基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速 評價方法VIP

ICS

CCS

SDYYXH

團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)

T/SDYYXHXXXX—2023

基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速

評價方法

Arapidmethodforevaluatingearlyhepatotoxicityofdrugsusingzebrafishmodel

-XX-XX發(fā)布XXXX-XX-XX實施

山東省醫(yī)藥行業(yè)協(xié)會??發(fā)布

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基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速評價方法

1范圍

本文件規(guī)定了基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性快速評價方法的原理、受試物、儀器設(shè)備、試驗準(zhǔn)

備、試驗步驟、保證試驗有效性的條件、判定步驟、數(shù)據(jù)處理與試驗報告等內(nèi)容。

本文件適用于基于斑馬魚模型的藥物早期肝毒性的快速評價。

2規(guī)范性引用文件

本文件沒有規(guī)范性引用文件。

3術(shù)語和定義

下列術(shù)語和定義適用于本文件。

3.1

斑馬魚zebrafish

模式動物的一種，常用于教學(xué)和科研。生物分類學(xué)上屬于脊椎動物門、硬骨魚綱、鯉形目、鯉科、

斑馬魚屬、斑馬魚種。

3.2

Tg（L-FABP:EGFP）品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg（L-FABP:EGFP）straintransgeniczebrafish

實驗室常用轉(zhuǎn)基因品系斑馬魚，肝臟被綠色熒光特異標(biāo)記。

3.3

仔魚larva

性腺發(fā)育尚未成熟的斑馬魚。

3.4

受精后小時數(shù)hourspost-fertilization（hpf）

斑馬魚胚胎體外受精后的小時數(shù)。

3.5

沒有心跳lackofheartbeat

一分鐘內(nèi)心臟沒有跳動。

3.6

藥物drugs

以預(yù)防、治療及診斷疾病的物質(zhì)。

3.7

10?%致死濃度10%lethalconcentration（LC10）

受試物導(dǎo)致10%受試魚死亡的濃度。沒有心跳判定為死亡。

3.8

熒光顯微成像fluorescencemicroscopy

對特定樣本使用熒光蛋白或分子標(biāo)記后，對其標(biāo)記物成像的光學(xué)顯微成像技術(shù)。

3.9

組織切片tissueslice

以生物組織為材料，處理為薄片，應(yīng)用于玻片以適合顯微鏡之觀察。

3.10

熒光實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)real-timequantitativePCR（RT-qPCR）

在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，應(yīng)用熒光化學(xué)物質(zhì)檢測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。

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4方法原理

斑馬魚的肝臟與人類相似，不僅具有分泌膽汁，合成蛋白質(zhì)的功能，還能中和分解有毒物質(zhì)。斑馬

魚受精48hpf時，肝臟形態(tài)基本形成；受精72hpf后，肝臟的形態(tài)及功能全部發(fā)育成熟。斑馬魚的肝臟

對藥物的介入非常敏感，肝毒性藥物極易使其生理結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，誘導(dǎo)肝臟細(xì)胞發(fā)生凋亡。綜上所述，

以斑馬魚為試驗動物，應(yīng)用熒光顯微成像、組織切片和熒光實時定量PCR等技術(shù)，以肝臟面積、肝臟組

織形態(tài)和凋亡相關(guān)基因表達(dá)等為檢測指標(biāo)，可對藥物的早期肝臟毒性進(jìn)行快速定量分析。

5受試物

5.1受試物配制

5.1.1水溶性藥物：斑馬魚培養(yǎng)水直接溶解配制成檢測溶液。

5.1.2非水溶性藥物：選用有機(jī)溶劑、乳化劑或分散劑等進(jìn)行助溶，制備成均勻分散的懸濁液或乳濁

液。

5.2受試物準(zhǔn)備量

5.2.1固態(tài)受試物檢測用量10?mg～50?mg。

5.2.2液態(tài)受試物檢測用量30?mL～50?mL。

5.2.3半固態(tài)受試物檢測用量20?mg～100?mg。

5.2.4半液態(tài)受試物檢測用量20?mL～100?mL。

5.3受試物相關(guān)信息

5.3.1受試物的名稱、性狀、批號、規(guī)格、生產(chǎn)日期、保存條件、保質(zhì)期。

5.3.2受試物為單體成分時，還需要提供該成分相應(yīng)的化學(xué)信息，包括分子量、分子式、分子結(jié)構(gòu)。

5.3.3提供受試物理化性質(zhì)，包含如下信息：

a)在水中或其它溶劑中的溶解性；

b)在水中和光中的穩(wěn)定性；

c)溫度對受試物穩(wěn)定性的影響。

6儀器設(shè)備

6.1分析天平。精度0.0001g。

6.2量筒。500mL，精度0.5mL

6.3熒光顯微鏡。配置藍(lán)色濾光片和圖像采集系統(tǒng)，放大倍數(shù)為40倍。

6.4組織切片機(jī)?？捎糜谑灲M織切片的制備。

6.5RT-qPCR反應(yīng)儀。內(nèi)置96孔半導(dǎo)體控溫PCR模塊；溫控精度：≤±0.25℃；溫控范圍：0℃～99.9℃。

6.6恒溫光照培養(yǎng)箱。精度±1℃。

6.7斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)。配備溫控裝置，水循環(huán)和過濾裝置。

6.8水質(zhì)監(jiān)測設(shè)備。pH計、溶解氧測定儀、鹽度計。

6.9試驗容器。玻璃或聚苯乙烯容器。如受試物可能吸附于聚苯乙烯容器時，應(yīng)選用惰性材料（如玻

璃）來減少吸附。

7試驗準(zhǔn)備

7.1受試斑馬魚

發(fā)育至72hpf健康A(chǔ)B系斑馬魚。

7.2斑馬魚培養(yǎng)水

7.2.1斑馬魚培養(yǎng)水使用存放24h以上并經(jīng)曝氣處理的去離子水配制，內(nèi)含5mmol/LNaCl、

0.17mmol/LKCl、0.4mmol/LCaCl2和0.16mmol/LMgSO4。

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7.2.2斑馬魚培養(yǎng)水配制方法：用分析天平稱取14.658gNaCl、0.633gKCl、2.425gCaCl2和4.06g

MgSO4·7H2O，加入1000mL純凈水配制成50×斑馬魚培養(yǎng)水。量取20mL的50×斑馬魚培養(yǎng)水，加入

980mL純凈水，配制成1×斑馬魚培養(yǎng)水。

7.2.3pH值保持在6.5～8.0，水的硬度（以CaCO3計）為10mg/L～250mg/L，溶解氧濃度不低于6.0mg/L。

注：此培養(yǎng)水為斑馬魚提供最適生存水環(huán)境。

7.3試驗溶液配制

7.3.1加入受試物后，試驗溶液pH值在6.5～8.0之間，不需調(diào)節(jié)試驗溶液的pH值。

7.3.2如果加入受試物后試驗溶液的pH值小于6.5或大于8.0，重新配制，調(diào)節(jié)受試物貯備液的pH

值，使其接近加入受試物前稀釋水的pH值。用于調(diào)節(jié)pH值的物質(zhì)不應(yīng)使儲備液的濃度明顯改變，也不

應(yīng)與受試物發(fā)生化學(xué)反應(yīng)或產(chǎn)生沉淀。

7.3.3非水溶性受試物，添加有機(jī)溶劑、乳化劑或分散劑提高受試物溶解度和試驗溶液的均勻度。受

試物試驗溶液中助溶劑濃度不得超過100mg/L。

8試驗步驟

8.1試驗分組

試驗設(shè)置空白對照組、陽性對照組和受試物組，如使用助溶劑，增設(shè)1個溶劑對照組。

8.2空白對照組設(shè)置

隨機(jī)挑取肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚，置于6孔板中，每孔含15

尾仔魚和5mL斑馬魚培養(yǎng)水。

8.3溶劑對照組設(shè)置

隨機(jī)挑取肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚，置于6孔板中，每孔含15

尾仔魚和5mL助溶劑溶液。助溶劑溶液濃度為受試物組使用助溶劑的最高濃度。

8.4陽性對照組設(shè)置

隨機(jī)挑取肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚，置于6孔板中，每孔含

15尾仔魚和5mL異煙肼溶液，異煙肼溶液濃度為6mM。

8.5受試物組設(shè)置

挑取肝臟顯示綠色熒光的健康Tg（L-FABP:EGFP）品系轉(zhuǎn)基因斑馬魚，置于6孔板中，每孔含15

尾仔魚和5mL受試物溶液（配制方法見7.3），受試物試驗溶液濃度需＜LC10（沒有心跳特征的斑馬魚

界定為死亡），試驗時根據(jù)需要設(shè)置多個受試物濃度組。

8.6暴露條件

空白對照組、陽性對照組和受試物組斑馬魚靜置于28.5℃±1℃的恒溫光照培養(yǎng)箱，避光連續(xù)暴露

72h。

注：暴露期間禁止喂食。

8.7肝臟面積檢測

暴露結(jié)束，熒光顯微鏡下觀察拍攝仔魚顯示綠色熒光的肝臟組織圖像，并測量其面積。

8.8肝臟組織形態(tài)檢測

暴露結(jié)束，4%多聚甲醛固定仔魚組織，應(yīng)用石蠟將其包埋后，將仔魚制備為厚度為5-10μm的石蠟

組織切片。使用蘇木精和伊紅對斑馬魚石蠟組織切片進(jìn)行染色。顯微鏡下觀察拍攝染色后的肝臟組織。

8.9凋亡相關(guān)基因表達(dá)量檢測

暴露結(jié)束，提取仔魚RNA，將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)檢測凋亡相關(guān)基因（bax、caspase-3、

caspase-8和caspase-9）的表達(dá)量。

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9保證試驗有效性的條件

9.1每孔內(nèi)斑馬魚密度小于5尾/mL。

9.2水溶性受試物可配制成澄清溶液，非水溶性受試物可配制成均勻分散的懸濁液或乳濁液。

9.3斑馬魚圖像采集時，各組間拍照參數(shù)一致。

10判定標(biāo)準(zhǔn)

10.1各試驗組暴露完成后至少90%仔魚存活，否則對應(yīng)試驗組結(jié)果無效。

10.2受試物組與空白對照組相比，斑馬魚肝臟面積在統(tǒng)計學(xué)上顯著減?。≒＜0.05），此時試驗結(jié)果

可作為受試物具有肝臟毒性的支持證據(jù)，但不替代人體功能檢測。

10.3受試物組與空白對照組相比，斑馬魚肝臟細(xì)胞排列松散，萎縮變形，胞質(zhì)溶解出現(xiàn)空泡化，此時

試驗結(jié)果可作為受試物具有肝臟毒性的支持證據(jù)，但不替代人體功能檢測。

10.4試物組與空白對照組相比，斑馬魚凋亡相關(guān)基因bax、caspase-3、caspase-8和caspase-9表達(dá)

量在統(tǒng)計學(xué)上顯著增加（P＜0.05），此時試驗結(jié)果可作為受試物具有肝臟毒性的支持證據(jù)，但不替代

人體功能檢測。

11數(shù)據(jù)處理

11.1毒性評價指標(biāo)：斑馬魚的肝臟面積，肝臟組織病理改變、凋亡相關(guān)基因（bax、caspase-3、caspase-8

和caspase-9）表達(dá)量。

11.2統(tǒng)計分析方法：方差分析（ANOVA），輔助以