5.水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中甲霜靈及其代謝物的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法

Q/LB.□XXXXX-XXXXDB43/TXXXX—2025目次TOC\o"1-1"\h前言 II1范圍 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語和定義 14方法原理 15試劑與材料 16儀器與設(shè)備 27樣品 28測(cè)定步驟 39結(jié)果計(jì)算和表述 510檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度 5附錄A（資料性）甲霜靈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖 7前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本文件由湖南省農(nóng)業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)歸口。本文件起草單位：湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)測(cè)試中心（長(zhǎng)沙）、澧縣農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心。本文件主要起草人：萬譯文、楊霄、何詠、雷琴、李小玲、崔先鋒、尹升福、索紋紋、陳湘藝、曾春芳、劉伶俐、黃華偉、謝玉昆、洪波。 水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中甲霜靈及其代謝物的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法范圍本文件描述了水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中甲霜靈及其代謝物的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定方法。本文件適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境（水體、底泥）中甲霜靈及其代謝物的測(cè)定。規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB17378.5海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范第5部分：沉積物分析SC/T9102.3漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)規(guī)范第3部分：淡水術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。方法原理水樣經(jīng)二氯甲烷提取，N-丙基乙二胺凈化；底泥樣品冷凍干燥，經(jīng)1%甲酸-乙酸乙酯提取，采用混合型強(qiáng)陰離子交換固相萃取小柱富集與凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。試劑與材料試劑水：GB/T6682規(guī)定的一級(jí)水。乙腈（CH3CN）：色譜純。二氯甲烷（CH2Cl2）：分析純。乙酸乙酯（CH3COOC2H5）：色譜純。甲酸（HCOOH）：色譜純。氨水（NH3?H2O）：分析純，濃度為25%～28%。溶液配制1%甲酸-二氯甲烷溶液：移取10mL甲酸，加入990mL二氯甲烷中，混勻。1%甲酸-乙酸乙酯溶液：移取10mL甲酸，加入990mL乙酸乙酯中，混勻。1%氨水溶液：移取10mL氨水，加入990mL實(shí)驗(yàn)用水中，混勻。5%甲酸-乙腈溶液：移取25mL甲酸，加入475mL乙腈中，混勻。20%乙腈溶液：移取20mL乙腈，加入80mL實(shí)驗(yàn)用水，混勻。0.1%甲酸溶液：移取1mL甲酸，加入實(shí)驗(yàn)用水，定容至1000mL，混勻。標(biāo)準(zhǔn)品甲霜靈（Metalaxyl,C15H21N4O,CAS號(hào)：57837-19-1）。甲霜靈酸（Metalaxylacid,C14H19N4O2,CAS號(hào)：87764-37-2）。氘代甲霜靈（Metalaxyl-D6,C9H21C136N4O,CAS號(hào)：65854-76-4）。溶液配制混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（100μg/mL）：稱取甲霜靈、甲霜靈酸標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，精密稱定，用乙腈溶解并定容于100mL棕色容量瓶，配制成濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月。內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液（100μg/mL）：稱取甲霜靈-D6標(biāo)準(zhǔn)品各10mg，精密稱定，用乙腈溶解并定容于100mL棕色容量瓶，配制成濃度為100μg/mL的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于-18℃以下避光保存，有效期6個(gè)月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)中間液（10.0μg/mL）：準(zhǔn)確移取1mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，混勻，于-18℃以下避光保存，有效期1個(gè)月。內(nèi)標(biāo)中間液（10.0μg/mL）：準(zhǔn)確移取1mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，于10mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，混勻，于-18℃以下避光保存，有效期1個(gè)月?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)使用液（0.10μg/mL）：準(zhǔn)確移取1mL標(biāo)準(zhǔn)中間液于100mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，混勻，于4℃以下避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。內(nèi)標(biāo)使用液（0.10μg/mL）：準(zhǔn)確移取1mL內(nèi)標(biāo)中間液于100mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，混勻，于4℃以下避光保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。材料混合型強(qiáng)陰離子交換固相萃取小柱：150mg/6mL，或者相當(dāng)者。聚四氟乙烯濾膜：0.22μm。玻璃纖維濾膜：0.45μm。N-丙基乙二胺：40μm～60μm粒徑范圍，100?平均孔徑。儀器與設(shè)備液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：配有電噴霧離子源。分析天平：感量0.01g和0.00001g。冷凍干燥機(jī)。渦旋混合器。高速離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于8000r/min。超聲波清洗器。固相萃取裝置，帶真空泵。氮吹儀。樣品樣品采集水樣和底泥樣品按照SC/T9102.3規(guī)定的方法進(jìn)行采集。試樣制備水樣采樣量應(yīng)不少于1L，經(jīng)0.45μm玻璃纖維濾膜過濾，置于棕色樣品瓶中，0℃～4℃避光保存，一周內(nèi)完成分析。底泥樣品采樣量應(yīng)不少于500g，于-20℃預(yù)冷凍24h，經(jīng)冷凍干燥機(jī)（-50℃，真空度<20Pa，冷凍干燥10h）凍干，剔除石塊和植物體等異物，用研缽研磨后過孔徑100目網(wǎng)篩，置于棕色樣品瓶中，0℃～4℃避光保存，一個(gè)月內(nèi)完成分析。測(cè)定步驟提取水準(zhǔn)確移取100mL水樣，置于分液漏斗中，加入20mL1%甲酸-二氯甲烷，再加入100μL內(nèi)標(biāo)使用液，震蕩提取5min，靜置分層，收集下層清液于雞心瓶中。加入20mL1%甲酸-二氯甲烷，重復(fù)提取一次。合并提取液，45℃旋蒸至近干，加入1mL20%乙腈溶液溶解，溶液轉(zhuǎn)移至2mL離心管，加入100mgN-丙基乙二胺，渦旋混合1min，于4℃10000r/min離心10min，取上清液過0.22μm有機(jī)相微孔濾膜，供液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。底泥準(zhǔn)確稱取制備的底泥樣品2g（精確至0.01g），置于50mL離心管中，加入100μL內(nèi)標(biāo)使用液和5mL水，渦旋混合1min，靜置30min，然后加入15mL1%甲酸-乙酸乙酯溶液渦旋混合2min，超聲提取10min，于4℃4000r/min離心5min，取上清液。殘?jiān)尤?0mL1%甲酸-乙酸乙酯溶液，重復(fù)提取一次。合并提取液，45oC氮?dú)獯蹈?，加?mL乙腈和250μL氨水，渦旋混合2min，備用。用5mL乙腈和5mL1%氨水溶液預(yù)活化固相萃取小柱。取備用液過柱，保持柱流速小于1.5mL/min，再用5mL1%氨水溶液和5mL乙腈淋洗，棄去流出液，用4mL5%甲酸-乙腈溶液洗脫，收集洗脫液，于45oC氮?dú)獯抵两桑尤?mL20%乙腈溶液溶解，過0.22μm有機(jī)相微孔濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。底泥含水率測(cè)定按照GB17378.5規(guī)定的方法進(jìn)行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線制備分別移取標(biāo)準(zhǔn)使用液和內(nèi)標(biāo)使用液，用乙腈配制成甲霜靈及其代謝物的濃度為0.50μg/L、1.00μg/L、5.00μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L，氘代甲霜靈濃度為10.0μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。以待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)物特征離子質(zhì)量色譜峰峰面積比值為縱坐標(biāo)、對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。測(cè)定液相色譜參考條件液相色譜參考條件如下：色譜柱：C18(100mm×2.1mm，粒徑2.6μm)，或相當(dāng)者；流動(dòng)相：A為乙腈，B為0.1%甲酸-水溶液。梯度洗脫條件見表1；進(jìn)樣量：5μL；流速：0.3mL/min；柱溫：40℃。流動(dòng)相梯度洗脫條件時(shí)間minA%B%05.095.01.295.05.02.095.05.02.15.095.04.05.095.0質(zhì)譜參考條件質(zhì)譜參考條件如下：離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）；噴霧電壓：5.5kV。脫溶劑氣溫度：550℃；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量見表2。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、去簇電壓和碰撞能量化合物名稱母離子m/z子離子m/z去簇電壓V碰撞能量eV甲霜靈280.2220.1a10015192.110020甲霜靈酸266.1220.1a10016192.110020氘代甲霜靈286.2198.210022a為定量離子。定性測(cè)定在相同測(cè)試條件下，試樣中待測(cè)物的保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液中待測(cè)物的保留時(shí)間一致，偏差在±2.5%以內(nèi)，且試樣中待測(cè)物定性離子的相對(duì)豐度與濃度相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)應(yīng)的定性離子的相對(duì)豐度一致。其允許偏差應(yīng)符合表3的要求。定性確證時(shí)相對(duì)離子豐度的最大允許偏差相對(duì)離子豐度，%＞50＞20～50＞10～20≤10允許的相對(duì)偏差，%±20±25±30±50定量測(cè)定按8.5.1和8.5.2設(shè)定儀器條件，取標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、試樣溶液、空白試樣溶液等體積進(jìn)樣測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法定量。標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和試樣溶液中目標(biāo)物的響應(yīng)值均應(yīng)在儀器檢測(cè)線性范圍內(nèi)。甲霜靈及其代謝物標(biāo)準(zhǔn)溶液特征離子質(zhì)量色譜圖參見附錄A?？瞻讓?shí)驗(yàn)按照8.1～8.4相同的測(cè)定步驟進(jìn)行空白試樣（見7.3）的測(cè)定。結(jié)果計(jì)算和表述水樣中甲霜靈及其代謝物含量水樣中甲霜靈及其代謝物含量按式（1）計(jì)算。計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值，保留2位有效數(shù)字。 X1=Ci×VV式中：X1——試樣中甲霜靈及其代謝物的含量，單位為微克每升（μg/L）；Ci——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的待測(cè)物溶液濃度，單位為微克每升（μg/L）；V——試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；V0——試樣體積，單位為毫升（mL）。底泥中甲霜靈及其代謝物含量底泥中甲霜靈及其代謝物含量按式（2）計(jì)算。計(jì)算結(jié)果應(yīng)扣除空白值，保留2位有效數(shù)字。 X2=Ci×Vm×(1?w)式中：X2——試樣中甲霜靈及其代謝物的含量，單位為微克每千克（μg/kg）；Ci——從標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得到的待測(cè)物溶液濃度，單位為微克每升（μg/L）；V——試樣最終定容體積，單位為毫升（mL）；m——試樣質(zhì)量，單位為克（g）；w——試樣含水率，單位為質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%）檢測(cè)方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度靈敏度本方法在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境水中甲霜靈及其代謝物的檢出限為0.05μg/L，定量限為0.1μg/L；在水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境底泥中甲霜靈及其代謝物的檢出限