌雙蒸水作為為空白對(duì)照。7.3.1檳榔黃化病植原體引物/探針引物和探針序列見表4。3DB46/T220—2012表4實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)用引物/探針序列引物/探針名稱PbLF引物/探針序列5’-3’GCGAAGGCGGCTTGCTTTTGCTCCCCACGCTTTCPbLRbFprobeFAM-CTTTACTGACGCTGAGGCA-MGBNFQ（FAM指熒光報(bào)告基團(tuán)，MGB指小溝結(jié)合物，NFQ指非熒光淬滅基團(tuán)）7.3.2實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系、反應(yīng)條件實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系見表5。表5實(shí)時(shí)熒光PCR的反應(yīng)體系組分終濃度或體積12.5μL650nM650nM230nM1μLTaqMan○RUniversalRCRMasterMix上游引物PbLF下游引物PbLR熒光探針bFprobe模板DNA補(bǔ)滅菌雙蒸水至最終反應(yīng)體系25μL實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件：50℃2min；95℃10min；94℃15s，60℃1min，40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的判定見表6。表6實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的判定簡(jiǎn)表檢測(cè)樣品含黃化病植原體。重新進(jìn)行檢測(cè)，若Ct值仍介于35和40之間，檢測(cè)樣品含黃化病植原體。檢測(cè)樣品不含黃化病植原體。檢測(cè)結(jié)果無效，重新進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)。4DB46/T220—2012AA附錄A（規(guī)范性附錄）巢式PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)試劑和緩沖液配制除非另有說明，在分析中僅使用分析純?cè)噭?shí)驗(yàn)室用水均為去離子水，按GB/T6682-2008的有關(guān)規(guī)定。A.1化學(xué)試劑十六烷基三甲基溴化銨、三羥基氨基甲烷、十二烷基肌氨酸鈉、二水乙二胺四乙酸二鈉、苯酚、氯仿、三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙醇、瓊脂糖、溴化乙錠。A.2分子生物學(xué)試劑TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液、dNTP液（2.5mmol/LdATP,dTTP,dCTP,dGTP)、TaqManR○UniversalRCRMasterMix、DNA分子量標(biāo)記。A.3緩沖液稱量121.1gTris置于1L燒杯中，加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至8.0，將溶液定容至1L,高溫高壓滅菌后，室溫保存。稱取186.1gNa2?EDTA?2H2O，置于1L燒杯中，加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢?，用NaOH調(diào)節(jié)A.3.3DNA抽提緩沖液量取1MTris-HCl（pH8.0）10ml，0.5MEDTA20ml，置于100ml燒杯中，充分混勻，再加入1.461gNaCl，充分?jǐn)嚢?，用去離子水將溶液定容至100ml，高溫高壓滅菌后，室溫保存。使用前每毫升提取緩沖液中加入100μg蛋白酶K。稱取4.1gNaCl置于100ml燒杯中，加入約80ml的去離子水，充分?jǐn)嚢?，然后緩慢加?0gCTAB，同時(shí)加熱并攪拌，用去離子水將溶液定容至100ml，高溫高壓滅菌，室溫保存。量取1MTris·Cl（pH8.0）1ml和0.5MEDTA（pH8.0）200μl依次加入100ml燒杯中，向燒杯中加入約80ml的去離子水，均勻混合，將溶液定容至100ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存。A.3.6TAE電泳緩沖液（50×）（pH約8.5）5DB46/T220—2012稱取Tris242g和Na2EDTA·2H2O37.2g置于1L燒杯中，向燒杯中加入約800ml的去離子水，充分?jǐn)嚢枞芙?，再向燒杯中加?7.1ml的CH3COOH，充分?jǐn)嚢瑁尤ルx子水將溶液定容至1L，室溫保存。6DB46/T220—2012BB附錄B（資料性附錄）檳榔黃化病植原體巢式PCR電泳圖、16SrDNA序列指紋圖譜和實(shí)時(shí)熒光