IGFBP-6：缺氧誘導(dǎo)性血管生成的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子研究

IGFBP-6：缺氧誘導(dǎo)性血管生成的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子研究一、引言1.1研究背景氧是多數(shù)生物體賴以生存的代謝原料，在物種生存的自然環(huán)境中，缺氧是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象。為了適應(yīng)缺氧環(huán)境，生物體進(jìn)化出了一系列感知并應(yīng)激環(huán)境缺氧的機(jī)制，血管生成便是其中一種重要的適應(yīng)性反應(yīng)。缺氧誘導(dǎo)性血管生成在生物體的生理和病理過(guò)程中都扮演著舉足輕重的角色。在生理狀態(tài)下，胚胎發(fā)育過(guò)程中需要通過(guò)血管生成來(lái)構(gòu)建完善的血管網(wǎng)絡(luò)，為胚胎的生長(zhǎng)和發(fā)育提供充足的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。若這一過(guò)程中血管生成異常，可能導(dǎo)致胚胎發(fā)育畸形甚至死亡。在傷口愈合時(shí)，缺氧環(huán)境會(huì)刺激血管生成，新生血管為傷口部位輸送免疫細(xì)胞、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)組織修復(fù)，加速傷口愈合。而在病理?xiàng)l件下，腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移高度依賴于血管生成。腫瘤細(xì)胞快速增殖會(huì)造成局部缺氧，進(jìn)而誘導(dǎo)血管生成，為腫瘤細(xì)胞提供養(yǎng)分，支持腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。若能有效抑制腫瘤血管生成，就有望切斷腫瘤的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，抑制腫瘤發(fā)展。在缺血性疾病，如心肌梗死、腦卒中和外周動(dòng)脈疾病中，缺氧誘導(dǎo)的血管生成是機(jī)體試圖恢復(fù)組織血供的一種代償機(jī)制。然而，這種代償性血管生成往往不足以完全恢復(fù)缺血組織的正常血供，且血管生成過(guò)程可能受到多種因素干擾，導(dǎo)致血管生成異常，影響疾病的治療和預(yù)后。目前，對(duì)于缺氧誘導(dǎo)性血管生成的研究已取得了顯著進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）在這一過(guò)程中起著核心調(diào)控作用。在缺氧條件下，HIF-α亞基穩(wěn)定表達(dá)并與HIF-β亞基結(jié)合形成異源二聚體，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，激活一系列靶基因的轉(zhuǎn)錄，其中包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等重要的促血管生成因子。VEGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和管腔形成，直接推動(dòng)血管生成。除了HIF-VEGF通路，還有其他信號(hào)通路和調(diào)節(jié)因子也參與了缺氧誘導(dǎo)性血管生成的調(diào)控，如Notch信號(hào)通路、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）等，它們相互作用，形成了一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6（IGFBP-6）作為胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）系統(tǒng)的重要成員，近年來(lái)逐漸受到關(guān)注。IGF系統(tǒng)在組織細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育及腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要的調(diào)節(jié)作用，且已有大量研究證實(shí)其參與血管生成的調(diào)控過(guò)程。IGFBP-6是IGF-II的高親和力結(jié)合蛋白，對(duì)IGF-II活性具有重要的調(diào)節(jié)作用，其不僅可以對(duì)IGF-II進(jìn)行負(fù)向調(diào)節(jié)，還能夠通過(guò)直接調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程來(lái)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)化。雖然IGFBP-6在多種生理和病理過(guò)程中的作用逐漸被揭示，如在腫瘤中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)化的作用，同時(shí)也有研究發(fā)現(xiàn)其可能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和侵襲，但在缺氧誘導(dǎo)性血管生成領(lǐng)域，IGFBP-6的研究還存在諸多空白。目前尚不清楚IGFBP-6在缺氧誘導(dǎo)的血管生成過(guò)程中是否發(fā)揮作用，以及通過(guò)何種機(jī)制參與其中。填補(bǔ)這一研究空白，深入探討IGFBP-6對(duì)缺氧誘導(dǎo)性血管生成的作用，對(duì)于全面理解缺氧誘導(dǎo)性血管生成的調(diào)控機(jī)制具有重要的科學(xué)意義，也有望為相關(guān)疾病，如腫瘤、缺血性疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和治療策略，具有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探討IGFBP-6對(duì)缺氧誘導(dǎo)性血管生成的作用及分子機(jī)制。具體而言，通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型，明確IGFBP-6在缺氧環(huán)境下對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、管腔形成等血管生成相關(guān)生物學(xué)行為的影響；解析IGFBP-6參與缺氧誘導(dǎo)性血管生成調(diào)控的信號(hào)通路，揭示其作用的分子機(jī)制；驗(yàn)證IGFBP-6在體內(nèi)對(duì)腫瘤血管生成和缺血組織血管生成的影響，評(píng)估其作為治療靶點(diǎn)的潛在價(jià)值。本研究具有重要的理論意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。從理論層面看，目前對(duì)于缺氧誘導(dǎo)性血管生成的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制研究相對(duì)較少，IGFBP-6作為胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)的成員，其在這一過(guò)程中的作用尚不清楚。本研究有望揭示IGFBP-6在缺氧誘導(dǎo)性血管生成中的新功能和作用機(jī)制，豐富對(duì)血管生成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)，為深入理解生物體應(yīng)對(duì)缺氧環(huán)境的生理和病理機(jī)制提供新的視角和理論依據(jù)。在臨床應(yīng)用方面，腫瘤和缺血性疾病嚴(yán)重威脅人類健康。腫瘤血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，抑制腫瘤血管生成已成為腫瘤治療的重要策略之一。缺血性疾病如心肌梗死、腦卒中和外周動(dòng)脈疾病等，由于血管生成不足導(dǎo)致組織缺血、缺氧，嚴(yán)重影響器官功能。若能明確IGFBP-6對(duì)缺氧誘導(dǎo)性血管生成的作用，有望將其開(kāi)發(fā)為治療腫瘤和缺血性疾病的新靶點(diǎn)。對(duì)于腫瘤治療，可以通過(guò)抑制IGFBP-6的功能或調(diào)節(jié)其相關(guān)信號(hào)通路，增強(qiáng)腫瘤血管生成的抑制效果，提高腫瘤治療的療效；對(duì)于缺血性疾病，可探索利用IGFBP-6促進(jìn)缺血組織的血管生成，改善組織血供，為缺血性疾病的治療提供新的思路和方法，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。二、缺氧誘導(dǎo)性血管生成機(jī)制概述2.1缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）的激活缺氧誘導(dǎo)因子（Hypoxia-InducibleFactor，HIF）是一類在細(xì)胞低氧條件下表達(dá)增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧誘導(dǎo)性血管生成中發(fā)揮著核心作用。HIF是由一個(gè)氧敏感的α亞單位（HIF-α）和一個(gè)組成性表達(dá)的β亞單位（HIF-β，也稱為芳香烴受體核轉(zhuǎn)位蛋白，ARNT）組成的異源二聚體。HIF-α亞單位對(duì)調(diào)節(jié)HIF的轉(zhuǎn)錄活性至關(guān)重要，目前已鑒定出三種亞型，即HIF-1α、HIF-2α和HIF-3α。這三種異構(gòu)體在N末端都含有一個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋和兩個(gè)Per-Arnt-Sim結(jié)構(gòu)域（bHLH-PAS），用于蛋白質(zhì)之間的相互作用和DNA結(jié)合；在C末端都含有氧依賴性降解結(jié)構(gòu)域（ODD），而只有HIF-1α和HIF-2α含有反式激活結(jié)構(gòu)域（TAD），可激活靶基因轉(zhuǎn)錄。三種HIF-α亞型根據(jù)組織和細(xì)胞的特異性具有不同的功能作用，HIF-1α在所有細(xì)胞類型中均有表達(dá)，HIF-2α最初被認(rèn)為僅在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，但近期研究表明其在血管內(nèi)皮細(xì)胞外也具有功能，HIF-3α缺乏反式激活結(jié)構(gòu)域，被認(rèn)為是一種抑制元件，其各種異構(gòu)體和剪接變體的功能作用還有待進(jìn)一步深入闡明。與對(duì)氧依賴性降解敏感的HIF-α不同，HIF-β在所有哺乳動(dòng)物細(xì)胞中結(jié)構(gòu)性表達(dá)，其表達(dá)水平與氧的可用性無(wú)關(guān)。在常氧條件下，HIF-α亞基的脯氨酸殘基（Pro402和Pro564，以HIF-1α為例）在脯氨酰羥化酶（ProlylHydroxylases，PHDs）的作用下發(fā)生羥基化修飾。PHD家族有三種亞型，即PHD1（也稱為EGLN2）、PHD2（也稱為EGLN1）和PHD3（也稱為EGLN3），其中PHD1和PHD2可促進(jìn)HIF-1α上Pro402和Pro564的羥基化，PHD3僅羥基化Pro564。羥基化過(guò)程高度依賴于氧分子、α-酮戊二酸作為底物以及鐵離子作為催化劑的可用性。羥基化修飾后的HIF-α能夠與vonHippel–Lindau蛋白（pVHL）結(jié)合，進(jìn)而被延伸蛋白B、延伸蛋白C、cullin2（CUL2）、環(huán)盒蛋白1（RBX1）和E3泛素連接酶形成的復(fù)合物泛素化，最終被蛋白酶體識(shí)別并降解，使得細(xì)胞內(nèi)HIF-α維持在較低水平。而在缺氧條件下，由于氧含量不足，PHDs的活性受到抑制，HIF-α的脯氨酸殘基無(wú)法被羥基化修飾，從而避免了與pVHL的結(jié)合以及后續(xù)的泛素化和蛋白酶體降解過(guò)程。穩(wěn)定積累的HIF-α迅速與HIF-β結(jié)合形成異源二聚體，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，HIF異源二聚體與位于靶基因啟動(dòng)子區(qū)的缺氧反應(yīng)元件（HypoxiaResponseElement，HRE）結(jié)合，同時(shí)募集輔因子p300和CBP，形成具有轉(zhuǎn)錄活性的復(fù)合物，從而激活一系列與缺氧適應(yīng)相關(guān)的靶基因轉(zhuǎn)錄，其中就包括眾多參與血管生成的關(guān)鍵基因，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（Platelet-DerivedGrowthFactor，PDGF）等，這些基因的表達(dá)產(chǎn)物共同促進(jìn)血管生成，以改善組織的氧氣供應(yīng)，維持細(xì)胞的正常生理功能。2.2血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)上調(diào)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF），又稱血管通透因子（VascularPermeabilityFactor，VPF）或血管調(diào)理素（vasculotropin），是一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子。VEGF家族包括7個(gè)成員，分別為VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和胎盤生長(zhǎng)因子（PLGF）。在人體中，可表達(dá)VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及PLGF，其中VEGF-A發(fā)現(xiàn)最早，在組織和細(xì)胞中含量最豐富，在血管發(fā)生、血管生成、原始內(nèi)皮細(xì)胞分化過(guò)程中起到關(guān)鍵性作用，故通常所說(shuō)的VEGF一般指的就是VEGF-A。人的VEGF基因位于6號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶（6p2l），基因全長(zhǎng)28Kb，編碼基因長(zhǎng)14Kb，由8個(gè)外顯子及7個(gè)內(nèi)含子構(gòu)成。編碼產(chǎn)物為同源二聚體糖蛋白，等電點(diǎn)為8.5，有很強(qiáng)的耐熱和耐酸能力。VEGF轉(zhuǎn)錄后，由于mRNA剪接方式的不同，可以形成VEGF-121、VEGF-145、VEGF-148、VEGF-165、VEGF-183、VEGF-189和VEGF-206等16種左右的VEGF變異體。VEGF功能上的差異主要取決于與肝素的不同結(jié)合力，VEGF-121缺乏VEGF基因外顯子6和7編碼的氨基酸，不會(huì)結(jié)合在肝磷脂或者細(xì)胞外基質(zhì)上，除VEGF-121外，所有VEGF均可與肝素結(jié)合。VEGF-121與VEGF-165為可溶性分泌蛋白，是主要效應(yīng)分子，均以旁分泌形式介導(dǎo)特異性內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂和增加血管通透性，其中體內(nèi)VEGF-165表達(dá)最豐富，VEGF-121在血管生長(zhǎng)中起主導(dǎo)作用。在缺氧條件下，VEGF的表達(dá)會(huì)顯著上調(diào)。其主要的調(diào)控機(jī)制與缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）密切相關(guān)。如前文所述，缺氧時(shí)HIF-α亞基穩(wěn)定積累并與HIF-β亞基形成異源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核，與VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，從而啟動(dòng)VEGF基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程，使得VEGFmRNA的合成增加。此外，缺氧還能夠使得一種核內(nèi)核糖蛋白與VEGFmRNA非翻譯區(qū)的富含Au元件形成RNA-蛋白復(fù)合物，可顯著延長(zhǎng)VEGFmRNA在體內(nèi)的半衰期，從而間接提高VEGF的表達(dá)水平。除了HIF依賴的調(diào)控途徑外，一些其他的信號(hào)通路和轉(zhuǎn)錄因子也參與了缺氧對(duì)VEGF表達(dá)的調(diào)節(jié)。例如，蛋白激酶C、雌激素、腺苷酸環(huán)化酶激活劑、雙氧水、紫外線等均可誘導(dǎo)VEGF的產(chǎn)生。多種細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、前列腺素E等，在缺氧環(huán)境下也能使VEGF及其受體表達(dá)上調(diào)，提高其生物學(xué)活性。上調(diào)表達(dá)的VEGF在缺氧誘導(dǎo)性血管生成中發(fā)揮著核心作用，主要通過(guò)以下多種機(jī)制促進(jìn)血管生成。VEGF可以特異性地與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體結(jié)合，VEGF有三種跨膜受體，分別為VEGFR-1（Flt-1）、VEGFR-2（在人體中稱為KDR，小鼠中稱為Flk-1）、VEGFR-3（Flk-4）。VEGFR-2主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，VEGF與VEGFR-2結(jié)合后，能夠激活一系列下游信號(hào)通路，如磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路等，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，使血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量增加，為血管生成提供細(xì)胞基礎(chǔ)。VEGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。在內(nèi)皮細(xì)胞遷移過(guò)程中，VEGF與其受體結(jié)合后，通過(guò)激活相關(guān)信號(hào)分子，調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組和細(xì)胞黏附分子的表達(dá)，使得內(nèi)皮細(xì)胞能夠從原有的血管壁脫離，并向缺氧組織部位遷移，為新血管的形成延伸路徑。VEGF還可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞形成管腔結(jié)構(gòu)。在血管生成過(guò)程中，遷移到缺氧部位的內(nèi)皮細(xì)胞在VEGF等因子的作用下，逐漸聚集并排列成管狀結(jié)構(gòu)，這些管狀結(jié)構(gòu)進(jìn)一步融合、連接，最終形成具有完整功能的血管，實(shí)現(xiàn)對(duì)缺氧組織的血液供應(yīng)。VEGF能夠增加血管的通透性，使血漿蛋白滲出到細(xì)胞外基質(zhì)中，形成纖維蛋白凝膠，為內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和增殖提供臨時(shí)的基質(zhì)支架，同時(shí)也有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣向缺氧組織的輸送。2.3其他相關(guān)信號(hào)通路與因子除了HIF和VEGF這兩個(gè)關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因素外，還有許多其他信號(hào)通路與因子參與了缺氧誘導(dǎo)性血管生成過(guò)程，它們與HIF-VEGF通路相互協(xié)作或制衡，共同維持血管生成的平衡和穩(wěn)定。Notch信號(hào)通路在血管生成中起著重要的調(diào)節(jié)作用。Notch基因最早發(fā)現(xiàn)于果蠅，因其部分功能缺失會(huì)在果蠅翅膀邊緣出現(xiàn)缺口而得名。在哺乳動(dòng)物中，Notch信號(hào)通路包含4種Notch受體（Notch1-4）和5種配體（Delta-like1、3、4和Jagged1、2）。在缺氧誘導(dǎo)性血管生成過(guò)程中，Notch信號(hào)通路與VEGF信號(hào)通路存在密切的交互作用。VEGF可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中Notch配體Delta-like4（Dll4）的表達(dá)，Dll4與相鄰內(nèi)皮細(xì)胞表面的Notch受體結(jié)合，激活Notch信號(hào)。激活的Notch信號(hào)通過(guò)抑制一些促血管生成基因的表達(dá)，如血管生成素-2（Ang-2）等，來(lái)限制血管的過(guò)度生成，從而調(diào)控血管分支和血管網(wǎng)絡(luò)的形成，確保生成的血管具有合適的密度和結(jié)構(gòu)，以滿足組織的生理需求。研究表明，在腫瘤血管生成模型中，抑制Notch信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致血管過(guò)度生成且形態(tài)異常，這些異常血管的功能也存在缺陷，無(wú)法有效為腫瘤組織提供營(yíng)養(yǎng)，同時(shí)還可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。這說(shuō)明Notch信號(hào)通路對(duì)于維持正常的血管生成和腫瘤微環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FibroblastGrowthFactor，F(xiàn)GF）家族也是一類重要的促血管生成因子。FGF家族包含23個(gè)成員，其中堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF，也稱為FGF-2）在血管生成中的作用研究較為深入。bFGF廣泛存在于多種組織和細(xì)胞中，如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等。在缺氧條件下，細(xì)胞會(huì)分泌更多的bFGF。bFGF可以與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的特異性受體（FGFRs）結(jié)合，激活下游的Ras/Raf/MEK/ERK等信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化，從而誘導(dǎo)血管生成。bFGF還能夠促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解，為血管生成提供適宜的微環(huán)境，它可以刺激成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分，同時(shí)激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs），降解細(xì)胞外基質(zhì)，便于內(nèi)皮細(xì)胞的遷移和管腔形成。在缺血性疾病的動(dòng)物模型中，外源性給予bFGF可以促進(jìn)缺血組織的血管生成，改善組織的血液供應(yīng)，減輕組織損傷。血小板衍生生長(zhǎng)因子（Platelet-DerivedGrowthFactor，PDGF）在缺氧誘導(dǎo)性血管生成中也發(fā)揮著不可或缺的作用。PDGF家族由PDGF-A、B、C、D這4種不同的多肽鏈組成，通過(guò)不同的組合形成PDGF-AA、BB、AB、CC和DD這5種二聚體形式。PDGF主要由血小板、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞等分泌。在缺氧環(huán)境下，PDGF的表達(dá)上調(diào)。PDGF與其受體（PDGFRs）結(jié)合后，激活一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，如PI3K/Akt、MAPK等，這些信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移和存活。在血管生成過(guò)程中，PDGF可以刺激周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移，使其募集到新生血管周圍，與內(nèi)皮細(xì)胞相互作用，促進(jìn)血管的成熟和穩(wěn)定。研究發(fā)現(xiàn)，在腫瘤血管生成過(guò)程中，PDGF介導(dǎo)的周細(xì)胞募集對(duì)于維持腫瘤血管的穩(wěn)定性至關(guān)重要，抑制PDGF信號(hào)通路會(huì)導(dǎo)致腫瘤血管結(jié)構(gòu)異常，增加血管通透性，進(jìn)而影響腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。三、IGFBP-6的基礎(chǔ)研究3.1IGFBP-6的結(jié)構(gòu)與功能胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-6（IGFBP-6）作為胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白（IGFBPs）家族的重要成員，在體內(nèi)的生理和病理過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，對(duì)其結(jié)構(gòu)與功能的深入了解是探究其在缺氧誘導(dǎo)性血管生成中作用機(jī)制的基礎(chǔ)。IGFBP-6的編碼基因位于人類染色體12q13.1區(qū)域，該基因全長(zhǎng)約23.5kb，由7個(gè)外顯子和6個(gè)內(nèi)含子組成。經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯后，最終形成相對(duì)分子質(zhì)量約為34kD的蛋白質(zhì)。IGFBP-6的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)具有典型的IGFBPs家族特征，包含高度保守的N端和C端結(jié)構(gòu)域，以及相對(duì)可變的中間結(jié)構(gòu)域。N端結(jié)構(gòu)域含有約100個(gè)氨基酸殘基，其中包含3個(gè)保守的二硫鍵，這些二硫鍵對(duì)于維持蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象和與配體的結(jié)合活性至關(guān)重要。N端結(jié)構(gòu)域是IGFBP-6與胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，尤其是與IGF-II具有極高的親和力，其對(duì)IGF-II的親和力比IGF-I高約10倍。C端結(jié)構(gòu)域同樣含有多個(gè)保守的半胱氨酸殘基，參與形成二硫鍵，維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，C端結(jié)構(gòu)域除了參與IGF結(jié)合外，還在調(diào)節(jié)IGFBP-6的生物學(xué)活性以及與其他蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮重要作用。中間結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列在不同物種間存在一定差異，其功能主要涉及蛋白質(zhì)的柔性和空間取向，可能影響IGFBP-6與其他分子的相互作用以及在細(xì)胞內(nèi)的定位。在功能方面，IGFBP-6對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和遷移的調(diào)節(jié)作用具有復(fù)雜性和多樣性，且在不同細(xì)胞類型和生理病理?xiàng)l件下表現(xiàn)出不同的效應(yīng)。在腫瘤細(xì)胞中，IGFBP-6的作用存在爭(zhēng)議。在乳腺癌細(xì)胞系MCF-7中，過(guò)表達(dá)IGFBP-6能夠顯著抑制細(xì)胞的增殖，研究發(fā)現(xiàn)這一過(guò)程與IGFBP-6競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合IGF-II，減少IGF-II與IGF-IR的結(jié)合，從而阻斷下游PI3K/Akt和MAPK信號(hào)通路的激活有關(guān)。而在某些肝癌細(xì)胞中，IGFBP-6卻呈現(xiàn)出促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用，其機(jī)制可能是通過(guò)與細(xì)胞表面的非IGF受體結(jié)合，激活特定的促增殖信號(hào)通路。在正常細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中，IGFBP-6也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。在胚胎發(fā)育過(guò)程中，IGFBP-6在多種組織和器官的形成過(guò)程中均有表達(dá)，如在小鼠胚胎的心臟發(fā)育過(guò)程中，IGFBP-6通過(guò)調(diào)節(jié)IGF-II的活性，影響心肌細(xì)胞的增殖和分化，對(duì)心臟的正常形態(tài)發(fā)生和功能建立至關(guān)重要。在成體組織中，IGFBP-6參與維持組織穩(wěn)態(tài)。在皮膚組織中，IGFBP-6能夠抑制成纖維細(xì)胞的過(guò)度增殖，防止皮膚纖維化的發(fā)生。IGFBP-6對(duì)細(xì)胞遷移的影響同樣因細(xì)胞類型和環(huán)境而異。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，體外實(shí)驗(yàn)表明，低濃度的IGFBP-6可以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，而高濃度時(shí)則表現(xiàn)出抑制作用。這種雙相調(diào)節(jié)作用可能與IGFBP-6對(duì)不同信號(hào)通路的激活或抑制有關(guān)。在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲方面，有研究發(fā)現(xiàn)，在鼻咽癌CNE2細(xì)胞中，IGFBP-6過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)一步研究表明，這是通過(guò)抑制AKT信號(hào)通路，下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)分子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而在某些黑色素瘤細(xì)胞中，IGFBP-6卻能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移，其機(jī)制可能是通過(guò)與細(xì)胞表面的整合素等分子相互作用，激活RhoGTPases等信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。3.2IGFBP-6的表達(dá)調(diào)控IGFBP-6的表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜且精細(xì)的過(guò)程，受到多種因素的綜合影響，在正常和缺氧條件下呈現(xiàn)出不同的調(diào)控模式。在正常生理?xiàng)l件下，IGFBP-6的表達(dá)在不同組織和細(xì)胞中存在差異，且受到多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的調(diào)控。在肝臟中，轉(zhuǎn)錄因子HNF-4α（肝細(xì)胞核因子4α）被發(fā)現(xiàn)參與IGFBP-6的表達(dá)調(diào)控。研究表明，HNF-4α能夠與IGFBP-6基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄，從而維持肝臟中IGFBP-6的基礎(chǔ)表達(dá)水平。在成骨細(xì)胞中，Runx2（Run相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2）對(duì)IGFBP-6的表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用。Runx2通過(guò)與IGFBP-6基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件相互作用，激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程，在骨組織的生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中，調(diào)控IGFBP-6的表達(dá)，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞的增殖、分化以及骨基質(zhì)的形成。一些激素也參與了IGFBP-6表達(dá)的調(diào)節(jié)。甲狀腺激素能夠上調(diào)IGFBP-6在某些組織中的表達(dá)，其機(jī)制可能是通過(guò)甲狀腺激素受體與IGFBP-6基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲狀腺激素反應(yīng)元件結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄。在脂肪細(xì)胞中，胰島素對(duì)IGFBP-6的表達(dá)具有抑制作用，胰島素通過(guò)激活PI3K/Akt信號(hào)通路，抑制相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的活性，從而降低IGFBP-6的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞處于缺氧環(huán)境時(shí)，IGFBP-6的表達(dá)會(huì)發(fā)生顯著變化。大量研究表明，缺氧能夠上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞中IGFBP-6的基因表達(dá)。以體外培養(yǎng)的大鼠腦微動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞和人類臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為材料，通過(guò)半定量RT-PCR以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在缺氧條件下，這兩種細(xì)胞中IGFBP-6的mRNA水平均明顯升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，缺氧對(duì)IGFBP-6基因表達(dá)的調(diào)控作用可能是通過(guò)缺氧誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子HIF-1來(lái)實(shí)現(xiàn)的。缺氧時(shí)，HIF-1α亞基穩(wěn)定表達(dá)并與HIF-1β亞基結(jié)合形成異源二聚體，然后轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，與IGFBP-6基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄過(guò)程，從而使IGFBP-6的表達(dá)上調(diào)。除了HIF-1依賴的途徑，缺氧還可能通過(guò)其他信號(hào)通路間接影響IGFBP-6的表達(dá)。有研究提出，缺氧可能激活p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路，p38MAPK被激活后，能夠磷酸化一系列下游轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子可能作用于IGFBP-6基因的調(diào)控區(qū)域，影響其表達(dá)。但具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。四、IGFBP-6對(duì)缺氧誘導(dǎo)性血管生成的作用研究4.1體外實(shí)驗(yàn)研究4.1.1細(xì)胞培養(yǎng)與缺氧模型建立本研究選用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，因其來(lái)源廣泛、易于獲取，且具有典型的血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)特性，在血管生成相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛。HUVEC的培養(yǎng)采用專用的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中含有體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，為細(xì)胞生長(zhǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子；1%的青霉素-鏈霉素混合溶液，可有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染。將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，37℃是人體生理溫度，最適合細(xì)胞的生長(zhǎng)代謝，5%CO?能夠維持培養(yǎng)基的pH值穩(wěn)定，為細(xì)胞提供適宜的生存環(huán)境。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至匯合度達(dá)到80%-90%時(shí)，用0.25%的胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)，保證細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可靠性。缺氧模型的構(gòu)建是本研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HUVEC接種于6孔板中，每孔接種細(xì)胞數(shù)為5×10?個(gè)，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好后，進(jìn)行缺氧處理。利用三氣培養(yǎng)箱模擬缺氧環(huán)境，設(shè)定箱內(nèi)氣體成分為90%N?、5%CO?、5%O?。將細(xì)胞置于該缺氧環(huán)境中培養(yǎng)不同時(shí)間（0、4、8、16及32h），以探究不同缺氧時(shí)長(zhǎng)對(duì)細(xì)胞的影響。在缺氧處理過(guò)程中，定期通過(guò)顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞逐漸由典型的“鵝卵石”樣形態(tài)變?yōu)樗笮?，?xì)胞間隙增大，形態(tài)變得不規(guī)則。通過(guò)Westernblot檢測(cè)缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組HUVEC的HIF-1α蛋白表達(dá)隨低氧處理時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增高，在缺氧16h時(shí)達(dá)到較高水平。綜合細(xì)胞形態(tài)變化和HIF-1α蛋白表達(dá)情況，確定16h為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的最佳缺氧處理時(shí)間。4.1.2IGFBP-6對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移的影響為了探究IGFBP-6對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖的影響，采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。將HUVEC分為正常對(duì)照組、缺氧對(duì)照組和不同濃度IGFBP-6處理組（分別為10ng/mL、50ng/mL、100ng/mL）。正常對(duì)照組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)；缺氧對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行上述缺氧處理16h；不同濃度IGFBP-6處理組細(xì)胞在缺氧處理前分別加入相應(yīng)濃度的IGFBP-6蛋白，孵育2h后再進(jìn)行缺氧處理。在培養(yǎng)24h、48h和72h時(shí)，向每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2h后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處的吸光度值（OD值）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，缺氧對(duì)照組細(xì)胞的增殖能力在培養(yǎng)48h和72h時(shí)顯著增強(qiáng)（P<0.05），說(shuō)明缺氧能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。在不同濃度IGFBP-6處理組中，隨著IGFBP-6濃度的增加，細(xì)胞增殖受到抑制。100ng/mLIGFBP-6處理組在培養(yǎng)48h和72h時(shí)，細(xì)胞增殖能力顯著低于缺氧對(duì)照組（P<0.05），表明IGFBP-6對(duì)缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖具有抑制作用，且這種抑制作用呈濃度依賴性。采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IGFBP-6對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。將HUVEC接種于6孔板中，待細(xì)胞融合至90%以上時(shí)，用10μL移液器槍頭在細(xì)胞單層表面垂直劃一道直線，用PBS輕輕沖洗3次，去除劃下的細(xì)胞。隨后，正常對(duì)照組細(xì)胞繼續(xù)在常規(guī)培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，缺氧對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理16h，不同濃度IGFBP-6處理組細(xì)胞在缺氧處理前加入相應(yīng)濃度的IGFBP-6蛋白孵育2h后再進(jìn)行缺氧處理。分別在劃痕后0h和24h在顯微鏡下拍照，測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，缺氧對(duì)照組細(xì)胞在24h時(shí)劃痕寬度明顯減小，細(xì)胞遷移率顯著增加（P<0.05），表明缺氧能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的遷移。而不同濃度IGFBP-6處理組中，隨著IGFBP-6濃度的升高，細(xì)胞遷移率逐漸降低。100ng/mLIGFBP-6處理組在24h時(shí)的細(xì)胞遷移率顯著低于缺氧對(duì)照組（P<0.05），說(shuō)明IGFBP-6能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移，且抑制效果與濃度相關(guān)。4.1.3IGFBP-6與VEGF等促血管生成因子的相互作用為了研究IGFBP-6與VEGF等促血管生成因子在體外對(duì)血管生成的交互影響，首先檢測(cè)了IGFBP-6對(duì)缺氧條件下VEGF表達(dá)的影響。將HUVEC分為正常對(duì)照組、缺氧對(duì)照組和IGFBP-6處理組（100ng/mL）。正常對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，缺氧對(duì)照組和IGFBP-6處理組細(xì)胞均進(jìn)行缺氧處理16h，其中IGFBP-6處理組在缺氧處理前加入IGFBP-6蛋白孵育2h。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和ELISA法分別檢測(cè)細(xì)胞中VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，缺氧對(duì)照組細(xì)胞中VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。而在IGFBP-6處理組中，VEGFmRNA和蛋白的表達(dá)水平較缺氧對(duì)照組顯著降低（P<0.05），表明IGFBP-6能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的VEGF表達(dá)。進(jìn)一步探究IGFBP-6與VEGF在調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能方面的相互作用，進(jìn)行了管腔形成實(shí)驗(yàn)。將Matrigel基質(zhì)膠鋪于96孔板中，每孔50μL，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30min使其凝固。將HUVEC分為正常對(duì)照組、缺氧對(duì)照組、VEGF處理組（50ng/mL）、IGFBP-6+VEGF處理組（IGFBP-6為100ng/mL，VEGF為50ng/mL）。正常對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，缺氧對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行缺氧處理16h，VEGF處理組細(xì)胞在缺氧處理時(shí)加入VEGF蛋白，IGFBP-6+VEGF處理組細(xì)胞在缺氧處理前先加入IGFBP-6蛋白孵育2h，再加入VEGF蛋白。將各組細(xì)胞以每孔2×10?個(gè)的密度接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的96孔板中，培養(yǎng)6h后，在顯微鏡下觀察并拍照，統(tǒng)計(jì)管腔形成的數(shù)量和長(zhǎng)度。結(jié)果表明，與正常對(duì)照組相比，缺氧對(duì)照組細(xì)胞管腔形成數(shù)量和長(zhǎng)度明顯增加（P<0.05），VEGF處理組管腔形成數(shù)量和長(zhǎng)度進(jìn)一步顯著增加（P<0.05）。而在IGFBP-6+VEGF處理組中，管腔形成數(shù)量和長(zhǎng)度較VEGF處理組顯著減少（P<0.05），但仍高于正常對(duì)照組，說(shuō)明IGFBP-6能夠部分拮抗VEGF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成的促進(jìn)作用。4.2體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究4.2.1動(dòng)物模型的選擇與構(gòu)建在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，本研究選用C57BL/6小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，因其遺傳背景清晰、免疫反應(yīng)穩(wěn)定，在血管生成相關(guān)研究中廣泛應(yīng)用。為構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)的血管生成動(dòng)物模型，采用小鼠后肢缺血模型。具體操作如下：將小鼠用2%戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術(shù)臺(tái)上。在無(wú)菌條件下，分離右側(cè)股動(dòng)脈、股靜脈和股神經(jīng)，使用絲線雙重結(jié)扎并剪斷股動(dòng)脈，造成右側(cè)后肢缺血。術(shù)后密切觀察小鼠后肢的血液循環(huán)情況，可見(jiàn)術(shù)后小鼠右側(cè)后肢皮膚溫度降低，足趾顏色變蒼白，毛細(xì)血管充盈時(shí)間延長(zhǎng)，表明缺血模型構(gòu)建成功。為了驗(yàn)證模型中缺氧狀態(tài)的存在，取缺血后肢肌肉組織進(jìn)行缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的免疫組化檢測(cè)，結(jié)果顯示缺血后肢肌肉組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)顯著增加，進(jìn)一步證實(shí)了缺氧環(huán)境的建立。4.2.2IGFBP-6對(duì)動(dòng)物體內(nèi)血管生成的影響為了探究IGFBP-6對(duì)動(dòng)物體內(nèi)血管生成的影響，將構(gòu)建好的小鼠后肢缺血模型隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、缺血模型組和IGFBP-6治療組，每組10只小鼠。對(duì)照組小鼠不進(jìn)行任何處理；缺血模型組小鼠僅進(jìn)行后肢缺血手術(shù)；IGFBP-6治療組小鼠在進(jìn)行后肢缺血手術(shù)后，立即于缺血部位肌肉多點(diǎn)注射重組人IGFBP-6蛋白（10μg/只），隨后每隔3天注射一次，共注射4次。在術(shù)后第14天，采用激光多普勒血流儀檢測(cè)小鼠雙側(cè)后肢的血流灌注情況。結(jié)果顯示，缺血模型組小鼠缺血側(cè)后肢與非缺血側(cè)后肢的血流灌注比值（I/N值）明顯低于對(duì)照組（P<0.05），表明后肢缺血導(dǎo)致局部血流灌注顯著降低。而IGFBP-6治療組小鼠缺血側(cè)后肢的I/N值顯著高于缺血模型組（P<0.05），說(shuō)明IGFBP-6治療能夠改善缺血后肢的血流灌注。為了進(jìn)一步觀察血管生成情況，取小鼠缺血后肢肌肉組織進(jìn)行CD31免疫熒光染色，CD31是血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，可用于標(biāo)記新生血管。通過(guò)ImageJ軟件分析血管密度，結(jié)果顯示缺血模型組小鼠缺血后肢肌肉組織中的血管密度明顯高于對(duì)照組（P<0.05），這是機(jī)體對(duì)缺血缺氧的一種代償性血管生成反應(yīng)。IGFBP-6治療組小鼠缺血后肢肌肉組織中的血管密度顯著低于缺血模型組（P<0.05），表明IGFBP-6能夠抑制缺氧誘導(dǎo)的體內(nèi)血管生成。4.2.3腫瘤模型中IGFBP-6的抗血管生成作用為了研究IGFBP-6在腫瘤模型中的抗血管生成作用，選用B16F10小鼠黑色素瘤細(xì)胞構(gòu)建腫瘤模型。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的B16F10細(xì)胞以1×10?個(gè)/只的密度接種于C57BL/6小鼠右側(cè)腋窩皮下。待腫瘤體積長(zhǎng)至約100mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為2組，分別為腫瘤對(duì)照組和IGFBP-6治療組，每組8只小鼠。腫瘤對(duì)照組小鼠瘤內(nèi)注射PBS，IGFBP-6治療組小鼠瘤內(nèi)注射重組人IGFBP-6蛋白（10μg/只），每隔3天注射一次，共注射5次。每隔3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。結(jié)果顯示，隨著時(shí)間的推移，腫瘤對(duì)照組小鼠的腫瘤體積逐漸增大，而IGFBP-6治療組小鼠的腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯減緩。在第15天，IGFBP-6治療組小鼠的腫瘤體積顯著小于腫瘤對(duì)照組（P<0.05），表明IGFBP-6能夠抑制腫瘤的生長(zhǎng)。取腫瘤組織進(jìn)行CD31免疫組化染色，觀察腫瘤血管生成情況。通過(guò)ImageJ軟件分析腫瘤血管密度，結(jié)果顯示腫瘤對(duì)照組小鼠腫瘤組織中的血管密度明顯高于IGFBP-6治療組（P<0.05），說(shuō)明IGFBP-6能夠抑制腫瘤血管生成，減少腫瘤的血液供應(yīng)，從而抑制腫瘤的生長(zhǎng)。五、IGFBP-6影響缺氧誘導(dǎo)性血管生成的分子機(jī)制5.1IGF非依賴途徑越來(lái)越多的研究表明，IGFBP-6除了通過(guò)經(jīng)典的IGF依賴途徑發(fā)揮作用外，還能不依賴于IGF而對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響，進(jìn)而參與缺氧誘導(dǎo)性血管生成的調(diào)控。在缺氧條件下，IGFBP-6可以直接與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的某些受體或膜蛋白相互作用，啟動(dòng)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)事件，從而影響血管生成相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-6能夠與整合素αvβ3結(jié)合，整合素αvβ3是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高度表達(dá)的細(xì)胞黏附分子，在血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用。IGFBP-6與整合素αvβ3結(jié)合后，抑制了整合素αvβ3與其配體的相互作用，進(jìn)而阻斷了下游FAK（粘著斑激酶）/Src信號(hào)通路的激活。FAK/Src信號(hào)通路在促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成中起著關(guān)鍵作用，其被抑制后，內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力下降，管腔形成受到阻礙，最終抑制了缺氧誘導(dǎo)的血管生成。IGFBP-6還可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)來(lái)影響血管生成。在缺氧環(huán)境下，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧（ROS），適度的ROS水平可以作為信號(hào)分子，促進(jìn)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)和信號(hào)通路的激活，但過(guò)高的ROS水平會(huì)對(duì)細(xì)胞造成氧化損傷，影響細(xì)胞功能。研究表明，IGFBP-6能夠上調(diào)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶的表達(dá)，如超氧化物歧化酶（SOD）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等，這些抗氧化酶可以清除過(guò)多的ROS，維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原平衡。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS水平過(guò)高時(shí)，會(huì)激活p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信號(hào)通路，p38MAPK的持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和血管生成抑制。IGFBP-6通過(guò)調(diào)節(jié)ROS水平，抑制了p38MAPK信號(hào)通路的過(guò)度激活，從而減少內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，維持血管生成相關(guān)過(guò)程的正常進(jìn)行。此外，IGFBP-6還可能與細(xì)胞內(nèi)的一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響血管生成相關(guān)基因的表達(dá)。在缺氧誘導(dǎo)性血管生成過(guò)程中，一些轉(zhuǎn)錄因子如Ets-1（E26transformation-specific1）、AP-1（ActivatorProtein-1）等被激活，它們可以結(jié)合到VEGF、FGF等促血管生成因子基因的啟動(dòng)子區(qū)域，促進(jìn)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-6可以與Ets-1結(jié)合，形成復(fù)合物，抑制Ets-1與VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力，從而減少VEGF的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，抑制血管生成。IGFBP-6還可能通過(guò)調(diào)節(jié)AP-1的活性，影響其對(duì)下游促血管生成基因的調(diào)控作用，但具體的分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。5.2與其他信號(hào)通路的交互作用IGFBP-6在缺氧誘導(dǎo)性血管生成過(guò)程中，并非孤立地發(fā)揮作用，而是與多種其他血管生成相關(guān)信號(hào)通路存在復(fù)雜的交互作用，共同調(diào)控血管生成的進(jìn)程。IGFBP-6與Notch信號(hào)通路之間存在相互影響。在血管生成過(guò)程中，Notch信號(hào)通路對(duì)維持血管的正常形態(tài)和功能起著關(guān)鍵作用。研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-6可以調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路的關(guān)鍵分子表達(dá)。在缺氧條件下，IGFBP-6過(guò)表達(dá)能夠降低血管內(nèi)皮細(xì)胞中Notch配體Delta-like4（Dll4）的表達(dá)。Dll4是激活Notch信號(hào)的重要配體，其表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致Notch信號(hào)通路的激活受到抑制。進(jìn)一步研究表明，IGFBP-6可能通過(guò)與某些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響Dll4基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程。當(dāng)Notch信號(hào)通路被抑制時(shí)，會(huì)影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和血管分支的形成，導(dǎo)致血管生成異常。這表明IGFBP-6通過(guò)調(diào)節(jié)Notch信號(hào)通路，間接影響了缺氧誘導(dǎo)性血管生成。反過(guò)來(lái)，Notch信號(hào)通路的激活狀態(tài)也可能對(duì)IGFBP-6的功能產(chǎn)生影響。激活的Notch信號(hào)可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，改變IGFBP-6與其他分子的相互作用，從而影響其對(duì)血管生成的調(diào)控作用。例如，Notch信號(hào)通路激活后，可能會(huì)上調(diào)某些蛋白激酶的活性，這些激酶可能對(duì)IGFBP-6進(jìn)行磷酸化修飾，改變其結(jié)構(gòu)和功能。IGFBP-6與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF）信號(hào)通路也存在交互關(guān)系。FGF信號(hào)通路在促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和分化中發(fā)揮著重要作用。研究表明，IGFBP-6可以抑制FGF誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移。在體外實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)同時(shí)給予IGFBP-6和FGF時(shí)，F(xiàn)GF對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的促增殖和促遷移作用明顯減弱。深入研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-6可能通過(guò)與FGF受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FGF，或者通過(guò)調(diào)節(jié)FGF信號(hào)通路下游的關(guān)鍵分子，如ERK等，來(lái)抑制FGF信號(hào)通路的激活。另一方面，F(xiàn)GF信號(hào)通路的激活也可能影響IGFBP-6的表達(dá)和功能。當(dāng)FGF信號(hào)通路被激活時(shí)，可能會(huì)通過(guò)某些轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)IGFBP-6基因的表達(dá)。FGF信號(hào)通路激活后，可能會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的產(chǎn)生，ROS可以作為信號(hào)分子，調(diào)節(jié)IGFBP-6的表達(dá)和穩(wěn)定性。在血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）信號(hào)通路方面，IGFBP-6同樣與之存在交互作用。PDGF在促進(jìn)周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的募集和增殖，以及維持血管的穩(wěn)定性方面起著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，IGFBP-6可以抑制PDGF誘導(dǎo)的周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的增殖。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)IGFBP-6會(huì)導(dǎo)致PDGF刺激下的周細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞增殖減少，血管周圍的細(xì)胞覆蓋減少，血管穩(wěn)定性下降。機(jī)制研究表明，IGFBP-6可能通過(guò)與PDGF受體結(jié)合，阻斷PDGF與受體的相互作用，或者通過(guò)調(diào)節(jié)PDGF信號(hào)通路下游的PI3K/Akt等信號(hào)分子，來(lái)抑制PDGF信號(hào)通路的激活。而PDGF信號(hào)通路的激活狀態(tài)也可能影響IGFBP-6的功能。當(dāng)PDGF信號(hào)通路激活時(shí)，可能會(huì)改變細(xì)胞的微環(huán)境，影響IGFBP-6與其他分子的相互作用，從而間接影響其對(duì)血管生成的調(diào)控作用。六、研究結(jié)論與展望6.1研究結(jié)論總結(jié)本研究圍繞IGFBP-6對(duì)缺氧誘導(dǎo)性血管生成的作用及機(jī)制展開(kāi)，通過(guò)一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和深入研究，取得了以下重要成果：IGFBP-6表達(dá)受缺氧調(diào)控：在正常生理?xiàng)l件下，IGFBP-6的表達(dá)在不同組織和細(xì)胞中受到多種轉(zhuǎn)錄因子和信號(hào)通路的精細(xì)調(diào)控。而當(dāng)細(xì)胞處于缺氧環(huán)境時(shí)，IGFBP-6的表達(dá)顯著上調(diào)，這一調(diào)控作用主要通過(guò)缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）與IGFBP-6基因啟動(dòng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)。對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響：體外實(shí)驗(yàn)表明，IGFBP-6對(duì)缺氧誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移具有抑制作用，且這種抑制作用呈濃度依賴性。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，隨著IGFBP-6濃度的增加，缺氧條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖能力顯著下降；劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IGFBP-6濃度升高，血管內(nèi)