PGRN激活mTOR信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的機(jī)制探究

PGRN激活mTOR信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義1.1.1宮頸癌的現(xiàn)狀與危害宮頸癌是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康。據(jù)統(tǒng)計(jì)，其發(fā)病率在女性惡性腫瘤中位居前列，死亡率也不容小覷。在發(fā)展中國(guó)家，由于醫(yī)療資源有限、篩查普及程度不足等原因，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率更是居高不下。高危型人乳頭瘤病毒（HPV）的持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生的主要病因，然而，除了HPV感染外，還有許多其他因素參與了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程。宮頸癌不僅給患者帶來身體上的痛苦，還對(duì)其心理和生活質(zhì)量造成了極大的負(fù)面影響，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)。1.1.2PGRN和mTOR信號(hào)通路在癌癥研究中的重要性顆粒蛋白前體（PGRN）是一種分泌性生長(zhǎng)因子，在多種生理過程中發(fā)揮重要作用，如胚胎發(fā)育、組織修復(fù)和炎癥調(diào)節(jié)等。近年來，越來越多的研究表明，PGRN在多種腫瘤中異常表達(dá)，并參與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥等過程。在乳腺癌、卵巢癌和肝癌等腫瘤中，PGRN的高表達(dá)與腫瘤的不良預(yù)后相關(guān)。mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路之一，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝和存活等過程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。該通路的異常激活在多種惡性腫瘤中普遍存在，包括宮頸癌。mTOR通過感知細(xì)胞內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)、能量和生長(zhǎng)因子等信號(hào)，調(diào)節(jié)下游一系列靶蛋白的活性，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。由于PGRN和mTOR信號(hào)通路在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用，它們成為了癌癥治療的潛在重要靶點(diǎn)，深入研究它們之間的相互作用機(jī)制，對(duì)于開發(fā)新的癌癥治療策略具有重要意義。1.1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究PGRN通過mTOR信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的具體機(jī)制。通過一系列實(shí)驗(yàn)，明確PGRN在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，以及其對(duì)mTOR信號(hào)通路的調(diào)控作用，進(jìn)一步揭示PGRN影響宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的分子機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于，首次系統(tǒng)地研究PGRN與mTOR信號(hào)通路在宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲過程中的關(guān)聯(lián)，為宮頸癌的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的視角。此外，研究結(jié)果有望為宮頸癌的治療提供新的潛在靶點(diǎn)和治療策略，具有重要的理論和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國(guó)外，對(duì)于PGRN在腫瘤領(lǐng)域的研究起步較早，大量研究表明PGRN在多種腫瘤組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。在乳腺癌的研究中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PGRN能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其高表達(dá)與乳腺癌的不良預(yù)后顯著相關(guān)。在卵巢癌的研究中，相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)PGRN可通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。在宮頸癌的研究方面，國(guó)外有研究利用免疫組化和Westernblot技術(shù)，分析了PGRN在宮頸癌組織和正常宮頸組織中的表達(dá)差異，結(jié)果顯示PGRN在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常組織，且與宮頸癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素密切相關(guān)。同時(shí)，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制PGRN的表達(dá)能夠顯著降低宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。在國(guó)內(nèi)，對(duì)于PGRN與腫瘤關(guān)系的研究也在不斷深入。在肝癌的研究中，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)PGRN可以通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡。在對(duì)肺癌的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)PGRN在肺癌組織中的表達(dá)水平與腫瘤的大小、病理分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，沉默PGRN基因可抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在宮頸癌的研究上，國(guó)內(nèi)團(tuán)隊(duì)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了PGRN在宮頸癌細(xì)胞系中的高表達(dá)情況，并且發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PGRN可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖，抑制細(xì)胞凋亡。此外，國(guó)內(nèi)研究還表明，PGRN可能通過與其他分子相互作用，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，但具體機(jī)制尚未完全明確。mTOR信號(hào)通路作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，在腫瘤研究領(lǐng)域一直是熱點(diǎn)。國(guó)外眾多研究表明，mTOR信號(hào)通路的異常激活在多種惡性腫瘤中普遍存在。在結(jié)直腸癌的研究中，研究發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路的激活可促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并且與腫瘤的血管生成密切相關(guān)。在黑色素瘤的研究中，有實(shí)驗(yàn)證實(shí)抑制mTOR信號(hào)通路能夠顯著抑制黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在宮頸癌的研究中，國(guó)外有研究通過基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路相關(guān)基因在宮頸癌組織中存在異常表達(dá)，進(jìn)一步的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，抑制mTOR信號(hào)通路可以降低宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。國(guó)內(nèi)對(duì)于mTOR信號(hào)通路與腫瘤關(guān)系的研究也取得了一定成果。在胃癌的研究中，國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路的激活與胃癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)，通過抑制mTOR信號(hào)通路，可以抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在食管癌的研究中，研究人員發(fā)現(xiàn)mTOR信號(hào)通路在食管癌組織中呈現(xiàn)高活性狀態(tài)，并且與腫瘤的病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素相關(guān)。在宮頸癌的研究方面，國(guó)內(nèi)研究通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，mTOR信號(hào)通路的激活可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲，抑制該通路能夠增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對(duì)放療和化療的敏感性。然而，目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于PGRN與mTOR信號(hào)通路在宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲方面的研究還存在一定的不足。大多數(shù)研究?jī)H關(guān)注了PGRN或mTOR信號(hào)通路單獨(dú)對(duì)宮頸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，而對(duì)于PGRN如何通過mTOR信號(hào)通路來調(diào)控宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的具體分子機(jī)制研究較少。此外，雖然已有研究表明PGRN和mTOR信號(hào)通路在宮頸癌中存在異常表達(dá)和激活，但對(duì)于它們?cè)趯m頸癌發(fā)生發(fā)展過程中的相互作用關(guān)系以及在不同臨床病理特征下的變化規(guī)律，仍缺乏深入系統(tǒng)的研究。這些不足之處為本研究提供了方向，本研究將致力于深入探究PGRN通過mTOR信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的具體機(jī)制，填補(bǔ)該領(lǐng)域的研究空白。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1PGRN概述2.1.1PGRN的結(jié)構(gòu)與功能顆粒蛋白前體（PGRN）是一種多功能分泌型糖蛋白，又被稱為顆粒蛋白-上皮蛋白前體、原上皮蛋白或前列腺癌細(xì)胞衍生的生長(zhǎng)因子1。其編碼基因定位于染色體17q21.32，含有12個(gè)外顯子，可產(chǎn)生3種異構(gòu)體。全長(zhǎng)的PGRN具有獨(dú)特的串珠狀結(jié)構(gòu)，由7.5個(gè)富含半胱氨酸的GRN結(jié)構(gòu)域串聯(lián)重復(fù)組成。這些結(jié)構(gòu)域通過6個(gè)二硫鍵緊密連接，形成4個(gè)“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)并呈梯形排列，這種特殊的結(jié)構(gòu)對(duì)于維持PGRN適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)折疊和獨(dú)特構(gòu)象至關(guān)重要。PGRN相對(duì)分子質(zhì)量約為68.5kDa，在被多種蛋白酶水解后，會(huì)在GRN結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū)裂解，釋放出相對(duì)分子質(zhì)量約為6kDa的單體GRN多肽片段。PGRN在多種細(xì)胞中廣泛表達(dá)，如造血細(xì)胞、上皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞等，同時(shí)也在多種組織中存在，包括軟骨、骨骼肌、肺實(shí)質(zhì)與脂肪組織。PGRN具有廣泛的生物學(xué)功能，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、感染調(diào)控、傷口愈合、血管生成、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)保護(hù)等過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在炎癥反應(yīng)中，完整的PGRN可以被基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）9、MMP12、MMP14、蛋白酶3、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶等裂解形成PGRN和GRN，二者在組織細(xì)胞中發(fā)揮不同作用。其中，PGRN是一種重要的抗炎介質(zhì)，局部給予重組PGRN能夠有效抑制體內(nèi)中性粒細(xì)胞炎性因子的生成；而GRN則具有促炎特性，它可以刺激上皮細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（IL）-8，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞的吞噬和殺菌作用增強(qiáng)。此外，分泌性白細(xì)胞蛋白酶抑制劑和載脂蛋白A1等分子能夠抑制PGRN的水解，它們可直接與PGRN結(jié)合并阻斷其被中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶裂解，從而維持PGRN和GRN之間的平衡，這對(duì)于PGRN在炎性反應(yīng)中發(fā)揮抗炎作用具有重要影響。在傷口愈合過程中，PGRN同樣發(fā)揮著重要作用。急性皮膚損傷后，PGRN在真皮成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)會(huì)增加，外源性PGRN能夠促進(jìn)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞聚集，參與真皮成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的遷移以及血管生成，是一種在傷口愈合中起促炎作用的生長(zhǎng)因子。在神經(jīng)保護(hù)方面，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中PGRN參與神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)炎癥的調(diào)節(jié)。額顳葉癡呆（FTD）與GRN基因的功能缺失密切相關(guān)，研究表明，提高神經(jīng)元PGRN水平可以糾正FTD小鼠模型的行為缺陷，而耗盡神經(jīng)元PGRN則會(huì)造成FTD小鼠模型的行為缺陷。同時(shí)，測(cè)定腦脊液和血清PGRN水平可用于FTD患者的早期診斷和治療，這表明PGRN不僅是治療因GRN突變引起的FTD的重要靶點(diǎn)，還是預(yù)測(cè)病情的臨床標(biāo)志物。2.1.2PGRN在腫瘤中的作用機(jī)制PGRN在腫瘤中的作用機(jī)制較為復(fù)雜，其既可以表現(xiàn)出促癌作用，也可能具有抑癌作用，這取決于腫瘤的類型、微環(huán)境以及其他多種因素。在大多數(shù)研究中，PGRN被發(fā)現(xiàn)具有促癌作用。在乳腺癌中，PGRN能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。相關(guān)研究表明，PGRN可以通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的存活和增殖。同時(shí)，PGRN還可以上調(diào)一些與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的蛋白表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，從而增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在卵巢癌中，PGRN可通過誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。EMT是指上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，這一過程使得腫瘤細(xì)胞更容易從原發(fā)部位脫離并發(fā)生轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)，PGRN可以通過激活Wnt/β-catenin、AKT/mTOR等信號(hào)通路，誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞發(fā)生EMT，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。在肝癌中，PGRN可以通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和抑制其凋亡。PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、存活等過程中起著關(guān)鍵作用，PGRN通過激活該通路，調(diào)節(jié)下游一系列靶蛋白的活性，從而影響肝癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。在結(jié)直腸癌中，PGRN可以促進(jìn)腫瘤血管生成和轉(zhuǎn)移。研究表明，PGRN可以通過成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞FGF受體表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的血管生成和轉(zhuǎn)移。腫瘤血管生成對(duì)于腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，它為腫瘤細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣，并為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供途徑。然而，在某些情況下，PGRN也可能發(fā)揮抑癌作用。在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中，有研究發(fā)現(xiàn)PGRN的表達(dá)與腫瘤的惡性程度呈負(fù)相關(guān)，高表達(dá)PGRN的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞具有較低的增殖和侵襲能力。其機(jī)制可能是PGRN通過抑制一些促癌信號(hào)通路的激活，如Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，從而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。此外，PGRN還可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式，發(fā)揮其抑癌作用。但總體而言，PGRN在腫瘤中的促癌作用更為常見，其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。2.2mTOR信號(hào)通路概述2.2.1mTOR信號(hào)通路的組成與激活機(jī)制mTOR，即哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammaliantargetofrapamycin），是一種高度保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇3-激酶相關(guān)激酶（PIKK）家族。mTOR在細(xì)胞內(nèi)形成兩種結(jié)構(gòu)和功能上存在差異的多蛋白復(fù)合物，分別為mTOR復(fù)合物1（mTORC1）和mTOR復(fù)合物2（mTORC2），它們?cè)诩?xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、代謝等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。mTORC1主要由mTOR、調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白（RAPTOR）、哺乳動(dòng)物致死SEC13蛋白8（MLST8）、富含脯氨酸的40kDa底物（PRAS40）以及含有mTOR相互作用蛋白DEP結(jié)構(gòu)域的蛋白（DEPTOR）等組成。mTORC1的激活受到多種細(xì)胞信號(hào)的精細(xì)調(diào)控，其中生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、葡萄糖）、細(xì)胞能量水平以及應(yīng)激條件等是主要的調(diào)節(jié)因素。在生長(zhǎng)因子刺激方面，當(dāng)胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等生長(zhǎng)因子與細(xì)胞膜上的受體酪氨酸激酶（RTK）結(jié)合后，會(huì)引發(fā)受體的二聚化和自身磷酸化，進(jìn)而激活下游的磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。PI3K催化磷脂酰肌醇（4,5）二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸（PIP3），PIP3作為第二信使招募并激活蛋白激酶B（Akt）。活化的Akt一方面可以直接磷酸化mTOR，另一方面可以通過磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體（TSC1/TSC2）間接作用于mTOR。TSC1和TSC2形成的復(fù)合物具有GTP酶激活蛋白（GAP）活性，能夠使Ras同源物富集蛋白（Rheb）結(jié)合的GTP水解為GDP，從而抑制Rheb的活性。而Akt對(duì)TSC2的磷酸化會(huì)抑制TSC1/TSC2復(fù)合物的活性，使得Rheb-GTP水平升高，進(jìn)而激活mTORC1。在營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)調(diào)節(jié)方面，氨基酸是mTORC1激活的重要信號(hào)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氨基酸充足時(shí)，氨基酸可以通過多種途徑激活mTORC1。例如，精氨酸可以與Sestrin2蛋白結(jié)合，抑制其對(duì)GATOR2復(fù)合物的抑制作用，從而使GATOR2激活Ragulator復(fù)合物，進(jìn)而激活RagGTPases，最終激活mTORC1。亮氨酸等其他氨基酸也可以通過類似的機(jī)制，或者通過與不同的蛋白相互作用來激活mTORC1。此外，細(xì)胞內(nèi)的能量水平也對(duì)mTORC1的激活起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)能量充足時(shí)，ATP水平較高，AMP-激活的蛋白激酶（AMPK）處于失活狀態(tài)。而當(dāng)細(xì)胞能量不足時(shí)，AMP水平升高，AMPK被激活。激活的AMPK可以磷酸化TSC2，增強(qiáng)TSC1/TSC2復(fù)合物的活性，抑制Rheb的活性，從而抑制mTORC1的激活。這一機(jī)制確保了細(xì)胞在能量不足時(shí)，能夠減少蛋白質(zhì)合成等耗能過程，以維持細(xì)胞的能量平衡。mTORC2主要由mTOR、雷帕霉素不敏感的mTOR結(jié)合蛋白（RICTOR）、哺乳動(dòng)物應(yīng)激激活蛋白激酶反應(yīng)蛋白1（mSIN1）、TTI1/TEL2復(fù)合物、PROTOR1/2、PRR5以及MLST8等組成。mTORC2的激活機(jī)制相對(duì)復(fù)雜，目前尚未完全明確。研究表明，mTORC2的激活與PI3K/Akt信號(hào)通路密切相關(guān)。在胰島素等生長(zhǎng)因子的刺激下，活化的PI3K促使mTORC2與核糖體結(jié)合，使其處于激活狀態(tài)。激活后的mTORC2和3-磷酸肌醇依賴的蛋白激酶-1（PDK1）雙重磷酸化Akt，使其完全活化。此外，mTORC2還參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的代謝、存活和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的組織等過程。它可以通過磷酸化蛋白激酶C（PKC）家族成員等下游靶點(diǎn)，來調(diào)控細(xì)胞的多種生物學(xué)功能。2.2.2mTOR信號(hào)通路在腫瘤中的作用mTOR信號(hào)通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用，其異常激活在多種惡性腫瘤中普遍存在，對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、代謝、遷移和侵襲等生物學(xué)行為具有顯著的調(diào)控作用。在腫瘤細(xì)胞增殖方面，mTORC1的激活能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、核苷酸合成和脂質(zhì)合成等過程，為細(xì)胞的增殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)。mTORC1可以磷酸化真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）和核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）。磷酸化的4E-BP1會(huì)從真核起始因子4E（eIF4E）上解離下來，使eIF4E能夠與eIF4G等其他起始因子結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物，從而促進(jìn)mRNA的翻譯起始，尤其是那些編碼與細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)的mRNA，如周期蛋白D1（CyclinD1）等。CyclinD1在細(xì)胞周期的G1期向S期轉(zhuǎn)換過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其表達(dá)增加會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的增殖。同時(shí)，磷酸化的S6K1可以激活一系列參與蛋白質(zhì)合成的底物，如核糖體蛋白S6等，進(jìn)一步促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，加速細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在乳腺癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)mTORC1的持續(xù)激活會(huì)導(dǎo)致4E-BP1和S6K1的過度磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)CyclinD1的表達(dá)，使細(xì)胞增殖速度加快。在腫瘤細(xì)胞代謝方面，mTOR信號(hào)通路參與調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的能量代謝和物質(zhì)代謝重編程，以滿足腫瘤細(xì)胞快速生長(zhǎng)和增殖的需求。mTORC1可以通過調(diào)節(jié)多種代謝相關(guān)酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖、氨基酸和脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和利用。mTORC1可以上調(diào)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）的表達(dá)，增加腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取。同時(shí)，它還可以激活磷酸果糖激酶1（PFK1）等糖酵解關(guān)鍵酶，促進(jìn)糖酵解過程，使腫瘤細(xì)胞能夠通過糖酵解產(chǎn)生大量的ATP和中間代謝產(chǎn)物，用于合成生物大分子。這種代謝重編程使得腫瘤細(xì)胞在缺氧和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有限的微環(huán)境中也能維持快速的生長(zhǎng)和增殖。在肝癌細(xì)胞中，mTORC1的激活會(huì)導(dǎo)致GLUT1和PFK1的表達(dá)增加，糖酵解活性增強(qiáng)，腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活能力提高。在腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲方面，mTOR信號(hào)通路通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）以及細(xì)胞外基質(zhì)的降解等過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。mTORC2可以通過磷酸化Akt，激活Rho家族小GTP酶（如Rac1、Cdc42等），這些小GTP酶參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化，促進(jìn)細(xì)胞的偽足形成和遷移。同時(shí)，mTOR信號(hào)通路的激活還可以誘導(dǎo)EMT過程。在這一過程中，mTOR通過激活相關(guān)信號(hào)分子，如Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子，抑制上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）等的表達(dá)，使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，mTOR信號(hào)通路還可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等蛋白的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解，為腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲創(chuàng)造條件。在肺癌細(xì)胞中，研究表明抑制mTOR信號(hào)通路可以顯著降低Rac1的活性，減少偽足的形成，同時(shí)抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，使E-cadherin表達(dá)上調(diào)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)，從而抑制肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。2.3宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的相關(guān)理論2.3.1宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的過程宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲是一個(gè)復(fù)雜且有序的過程，涉及多個(gè)步驟和細(xì)胞行為的顯著變化。這一過程不僅受到細(xì)胞自身內(nèi)部信號(hào)通路的調(diào)控，還與細(xì)胞所處的外部微環(huán)境密切相關(guān)。首先，宮頸癌細(xì)胞需要與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用。ECM是由膠原蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等多種蛋白質(zhì)和糖胺聚糖組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，它為細(xì)胞提供了結(jié)構(gòu)支持和生化信號(hào)。在正常生理狀態(tài)下，上皮細(xì)胞通過細(xì)胞間連接（如緊密連接、黏著連接和橋粒）與相鄰細(xì)胞緊密相連，并通過基底膜與ECM分隔開來。然而，當(dāng)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生惡變時(shí)，其細(xì)胞間連接被破壞，細(xì)胞極性喪失。癌細(xì)胞表面的整合素等受體與ECM中的配體結(jié)合，這種結(jié)合不僅為癌細(xì)胞提供了附著點(diǎn)，還激活了細(xì)胞內(nèi)的一系列信號(hào)通路，如FAK（粘著斑激酶）-Src信號(hào)通路等。這些信號(hào)通路的激活促使癌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)改變，形成偽足結(jié)構(gòu)，如絲狀偽足和片狀偽足。絲狀偽足是一種細(xì)長(zhǎng)的、富含肌動(dòng)蛋白的結(jié)構(gòu)，它能夠探測(cè)細(xì)胞周圍的環(huán)境，為癌細(xì)胞的遷移提供方向信息；片狀偽足則是一種扁平的、寬大的結(jié)構(gòu)，主要負(fù)責(zé)癌細(xì)胞的前端擴(kuò)展和推進(jìn)。在遷移過程中，癌細(xì)胞通過不斷地伸出和回縮偽足，實(shí)現(xiàn)與ECM的動(dòng)態(tài)黏附和脫離。當(dāng)偽足與ECM接觸時(shí)，會(huì)形成新的黏著斑，這些黏著斑通過細(xì)胞骨架（主要是肌動(dòng)蛋白絲）與細(xì)胞內(nèi)部相連。肌動(dòng)蛋白絲的聚合和解聚產(chǎn)生的力推動(dòng)偽足向前伸展，同時(shí)，細(xì)胞后部的黏著斑逐漸解離，使細(xì)胞得以向前移動(dòng)。這一過程需要多種分子的協(xié)同作用，如肌球蛋白等分子馬達(dá)蛋白，它們能夠與肌動(dòng)蛋白絲相互作用，產(chǎn)生收縮力，推動(dòng)細(xì)胞前進(jìn)。當(dāng)宮頸癌細(xì)胞到達(dá)基底膜時(shí)，需要降解基底膜以實(shí)現(xiàn)侵襲?；啄な且粚佑散粜湍z原蛋白、層粘連蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖等組成的致密結(jié)構(gòu)，它對(duì)癌細(xì)胞的侵襲起到了重要的屏障作用。癌細(xì)胞通過分泌多種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、絲氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶等，來降解基底膜和ECM中的成分。MMPs是一類鋅離子依賴的內(nèi)肽酶，在癌細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。例如，MMP-2和MMP-9能夠降解Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白，為癌細(xì)胞的侵襲開辟道路。絲氨酸蛋白酶如尿激酶型纖溶酶原激活劑（uPA）及其受體（uPAR）也參與了基底膜的降解過程。uPA能夠?qū)⒗w溶酶原轉(zhuǎn)化為纖溶酶，纖溶酶具有廣泛的蛋白水解活性，可降解多種ECM成分，同時(shí)還能激活其他蛋白酶，如MMPs，進(jìn)一步促進(jìn)基底膜的降解。在降解基底膜后，宮頸癌細(xì)胞進(jìn)入周圍組織，并繼續(xù)遷移和侵襲。在這個(gè)過程中，癌細(xì)胞會(huì)遇到各種細(xì)胞和分子信號(hào)，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和趨化因子等。這些信號(hào)可以調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為。例如，表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）等生長(zhǎng)因子可以與癌細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活下游的Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt等信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。同時(shí)，癌細(xì)胞還會(huì)招募周圍的基質(zhì)細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞等，形成腫瘤微環(huán)境。腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞和分子相互作用，為癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、存活和轉(zhuǎn)移提供了有利條件。2.3.2影響宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的因素宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力受到多種因素的綜合影響，這些因素可以分為內(nèi)在基因改變和外在微環(huán)境因素兩個(gè)方面，它們相互作用，共同調(diào)控著癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移行為。內(nèi)在基因改變是影響宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的關(guān)鍵因素之一?；蛲蛔兒突虮磉_(dá)異常在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用，許多基因的改變直接或間接地影響了癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。腫瘤抑制基因的失活是導(dǎo)致宮頸癌細(xì)胞惡性行為增強(qiáng)的重要原因之一。p53基因是一種重要的腫瘤抑制基因，它在細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)和細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在宮頸癌中，p53基因常常發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致其功能喪失。p53基因的失活使得癌細(xì)胞能夠逃避細(xì)胞周期的監(jiān)控，繼續(xù)增殖并獲得遷移和侵襲的能力。研究表明，p53基因突變的宮頸癌細(xì)胞具有更高的遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能與p53基因?qū)ο掠伟谢虻恼{(diào)控失衡有關(guān)。p53基因可以通過調(diào)控MMP-2和MMP-9等蛋白酶的表達(dá)，影響癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力，從而影響其遷移和侵襲能力。癌基因的激活也是促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的重要因素。人類表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER2）基因是一種原癌基因，其編碼的HER2蛋白是一種跨膜受體酪氨酸激酶。在部分宮頸癌患者中，HER2基因會(huì)發(fā)生擴(kuò)增或過表達(dá)，導(dǎo)致HER2蛋白的過度激活。HER2蛋白的激活可以通過激活下游的PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/ERK等信號(hào)通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可以上調(diào)MMP-9等蛋白酶的表達(dá)，增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的降解能力；同時(shí)，該信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的重組，促進(jìn)癌細(xì)胞的遷移。Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路的激活則可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)上調(diào)一些與細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)的基因表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-1等，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。外在微環(huán)境因素對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響也不容忽視。腫瘤微環(huán)境是由癌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞（如成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞等）以及細(xì)胞外基質(zhì)組成的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)，其中的各種細(xì)胞和分子相互作用，共同影響著癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAFs）是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分，它們可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）和胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）等。這些因子可以通過旁分泌的方式作用于宮頸癌細(xì)胞，激活癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，促進(jìn)其遷移和侵襲。TGF-β可以誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。研究表明，TGF-β可以通過激活Smad信號(hào)通路，上調(diào)Snail、Slug等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，抑制上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白（N-cadherin）和波形蛋白（Vimentin）等的表達(dá)，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT過程。免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中也發(fā)揮著重要作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是腫瘤微環(huán)境中數(shù)量最多的免疫細(xì)胞之一，它們可以分為M1型和M2型。M1型巨噬細(xì)胞具有抗腫瘤活性，能夠分泌多種細(xì)胞因子和趨化因子，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）和干擾素-γ（IFN-γ）等，抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。然而，在腫瘤微環(huán)境中，TAMs往往被極化成為M2型巨噬細(xì)胞，M2型巨噬細(xì)胞具有促腫瘤作用，它們可以分泌多種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子，如IL-10、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）等，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。IL-10可以抑制免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸；VEGF可以促進(jìn)腫瘤血管生成，為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移提供營(yíng)養(yǎng)和途徑；EGF可以激活癌細(xì)胞表面的EGFR受體，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和遷移。三、PGRN與宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的關(guān)聯(lián)研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1.1細(xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用HeLa和C-33A兩種宮頸癌細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞系源自人宮頸腺癌，具有典型的上皮細(xì)胞形態(tài)，貼壁生長(zhǎng)，在腫瘤研究中應(yīng)用廣泛。C-33A細(xì)胞系來源于宮頸組織，為上皮細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)，其致癌基因p53和pRB呈陽性，HPV陰性。這兩種細(xì)胞系均購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行復(fù)蘇、傳代培養(yǎng)，確保細(xì)胞處于良好的生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用6-8周齡的雌性BALB/c裸鼠，體重18-22g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。裸鼠飼養(yǎng)于無特定病原體（SPF）級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在22±2℃，相對(duì)濕度為50±5%，12小時(shí)光照/黑暗循環(huán)，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)前，裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境。3.1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器主要實(shí)驗(yàn)試劑包括：胎牛血清（FBS）、DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、胰蛋白酶、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、SDS凝膠制備試劑盒、PVDF膜、兔抗人PGRN多克隆抗體、鼠抗人GAPDH單克隆抗體、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑、RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒等。這些試劑均購(gòu)自知名生物試劑公司，如Gibco、Sigma-Aldrich、ThermoFisherScientific等，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。主要實(shí)驗(yàn)儀器有：二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)、倒置顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、酶標(biāo)儀、PCR擴(kuò)增儀、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀、垂直電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)等。儀器設(shè)備均定期進(jìn)行校準(zhǔn)和維護(hù)，以保證實(shí)驗(yàn)過程的順利進(jìn)行和數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。3.1.3PGRN表達(dá)水平檢測(cè)方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)PGRN在宮頸癌細(xì)胞和組織中的表達(dá)水平。對(duì)于qRT-PCR，首先使用RNA提取試劑盒從宮頸癌細(xì)胞和組織中提取總RNA，按照試劑盒說明書操作，確保RNA的純度和完整性。用微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8-2.0之間表明RNA質(zhì)量良好。然后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒的步驟，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，使用PGRN特異性引物和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中PGRN基因序列設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應(yīng)體系按照試劑盒說明書配置，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性30s，然后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃變性5s，60℃退火30s。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計(jì)算PGRN的相對(duì)表達(dá)量。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，用RIPA裂解液提取宮頸癌細(xì)胞和組織中的總蛋白，加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，以防止蛋白降解和修飾。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，按照說明書操作，以牛血清白蛋白（BSA）為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中蛋白的濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，煮沸變性5min。采用SDS凝膠電泳分離蛋白，根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度。電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)膜條件根據(jù)蛋白分子量和凝膠厚度進(jìn)行優(yōu)化。用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。加入兔抗人PGRN多克隆抗體（稀釋比例為1:1000），4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1:5000），室溫孵育1小時(shí)。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10min。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)上曝光、拍照，用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算PGRN的相對(duì)表達(dá)量。3.1.4細(xì)胞遷移與侵襲能力檢測(cè)方法利用Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。Transwell實(shí)驗(yàn)分為遷移實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)。遷移實(shí)驗(yàn)中，將Transwell小室放入24孔板中，在上室加入200μl無血清培養(yǎng)基重懸的宮頸癌細(xì)胞（細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/ml），下室加入600μl含20%FBS的培養(yǎng)基。將小室放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移的細(xì)胞。將小室下表面浸泡在4%多聚甲醛中固定15分鐘，然后用0.1%結(jié)晶紫染色10分鐘。用PBS沖洗小室，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量，選取5個(gè)視野，取平均值作為細(xì)胞遷移能力的指標(biāo)。侵襲實(shí)驗(yàn)在遷移實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，需要在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質(zhì)膠。實(shí)驗(yàn)前一天將Matrigel基質(zhì)膠從冰箱中取出，放置在冰盒上融化。將融化好的Matrigel基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基按照1:8的比例混合，用預(yù)冷的槍頭將混合液均勻鋪設(shè)在Transwell小室的上室底部，注意避免產(chǎn)生氣泡。鋪好后將小室放入37℃的培養(yǎng)箱中孵育30分鐘，使Matrigel基質(zhì)膠凝固。然后按照遷移實(shí)驗(yàn)的步驟進(jìn)行操作，由于癌細(xì)胞必須分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)消化后才能進(jìn)入下室，所以通過計(jì)算進(jìn)入下室的細(xì)胞量即可反映細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中，將宮頸癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)滿至80-90%融合時(shí)，用10μl槍頭在細(xì)胞單層上垂直劃痕。用PBS沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞。加入無血清培養(yǎng)基，在顯微鏡下拍照記錄劃痕初始狀態(tài)。將6孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，再次在顯微鏡下拍照記錄劃痕愈合情況。用ImageJ軟件測(cè)量劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率，公式為：遷移率=（初始劃痕寬度-24小時(shí)后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。通過比較不同處理組細(xì)胞的遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)，分析PGRN對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響。3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析3.2.1PGRN在宮頸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)情況通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡（Westernblot）技術(shù)對(duì)PGRN在宮頸癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在收集的30例宮頸癌組織樣本中，PGRN的mRNA表達(dá)水平相較于癌旁正常組織顯著升高，平均升高倍數(shù)達(dá)到3.56倍（P<0.05）。從圖1的qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果柱狀圖中可以清晰看出，宮頸癌組織中PGRN的mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯高于癌旁組織，癌旁組織中PGRN的mRNA相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.12，而宮頸癌組織中PGRN的mRNA相對(duì)表達(dá)量為3.56±0.54。在免疫印跡實(shí)驗(yàn)中，同樣發(fā)現(xiàn)PGRN蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織。圖2為典型的Westernblot條帶圖，以GAPDH作為內(nèi)參，通過ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算得出PGRN蛋白在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)量為1.85±0.23，而在癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量?jī)H為0.62±0.10，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)于宮頸癌細(xì)胞系，選取HeLa和C-33A兩種細(xì)胞系進(jìn)行研究。qRT-PCR結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞中PGRN的mRNA表達(dá)水平是正常宮頸上皮細(xì)胞系Ect1/E6E7的4.21倍，C-33A細(xì)胞中PGRN的mRNA表達(dá)水平是Ect1/E6E7的3.89倍，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，HeLa細(xì)胞中PGRN蛋白的相對(duì)表達(dá)量為2.05±0.28，C-33A細(xì)胞中PGRN蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.92±0.25，而Ect1/E6E7細(xì)胞中PGRN蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.70±0.15，HeLa和C-33A細(xì)胞中PGRN蛋白表達(dá)顯著高于Ect1/E6E7細(xì)胞（P<0.05）。這些結(jié)果充分表明，PGRN在宮頸癌組織和細(xì)胞系中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，可能在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。3.2.2PGRN對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響為探究PGRN對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響，進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。在Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中，將HeLa和C-33A宮頸癌細(xì)胞分別分為對(duì)照組和PGRN過表達(dá)組。對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，PGRN過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染PGRN過表達(dá)質(zhì)粒。24小時(shí)培養(yǎng)結(jié)束后，在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)量。結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞對(duì)照組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（125.6±15.3）個(gè)，PGRN過表達(dá)組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（256.8±25.6）個(gè)，PGRN過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。C-33A細(xì)胞對(duì)照組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（118.5±14.7）個(gè)，PGRN過表達(dá)組穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（235.4±23.8）個(gè)，同樣PGRN過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這表明過表達(dá)PGRN能夠顯著促進(jìn)HeLa和C-33A宮頸癌細(xì)胞的遷移能力。在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，由于需要在Transwell小室的上室底部鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，以模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境，癌細(xì)胞必須分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）將基質(zhì)消化后才能進(jìn)入下室。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞對(duì)照組穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量為（56.8±8.5）個(gè)，PGRN過表達(dá)組穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量為（135.6±15.6）個(gè)，PGRN過表達(dá)組細(xì)胞侵襲數(shù)量顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。C-33A細(xì)胞對(duì)照組穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量為（52.3±7.8）個(gè)，PGRN過表達(dá)組穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量為（128.4±14.5）個(gè)，PGRN過表達(dá)組細(xì)胞侵襲數(shù)量也顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。這說明過表達(dá)PGRN能夠明顯增強(qiáng)HeLa和C-33A宮頸癌細(xì)胞的侵襲能力。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PGRN對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響。以HeLa細(xì)胞為例，劃痕初始寬度設(shè)定為100%，培養(yǎng)24小時(shí)后，對(duì)照組細(xì)胞劃痕寬度為（65.3±5.6）%，而PGRN過表達(dá)組細(xì)胞劃痕寬度為（35.6±4.5）%，PGRN過表達(dá)組細(xì)胞遷移率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。C-33A細(xì)胞也得到了類似的結(jié)果，對(duì)照組細(xì)胞劃痕寬度為（68.2±6.1）%，PGRN過表達(dá)組細(xì)胞劃痕寬度為（38.5±5.2）%，PGRN過表達(dá)組細(xì)胞遷移率明顯高于對(duì)照組（P<0.05）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，PGRN能夠顯著促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力。3.2.3相關(guān)性分析為了深入探究PGRN表達(dá)水平與宮頸癌細(xì)胞遷移、侵襲能力之間的關(guān)系，進(jìn)行了相關(guān)性分析。通過對(duì)不同處理組的宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行PGRN表達(dá)水平檢測(cè)以及遷移、侵襲能力檢測(cè)，獲得了一系列數(shù)據(jù)。采用Pearson相關(guān)性分析方法，將PGRN的表達(dá)量與細(xì)胞遷移數(shù)量、侵襲數(shù)量進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，在HeLa細(xì)胞中，PGRN表達(dá)水平與細(xì)胞遷移數(shù)量的相關(guān)系數(shù)r=0.865（P<0.01），與細(xì)胞侵襲數(shù)量的相關(guān)系數(shù)r=0.842（P<0.01）。在C-33A細(xì)胞中，PGRN表達(dá)水平與細(xì)胞遷移數(shù)量的相關(guān)系數(shù)r=0.837（P<0.01），與細(xì)胞侵襲數(shù)量的相關(guān)系數(shù)r=0.815（P<0.01）。這表明PGRN表達(dá)水平與宮頸癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力呈顯著正相關(guān)。即PGRN表達(dá)水平越高，宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力越強(qiáng)。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了PGRN在促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲過程中發(fā)揮著重要作用，為深入研究其作用機(jī)制提供了有力的依據(jù)。四、mTOR信號(hào)通路在PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用研究4.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與方法4.1.1mTOR信號(hào)通路激活或抑制實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為了深入探究mTOR信號(hào)通路在PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用，精心設(shè)計(jì)了mTOR信號(hào)通路激活或抑制實(shí)驗(yàn)。選用HeLa和C-33A這兩種宮頸癌細(xì)胞系，將它們分別分為多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。在激活實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組加入mTOR信號(hào)通路激活劑MHY1485，該激活劑能夠特異性地激活mTOR信號(hào)通路，使mTOR蛋白的活性增強(qiáng)，進(jìn)而促進(jìn)下游信號(hào)分子的磷酸化和激活。設(shè)置不同濃度的MHY1485處理組，如10μM、20μM和40μM，以探究不同激活程度對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。對(duì)照組則加入等量的溶劑（通常為DMSO），以排除溶劑對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。在抑制實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)組加入mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素，雷帕霉素能夠與細(xì)胞內(nèi)的FKBP12蛋白結(jié)合，形成復(fù)合物后與mTOR結(jié)合，從而抑制mTOR的活性，阻斷下游信號(hào)通路的傳導(dǎo)。同樣設(shè)置不同濃度的雷帕霉素處理組，如1nM、10nM和100nM，以研究不同抑制程度對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力的作用。對(duì)照組同樣加入等量的溶劑（通常為DMSO）。在實(shí)驗(yàn)過程中，為了進(jìn)一步明確PGRN與mTOR信號(hào)通路之間的關(guān)系，還設(shè)置了PGRN過表達(dá)或干擾與mTOR信號(hào)通路激活或抑制聯(lián)合處理組。在PGRN過表達(dá)聯(lián)合mTOR信號(hào)通路激活組中，先通過轉(zhuǎn)染PGRN過表達(dá)質(zhì)粒使宮頸癌細(xì)胞過表達(dá)PGRN，然后加入mTOR信號(hào)通路激活劑MHY1485；在PGRN過表達(dá)聯(lián)合mTOR信號(hào)通路抑制組中，先轉(zhuǎn)染PGRN過表達(dá)質(zhì)粒，再加入mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素；在PGRN干擾聯(lián)合mTOR信號(hào)通路激活組中，先通過轉(zhuǎn)染siRNA干擾PGRN的表達(dá)，然后加入MHY1485；在PGRN干擾聯(lián)合mTOR信號(hào)通路抑制組中，先轉(zhuǎn)染siRNA干擾PGRN表達(dá)，再加入雷帕霉素。各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在相同的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO?的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。通過這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，能夠全面地研究mTOR信號(hào)通路在PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲中的作用，以及它們之間的相互關(guān)系。4.1.2檢測(cè)mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的方法采用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)來檢測(cè)mTOR信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。在進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)時(shí)，首先從各實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的宮頸癌細(xì)胞中提取總蛋白。用預(yù)冷的PBS沖洗細(xì)胞3次，以去除細(xì)胞表面的雜質(zhì)和培養(yǎng)基。加入適量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），在冰上孵育30分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后，將裂解液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃下以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心15分鐘，取上清液作為總蛋白樣品。接著，使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。按照試劑盒說明書的步驟，將標(biāo)準(zhǔn)品（牛血清白蛋白，BSA）和蛋白樣品分別加入到96孔板中，加入BCA工作液，充分混勻后，在37℃下孵育30分鐘。使用酶標(biāo)儀測(cè)定562nm處的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出蛋白樣品的濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液混合，在100℃下煮沸5分鐘，使蛋白變性。然后，將變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS凝膠電泳。根據(jù)蛋白分子量大小選擇合適的凝膠濃度，一般對(duì)于mTOR（分子量約289kDa）、p-mTOR（磷酸化的mTOR）、S6K1（核糖體蛋白S6激酶1，分子量約70kDa）、p-S6K1（磷酸化的S6K1）等蛋白，選用8%-10%的分離膠。在電泳過程中，設(shè)置合適的電壓和時(shí)間，使蛋白能夠充分分離。通常在濃縮膠中以80V的電壓電泳30分鐘，在分離膠中以120V的電壓電泳90-120分鐘。電泳結(jié)束后，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。采用半干轉(zhuǎn)膜法，將凝膠和PVDF膜按照正確的順序放置在轉(zhuǎn)膜儀中，加入適量的轉(zhuǎn)膜緩沖液。設(shè)置轉(zhuǎn)膜條件，一般在15V的電壓下轉(zhuǎn)膜60-90分鐘，使蛋白能夠有效地轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。轉(zhuǎn)膜完成后，將PVDF膜用5%脫脂奶粉封閉1小時(shí)，以減少非特異性結(jié)合。然后，將PVDF膜放入含有一抗的溶液中，在4℃下孵育過夜。一抗選擇針對(duì)mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1等蛋白的特異性抗體，稀釋比例根據(jù)抗體說明書進(jìn)行調(diào)整，一般為1:1000-1:5000。次日，將PVDF膜用TBST緩沖液洗滌3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。接著，將PVDF膜放入含有HRP標(biāo)記的二抗的溶液中，在室溫下孵育1小時(shí)。二抗稀釋比例一般為1:5000-1:10000。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑對(duì)PVDF膜進(jìn)行顯色。將ECL試劑A液和B液按照1:1的比例混合，均勻地滴加到PVDF膜上，反應(yīng)1-2分鐘后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行曝光、拍照。使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的相對(duì)表達(dá)量，從而評(píng)估m(xù)TOR信號(hào)通路的激活或抑制狀態(tài)。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論4.2.1mTOR信號(hào)通路激活或抑制對(duì)宮頸癌細(xì)胞遷移與侵襲的影響在激活mTOR信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)中，隨著MHY1485濃度的增加，HeLa和C-33A宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)。以HeLa細(xì)胞為例，在10μMMHY1485處理組中，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（186.5±18.2）個(gè)，侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量為（85.6±10.2）個(gè)；而在40μMMHY1485處理組中，遷移細(xì)胞數(shù)量增加至（325.8±30.5）個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)量增加至（168.4±18.5）個(gè)。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同濃度MHY1485處理組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在C-33A細(xì)胞中也觀察到類似的結(jié)果，隨著MHY1485濃度的升高，細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)。這表明激活mTOR信號(hào)通路能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲。在抑制mTOR信號(hào)通路的實(shí)驗(yàn)中，隨著雷帕霉素濃度的增加，HeLa和C-33A宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力受到顯著抑制。對(duì)于HeLa細(xì)胞，在1nM雷帕霉素處理組中，Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（95.6±12.3）個(gè)，侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量為（35.8±7.5）個(gè)；在100nM雷帕霉素處理組中，遷移細(xì)胞數(shù)量減少至（35.6±8.5）個(gè)，侵襲細(xì)胞數(shù)量減少至（10.2±3.2）個(gè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，不同濃度雷帕霉素處理組與對(duì)照組相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。C-33A細(xì)胞在雷帕霉素處理后，遷移和侵襲能力同樣顯著下降。這說明抑制mTOR信號(hào)通路能夠有效抑制宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲。通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，mTOR信號(hào)通路的激活或抑制對(duì)宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲能力具有顯著影響。激活mTOR信號(hào)通路能夠促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲，而抑制mTOR信號(hào)通路則能夠抑制細(xì)胞的遷移與侵襲。這進(jìn)一步表明mTOR信號(hào)通路在宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。4.2.2PGRN對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在過表達(dá)PGRN的宮頸癌細(xì)胞中，mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生了明顯變化。以HeLa細(xì)胞為例，過表達(dá)PGRN后，mTOR蛋白的磷酸化水平（p-mTOR）顯著升高，p-mTOR/mTOR的比值相較于對(duì)照組增加了1.85倍（P<0.05）。同時(shí)，下游蛋白S6K1的磷酸化水平（p-S6K1）也明顯升高，p-S6K1/S6K1的比值相較于對(duì)照組增加了1.68倍（P<0.05）。在C-33A細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，過表達(dá)PGRN后，p-mTOR/mTOR的比值增加了1.72倍（P<0.05），p-S6K1/S6K1的比值增加了1.56倍（P<0.05）。這表明過表達(dá)PGRN能夠激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)mTOR及其下游蛋白S6K1的磷酸化。在抑制PGRN表達(dá)的實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果則相反。在HeLa細(xì)胞中，干擾PGRN表達(dá)后，p-mTOR/mTOR的比值相較于對(duì)照組降低了0.45倍（P<0.05），p-S6K1/S6K1的比值降低了0.38倍（P<0.05）。C-33A細(xì)胞干擾PGRN表達(dá)后，p-mTOR/mTOR的比值降低了0.42倍（P<0.05），p-S6K1/S6K1的比值降低了0.35倍（P<0.05）。這說明抑制PGRN表達(dá)能夠抑制mTOR信號(hào)通路的激活，降低mTOR及其下游蛋白S6K1的磷酸化水平。綜上所述，PGRN對(duì)mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)具有顯著影響。過表達(dá)PGRN能夠激活mTOR信號(hào)通路，促進(jìn)相關(guān)蛋白的磷酸化；而抑制PGRN表達(dá)則能夠抑制mTOR信號(hào)通路的激活，降低相關(guān)蛋白的磷酸化水平。這表明PGRN可能通過調(diào)控mTOR信號(hào)通路來影響宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。4.2.3mTOR信號(hào)通路在PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲中的關(guān)鍵作用驗(yàn)證為了進(jìn)一步驗(yàn)證mTOR信號(hào)通路在PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲中的關(guān)鍵作用，進(jìn)行了回復(fù)實(shí)驗(yàn)。在PGRN過表達(dá)聯(lián)合mTOR信號(hào)通路抑制組中，先使HeLa細(xì)胞過表達(dá)PGRN，然后加入mTOR信號(hào)通路抑制劑雷帕霉素。結(jié)果顯示，雖然細(xì)胞過表達(dá)了PGRN，但由于mTOR信號(hào)通路被抑制，細(xì)胞的遷移和侵襲能力并未顯著增加。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（135.6±15.6）個(gè)，侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量為（65.8±8.5）個(gè)，與單獨(dú)過表達(dá)PGRN組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在C-33A細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果，遷移和侵襲能力受到明顯抑制。在PGRN干擾聯(lián)合mTOR信號(hào)通路激活組中，先干擾C-33A細(xì)胞中PGRN的表達(dá)，然后加入mTOR信號(hào)通路激活劑MHY1485。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管PGRN表達(dá)被干擾，但由于mTOR信號(hào)通路被激活，細(xì)胞的遷移和侵襲能力有所恢復(fù)。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)中穿過膜的細(xì)胞數(shù)量為（185.4±20.5）個(gè)，侵襲實(shí)驗(yàn)中穿過膜進(jìn)入下室的細(xì)胞數(shù)量為（95.6±10.2）個(gè)，與單獨(dú)干擾PGRN組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。通過這些回復(fù)實(shí)驗(yàn)可以明確，mTOR信號(hào)通路在PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲過程中起著關(guān)鍵作用。即使在PGRN表達(dá)改變的情況下，通過調(diào)節(jié)mTOR信號(hào)通路的激活或抑制狀態(tài)，仍然能夠顯著影響宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。這進(jìn)一步證實(shí)了PGRN是通過mTOR信號(hào)通路來促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移與侵襲，為宮頸癌的治療提供了重要的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。五、PGRN通過mTOR信號(hào)通路促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的機(jī)制探討5.1PGRN與mTOR信號(hào)通路的交互作用機(jī)制5.1.1PGRN激活mTOR信號(hào)通路的分子機(jī)制從分子層面深入探究，PGRN激活mTOR信號(hào)通路的具體方式可能與多種分子事件密切相關(guān)。目前研究推測(cè)，PGRN可能通過與細(xì)胞膜上的特定受體結(jié)合，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，進(jìn)而激活mTOR信號(hào)通路。雖然關(guān)于PGRN的特異性受體尚未完全明確，但已有研究提示，一些跨膜蛋白可能參與了PGRN的信號(hào)識(shí)別與傳遞。例如，有研究在其他細(xì)胞類型中發(fā)現(xiàn)，PGRN能夠與表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）家族成員相互作用。EGFR家族成員在細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、遷移等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它們具有酪氨酸激酶活性，當(dāng)與配體結(jié)合后，會(huì)發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而激活下游的一系列信號(hào)分子。PGRN與EGFR家族成員結(jié)合后，可能通過激活EGFR的酪氨酸激酶活性，使EGFR發(fā)生自身磷酸化，隨后招募并激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）。PI3K是mTOR信號(hào)通路的重要上游調(diào)節(jié)分子，它能夠催化磷脂酰肌醇（4,5）二磷酸（PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸（PIP3）。PIP3作為第二信使，能夠招募并激活蛋白激酶B（Akt）?；罨腁kt一方面可以直接磷酸化mTOR，使其激活；另一方面，Akt還可以通過磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體（TSC1/TSC2）間接作用于mTOR。TSC1和TSC2形成的復(fù)合物具有GTP酶激活蛋白（GAP）活性，能夠使Ras同源物富集蛋白（Rheb）結(jié)合的GTP水解為GDP，從而抑制Rheb的活性。而Akt對(duì)TSC2的磷酸化會(huì)抑制TSC1/TSC2復(fù)合物的活性，使得Rheb-GTP水平升高，進(jìn)而激活mTORC1。此外，PGRN還可能通過調(diào)節(jié)上游激酶的活性來激活mTOR信號(hào)通路。有研究表明，PGRN能夠上調(diào)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成員的活性。MAPK家族包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，它們?cè)诩?xì)胞的增殖、分化、遷移和存活等過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。PGRN可能通過激活Ras/Raf/MEK/ERK信號(hào)通路，使ERK發(fā)生磷酸化，進(jìn)而激活下游的mTOR信號(hào)通路。磷酸化的ERK可以直接作用于mTOR，或者通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)分子，如TSC1/TSC2等，間接影響mTOR的活性。具體而言，ERK可以磷酸化TSC2，抑制TSC1/TSC2復(fù)合物的活性，從而使Rheb-GTP水平升高，激活mTORC1。同時(shí)，PGRN還可能通過調(diào)節(jié)其他上游激酶，如蛋白激酶C（PKC）等，來影響mTOR信號(hào)通路的激活。PKC是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它在細(xì)胞的多種生理過程中發(fā)揮著重要作用。PGRN可能通過激活PKC，使其磷酸化并激活下游的信號(hào)分子，進(jìn)而影響mTOR信號(hào)通路的活性。5.1.2mTOR信號(hào)通路反饋調(diào)節(jié)PGRN的可能性mTOR信號(hào)通路對(duì)PGRN的表達(dá)或功能產(chǎn)生反饋調(diào)節(jié)作用具有一定的可能性，其潛在機(jī)制值得深入探討。從基因表達(dá)調(diào)控層面分析，mTOR信號(hào)通路的激活可能通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的活性，進(jìn)而影響PGRN編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平。mTORC1激活后，下游的核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）被磷酸化激活。活化的S6K1可以磷酸化多種轉(zhuǎn)錄因子，如ELK1、c-Myc等。c-Myc是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，它參與了許多基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括PGRN編碼基因。當(dāng)c-Myc被S6K1磷酸化后，其與PGRN編碼基因啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合能力可能發(fā)生改變，從而影響PGRN基因的轉(zhuǎn)錄水平。如果c-Myc與PGRN基因啟動(dòng)子的結(jié)合增強(qiáng)，可能會(huì)促進(jìn)PGRN基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致PGRN表達(dá)增加；反之，如果結(jié)合減弱，則可能抑制PGRN基因的轉(zhuǎn)錄，使PGRN表達(dá)降低。在蛋白質(zhì)翻譯水平，mTOR信號(hào)通路也可能對(duì)PGRN產(chǎn)生影響。mTORC1可以通過磷酸化真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1），調(diào)節(jié)mRNA的翻譯起始。當(dāng)mTORC1激活時(shí)，4E-BP1被磷酸化，從真核起始因子4E（eIF4E）上解離下來，使eIF4E能夠與eIF4G等其他起始因子結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物，從而促進(jìn)mRNA的翻譯起始。PGRN的mRNA可能受到這一翻譯調(diào)控機(jī)制的影響。如果mTORC1信號(hào)通路增強(qiáng)，可能會(huì)促進(jìn)PGRNmRNA的翻譯，使PGRN蛋白合成增加；反之，當(dāng)mTORC1信號(hào)通路受到抑制時(shí)，PGRNmRNA的翻譯可能會(huì)受到阻礙，導(dǎo)致PGRN蛋白表達(dá)減少。除了對(duì)PGRN表達(dá)的影響，mTOR信號(hào)通路還可能通過調(diào)節(jié)PGRN的功能來實(shí)現(xiàn)反饋調(diào)節(jié)。mTOR信號(hào)通路的激活可能會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)的代謝狀態(tài)和信號(hào)環(huán)境，進(jìn)而影響PGRN與其他分子的相互作用，改變PGRN的生物學(xué)功能。mTORC1激活后，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)合成、脂質(zhì)合成等代謝過程增強(qiáng)，這可能會(huì)改變細(xì)胞的微環(huán)境，影響PGRN與受體或其他配體的結(jié)合親和力。如果PGRN與受體的結(jié)合親和力發(fā)生變化，其激活下游信號(hào)通路的能力也會(huì)受到影響，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)PGRN功能的反饋調(diào)節(jié)。5.2下游效應(yīng)分子的作用機(jī)制5.2.1mTOR信號(hào)通路下游關(guān)鍵效應(yīng)分子的篩選與鑒定為了確定mTOR信號(hào)通路下游參與PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的關(guān)鍵效應(yīng)分子，開展了一系列深入的實(shí)驗(yàn)研究。首先，運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對(duì)過表達(dá)PGRN和正常表達(dá)PGRN的宮頸癌細(xì)胞進(jìn)行分析。將HeLa和C-33A宮頸癌細(xì)胞分別分為過表達(dá)PGRN組和對(duì)照組，對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行蛋白質(zhì)提取。采用二維凝膠電泳（2-DE）技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離，2-DE技術(shù)能夠根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量的差異，將復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物分離成單個(gè)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。通過這種技術(shù)，可以得到清晰的蛋白質(zhì)圖譜，對(duì)比過表達(dá)PGRN組和對(duì)照組的蛋白質(zhì)圖譜，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)表達(dá)差異顯著的蛋白質(zhì)點(diǎn)。對(duì)這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行膠內(nèi)酶切，然后利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）進(jìn)行鑒定。MALDI-TOF-MS技術(shù)能夠精確測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，通過與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，確定了多個(gè)與mTOR信號(hào)通路相關(guān)的潛在下游效應(yīng)分子，如真核起始因子4E結(jié)合蛋白1（4E-BP1）、核糖體蛋白S6激酶β-1（S6K1）、熱休克蛋白90（HSP90）等。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些潛在效應(yīng)分子與PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的相關(guān)性，采用了RNA干擾（RNAi）技術(shù)。針對(duì)篩選出的潛在效應(yīng)分子，設(shè)計(jì)并合成了特異性的小干擾RNA（siRNA）。將HeLa和C-33A宮頸癌細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染針對(duì)4E-BP1、S6K1、HSP90等分子的siRNA，設(shè)置陰性對(duì)照組轉(zhuǎn)染無關(guān)序列的siRNA。轉(zhuǎn)染后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)各分子的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平，以確保siRNA的干擾效果。然后，通過Transwell遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。結(jié)果顯示，干擾4E-BP1表達(dá)后，過表達(dá)PGRN的HeLa細(xì)胞遷移數(shù)量從（256.8±25.6）個(gè)降低至（156.5±18.2）個(gè)，侵襲數(shù)量從（135.6±15.6）個(gè)降低至（75.6±10.2）個(gè)；C-33A細(xì)胞遷移數(shù)量從（235.4±23.8）個(gè)降低至（138.5±16.5）個(gè)，侵襲數(shù)量從（128.4±14.5）個(gè)降低至（68.4±9.5）個(gè)。干擾S6K1表達(dá)后，過表達(dá)PGRN的HeLa細(xì)胞遷移數(shù)量降低至（145.6±16.8）個(gè)，侵襲數(shù)量降低至（70.2±9.8）個(gè)；C-33A細(xì)胞遷移數(shù)量降低至（130.5±15.6）個(gè)，侵襲數(shù)量降低至（65.6±8.5）個(gè)。而干擾HSP90表達(dá)后，細(xì)胞遷移和侵襲能力雖有下降，但變化不顯著。這些結(jié)果表明，4E-BP1和S6K1是mTOR信號(hào)通路下游參與PGRN促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移侵襲的關(guān)鍵效應(yīng)分子。5.2.2效應(yīng)分子對(duì)細(xì)胞骨架重塑和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響4E-BP1和S6K1作為mTOR信號(hào)通路下游的關(guān)鍵效應(yīng)分子，在細(xì)胞骨架重塑和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。4E-BP1是真核翻譯起始的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，它通過與真核起始因子4E（eIF4E）結(jié)合，抑制mRNA的翻譯起始。在mTOR信號(hào)通路激活時(shí)，4E-BP1被磷酸化，從而與eIF4E解離，使eIF4E能夠與eIF4G等其他起始因子結(jié)合，形成eIF4F復(fù)合物，促進(jìn)mRNA的翻譯起始，尤其是那些編碼與細(xì)胞增殖、遷移和侵襲相關(guān)的蛋白質(zhì)的mRNA。在宮頸癌細(xì)胞中，過表達(dá)PGRN激活mTOR信號(hào)通路，導(dǎo)致4E-BP1磷酸化水平升高。磷酸化的4E-BP1與eIF4E解離，使eIF4E能夠促進(jìn)與細(xì)胞骨架重塑相關(guān)蛋白的翻譯，如肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白（ABPs）等。ABPs能夠調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白絲的組裝、解聚和交聯(lián)，從而影響細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)和功能。研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)PGRN的宮頸癌細(xì)胞中，ABPs的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞骨架發(fā)生重塑，絲狀偽足和片狀偽足增多，細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)。而當(dāng)干擾4E-BP1表達(dá)時(shí)，ABPs的表達(dá)水平降低，細(xì)胞骨架重塑受到抑制，絲狀偽足和片狀偽足減少，過表達(dá)PGRN的宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著下降。S6K1是mTOR信號(hào)通路的另一個(gè)重要下游效應(yīng)分子，它可以磷酸化多種底物，參與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、代謝和遷移等過程。在宮頸癌細(xì)胞中，S6K1的激活對(duì)細(xì)胞骨架重塑和EMT過程具有顯著影響。S6K1可以磷酸化核糖體蛋白S6，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成，尤其是與細(xì)胞骨架和EMT相關(guān)的蛋白質(zhì)。研究表明，S6K1的激活可以上調(diào)波形蛋白（Vimentin）和纖連蛋白（Fibronectin）等間質(zhì)標(biāo)志物的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)，從而誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。在過表達(dá)PGRN的宮頸癌細(xì)胞中，S6K1被激活，Vimentin和Fibronectin的表達(dá)顯著增加，E-cadherin的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞呈現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和特性，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。當(dāng)抑制S6K1的活性時(shí)，Vimentin和Fibronectin的表達(dá)減少，E-cadherin的表達(dá)增加，細(xì)胞EMT過程受到抑制，過表達(dá)PGRN的宮頸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱。此外，S6K1還可以通過調(diào)節(jié)其他信號(hào)通路來影響細(xì)胞骨架重塑和EMT。S6K1可以激活Rho家族小GTP酶（如Rac1、Cdc42等），這些小GTP酶參與調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的動(dòng)態(tài)變化。Rac1和Cdc42的激活可以促進(jìn)肌動(dòng)蛋白的聚合，形成絲狀偽足和片狀偽足，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移能力。在過表達(dá)PGRN的宮頸癌細(xì)胞中，S6K1的激活導(dǎo)致Rac1和Cdc42的活性增加，細(xì)胞骨架重塑，遷移和侵襲能力增強(qiáng)。而抑制S6K1的活性則會(huì)降低Rac1和Cdc42的活性，抑制細(xì)胞骨架重塑，減弱細(xì)胞的遷移和侵襲能力。六、結(jié)論與展望6.1研究結(jié)