犬流感病毒的生物學特性研究

犬流感病毒的生物學特性研究陳堅曹穗蘭指導老師：賀東生華南農業(yè)大學獸醫(yī)學院摘要：從廣州市各寵物醫(yī)院采集得患病犬只的鼻咽拭子樣本，經SPF雞胚培養(yǎng)分離鑒定，分離出3株疑似犬流感病毒，陽性分離株第三代血凝活性均達128：1以上，而且均不被新城疫陽性血清所凝集，與H3和H9亞型標準血清血凝抑制價為8：1，與H5型標準血清血凝抑制價為256：1，進行紅細胞凝集譜測定，其中兩株病毒只能凝集雞的血球和狗的血球；一株除了可以凝集雞、狗的血球以外，還可以凝集貓，牛，兔的血球。關鍵詞:犬流感病毒;分離鑒定；生物學特性流感病毒屬分節(jié)段負股RNA病毒，屬正黏病毒科，分為A、B、C三型，A型流感病毒可以感染禽、豬、馬等多種動物和人，B型流感病毒僅感染人，C型流感病毒感染人和豬，其中C型流感病毒感染極少引起嚴重疾病，A型禽流感病毒不但感染禽、豬等多種動物和人，還可以感染豬，犬貓等小動物。多種研究證實：流感病毒中控制N和H的基因可以發(fā)生重組，各種流感病毒之間有著密切的聯(lián)系，可在特定的動物宿主中重組成新的變異毒株，并引發(fā)跨物種傳播，進而感染人類，威脅人類的生命安全，而在當前，犬作為一種常見的家養(yǎng)寵物，與人類的接觸十分的密切，故而，對犬流感病毒的研究極具意義。目前，國外對犬流感病毒的研究已經較為成熟，但國內對犬流感病毒的研究卻非常少，病毒分離非常困難，分離率很低，從而極大地影響了對流感病毒進一步的科學研究。針對這種情況，我們在前期創(chuàng)新研究犬流感分離工作的基礎上，繼續(xù)進行犬流感病毒的分離鑒定工作，并對其進行血清型鑒定、紅細胞凝集譜等生物學特性的研究，現(xiàn)報告如下。材料準備樣品采集疑似流感發(fā)病犬只樣品的采集：2005年4月－2006年3月，從廣州的部分寵物醫(yī)院對疑似犬流感病例進行鼻咽拭子的采集，早期的采集對象以出現(xiàn)呼吸道癥狀的犬只為主，后期根據國外對犬流感的報道研究，針對具有典型流感癥狀的犬只進行采樣，主要判斷治標為：呼吸道癥狀，低燒，流涕，抗生素治療無效等。先后采集鼻咽拭子一共份，采得的拭子放入含2500單位/ml雙抗保存液中，放4℃病料處理樣品取其上清液，按每毫升1000單位的含量加入青鏈霉素，進行無菌處理，放于4℃1.310×PBS液的制備氯化鈉8.5g，磷酸二氫甲0.68g，氫氧化鈉0.15g，溶於100ml水中高壓滅菌，十倍稀釋。1.4阿氏液制備葡萄糖20.5g，氯化鈉4.2g，檸檬酸鈉8.0g，檸檬酸0.55g，加于100水中，115℃，15min高壓滅菌，調節(jié)PH值至6.8～7.2之間，41.5標準陽性血清和抗原流感病毒H5、H7、H9標準陽性血清和雞新城疫(ND)標準陽性血清由華南農業(yè)大學傳染病研究室提供。1.6SPF雞胚由廣東永順生物制品廠SPF種禽飼養(yǎng)室提供。1.71%雞紅細胞、牛紅細胞、兔紅細胞、犬紅細胞、貓紅細胞由華南農業(yè)大學傳染病實驗室提供。所有紅細胞用PBS洗3遍，前兩次用1500rpm離心兩次，每次5分鐘，最后一次用2000rpm離心10分鐘，將離心得的紅細胞一毫升加入100ml阿氏液中，配成l%懸液，置4℃方法2.1病毒分離采用雞胚接種絨毛尿囊腔接種分離的方法2.119－11日齡SPF雞胚，由廣東永順生物制品廠提供的SPF種蛋孵化。取上述制備的樣品上清液，經絨毛尿囊腔接種，每個樣品接種一個胚，0.2ml/胚，置37℃2.12孵育2－4天，每天照胚2次，收留死胚，細菌檢查為陰性后轉放入4℃2.13采集雞胚的絨毛尿囊液進行血球凝集(HA)試驗，若出現(xiàn)血凝活性，則繼續(xù)傳代并測定血凝價。若血凝價為陰性，則轉入－20℃2.14將首次收取的HA未有血凝活性的雞胚尿囊液與其它首次接種收胚后不表現(xiàn)血凝活性的樣品收得的尿囊液得進行隨機分組，每5個樣品尿囊液一組，將同一組的尿囊液每個取0.4ml混合，震蕩，再次接種雞胚傳代，方法同上。2.15收取的尿囊液再做HA血球凝集實驗，結果仍為陰性者則棄去，如為陽性，則將組內的各個樣本分別接種雞胚繼續(xù)傳代，直到分離得陽性毒株，并測定其血凝價。2.16凡病毒分離陽性者均置于－20℃冰箱內保2.2病毒鑒定2.21紅細胞凝集(HA)試驗將上述各傳代雞胚尿囊液按常規(guī)進行血凝性和血凝價測定。2.22與新城疫陽性血清進行HI試驗，以排除新城疫病毒的可能性。2.23血凝素亞型鑒定分別用H5、H7、H9、ND血清和Hg標準陽性血清與陽性分離株的尿囊液進行HI試驗。2.24紅細胞凝集譜的測定分別采用雞、牛、兔、犬、貓的1％紅細胞懸液對上述各傳代雞胚尿囊液進行血凝性和血凝價的測定。3結果3.1病毒的分離及鑒定3.1.1病毒的分離及初步鑒定:本次試驗通過采用將樣品接種于SPF雞胚，收集其尿囊液進行血凝活性檢測的方法，結果發(fā)現(xiàn)有3份樣品的雞胚尿囊液對雞紅血球有血凝活性，經雞胚傳代表1－1HA孔號毒株123456789101112014F3####++++++－－－－－028F3######+++++++－－－100F5#######++++++++－－014第3代病毒液HA價達7孔，滴度為1：128；028第三代病毒液HA值達9孔，滴度為1：512；100第5代病毒液HA值高達10孔，滴度為1:1042。表1－2抗NDV陽性血清HI試驗孔號毒株編號123456789101112014－－－－－－－－－－－－028－－－－－－－－－－－－100－－－－－－－－－－－－陽性對照######+++－－－－這3株病毒與抗NDV陽性血清的HI試驗為均陰性。故而，初步鑒定這3份樣品分離物為流感病毒。3.1.2病毒亞型的鑒定表2－1H5亞型鑒定結果孔號毒株編號123456789101112014#####+－－－－－028#####+++++++－－－－100#####+++++－－－－014號毒株與H5的血凝抑制價為64:1；028與100的H5血凝抑制價為256:1；表2－1H7亞型鑒定結果孔號毒株編號123456789101112014##++－－－－－－－－－028##++－－－－－－－－－100－－－－－－－－－－－－014號毒株和028號毒株與H7的血凝抑制價為8:1；100的H7血凝抑制價為；表2－1H9亞型鑒定結果孔號毒株編號123456789101112014##++－－－－－－－－－028##－－－－－－－－－－100－－－－－－－－－－－－014號毒株與H9的血凝抑制價為8:1；028的H9血凝抑制價為4：1；100不能和H9血清的產生凝集抑制。3.13病毒紅細胞凝集譜測定結果雞紅細胞凝集結果如表1所示表3－1牛紅細胞凝集測定結果孔號毒株123456789101112014F3－－－－－－－－－－－－028F3－－－－－－－－－－－－100F5#######＋＋＋＋＋－－－014、028第3代病毒液不能凝集牛的紅細胞；100第5代病毒液與牛的紅細胞凝集，HA值達9孔，滴度為1:512。表3－2狗紅細胞凝集譜測定結果孔號毒株123456789101112014F3####＋＋＋＋＋＋－－－－－028F3######＋＋＋＋＋＋－－－100F5#######＋＋＋＋＋＋＋－－3株病毒均能與狗的紅血球凝集，014第3代病毒液HA價達7孔，滴度為1：128；028第三代病毒液HA值達9孔，滴度為1：512；100第5代病毒液HA值高達10孔，滴度為1:1042表3－3貓紅細胞凝集譜測定結果孔號毒株123456789101112014F3－－－－－－－－－－－－028F3－－－－－－－－－－－－100F5#######＋＋＋＋＋＋＋－－014、028第3代病毒液不能凝集貓的紅細胞；100第5代病毒液能與貓的紅細胞凝集，HA值達10孔，滴度為1:1024。表3－4兔紅細胞凝集譜測定結果孔號毒株123456789101112014F3－－－－－－－－－－－－028F3－－－－－－－－－－－－100F5#######＋＋＋＋＋＋＋－－014、028第3代病毒液不能凝集兔的紅細胞；100第5代病毒液能與兔的紅細胞凝集，HA值達10孔，滴度為1:1024。表3－5凝集時間（min）T＝37毒株編號雞紅細胞牛紅細胞狗紅細胞貓紅細胞兔紅細胞01420－50－－02820－50－－10020305050120雞的紅細胞在20分鐘時即被凝集，牛的紅細胞需30分鐘，狗和貓的紅細胞需要50分鐘，兔的紅細胞需要兩個小時才可觀察到凝集效果。3小結和討論3.1HA、HI試驗發(fā)現(xiàn)本次創(chuàng)新研究分離出的3株病毒，各種反應結果呈疑似流感病毒的特性，初步斷定為犬流感病毒。3.205年以來，大規(guī)模爆發(fā)的禽流感席卷全球，已經引起了世界性的恐慌。據最近報道：泰國、德國等國家相繼出現(xiàn)貓感染禽流感事件；美國迄今為止雖然沒有發(fā)現(xiàn)禽流感，但已經從犬中同樣分離到了流感病毒。經研究表明，犬流感病毒是由血清型為H3N8的馬流感病毒變異而來，變異速度十分驚人，并且該病毒在狗與狗之間傳播非常迅速，其傳播形式與人流感及其類似，雖然目前還未見犬流感感染人的報道，但流感病毒及容易發(fā)生基因變異和重組，并可能跨物種傳播，進而感染人類，危害人類的生命安全，根據之前禽流感病毒變異導致亞洲至少60人死亡的先例，本次犬流感病毒應當引起足夠的重視。而本次分離得的流感毒株在H5血清型上有比較高的血凝抑制價，極具進一步研究的價值。3.3目前，在國外，犬流感病毒引起的呼吸道疾病在臨床癥狀上已經有了基本的診斷標準，但是在國內還沒有引起充分的重視，容易與其它呼吸道疾病混淆，本研究對分離株的部分生物學特性進行了部分的測定和探索，其毒力和致病性尚需要進一步研究。3.4本次試驗采用血清學、生物特性等方法初步證實了我國犬流感病毒的存在，為其的下一步研究打下了堅實的基礎。從發(fā)病犬分離出流感病毒的數量和比例，也提示在我國寵物犬已開始受到流感病毒的威脅，因此，對于目前寵物熱的日趨高漲和人類自身的安全以及其對公共衛(wèi)生安全的影響來說，今后應當引起人們的重視。參考文獻：[1]郭元吉，程小雯.流行性感冒病毒及其實驗技術[M].北京:中國三峽出版社，1997:94.[2]傅繼