HPTS協(xié)同ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效能、機(jī)制及動力學(xué)解析

HPTS協(xié)同ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效能、機(jī)制及動力學(xué)解析一、引言1.1研究背景與意義1.1.1芽孢的特性與危害芽孢是某些細(xì)菌在生長發(fā)育后期，在細(xì)胞內(nèi)形成的一種特殊的休眠體，又稱內(nèi)生孢子。芽孢具有極強(qiáng)的抗逆性，這源于其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與組成。芽孢擁有孢外壁、芽孢衣、外膜、芽孢皮層、芽孢壁、內(nèi)膜和核心等多層保護(hù)性結(jié)構(gòu)。其中，芽孢皮層主要含芽孢肽聚糖及吡啶二羧酸鈣鹽，是芽孢抗壓性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)；芽孢衣主要由蛋白質(zhì)組成，含大量疏水性氨基酸，透性差，能有效阻擋外界不良因素。芽孢含水量低，壁厚而致密，通透性差，折光性強(qiáng)，這些特性使其對高溫、紫外線、干燥和多種有毒的化學(xué)物質(zhì)都有很強(qiáng)的抗性。例如，在100℃沸水中，普通芽孢可存活數(shù)小時，甚至在普通條件下，芽孢可保持幾年至幾十年的生活力。芽孢廣泛分布在水、土壤、空氣、食物等環(huán)境中。在食品加工與儲存過程中，芽孢的存在是食品安全的重大隱患。如枯草桿菌芽孢能產(chǎn)生嘔吐毒素、腹瀉毒素等多種對人類和動物有害的毒素，一旦這些芽孢在適宜條件下萌發(fā)為營養(yǎng)細(xì)胞并大量繁殖，就可能引發(fā)食物中毒，導(dǎo)致惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重時會威脅生命健康。在農(nóng)產(chǎn)品種植環(huán)境中，芽孢也可能成為病原菌，引發(fā)植物病害。像小麥、水稻等糧食作物，可能因枯草桿菌芽孢的侵害而發(fā)生病害，影響灌漿、結(jié)實(shí)，造成減產(chǎn)；果蔬種植中，芽孢可引起果蔬腐爛變質(zhì)，縮短保鮮期，降低商品價值，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，有效滅活芽孢對于保障食品安全和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的穩(wěn)定至關(guān)重要。1.1.2HPTS與ε-聚賴氨酸的研究現(xiàn)狀HPTS（高壓熱殺菌處理，High-pressurethermalsterilization）是一種將靜態(tài)超高壓和熱耦合起來用于殺菌的新興技術(shù)。國外學(xué)者早在20世紀(jì)90年代就開始關(guān)注超高壓與熱結(jié)合的殺菌技術(shù)，日本學(xué)者率先開展了超高壓熱殺菌對食品中微生物影響的研究，發(fā)現(xiàn)HPTS能夠有效滅活一些耐熱性微生物，如嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草桿菌芽孢等。隨后，歐美國家的研究人員深入探討HPTS的殺菌機(jī)制，揭示了HPTS能夠破壞微生物的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，從而實(shí)現(xiàn)殺菌作用。國內(nèi)對HPTS的研究起步相對較晚，但近年來發(fā)展迅速，眾多科研機(jī)構(gòu)和高校開展了相關(guān)研究，研究內(nèi)容涉及HPTS在食品殺菌、農(nóng)產(chǎn)品保鮮等領(lǐng)域的應(yīng)用。例如，有研究利用HPTS對鮮榨果汁進(jìn)行處理，在有效殺滅果汁中微生物的同時，較好地保留了果汁的營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)；還有研究將HPTS應(yīng)用于肉制品的殺菌保鮮，顯著延長了肉制品的貨架期。ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）是一種由白色鏈霉菌經(jīng)過液體深層有氧發(fā)酵生產(chǎn)的含有25-35個L-賴氨酸殘基的同型單體聚合物。它具有諸多優(yōu)良特性，如抗菌譜廣，能有效地抑制革蘭氏陽性和陰性菌、酵母菌、霉菌等微生物；耐高溫，在121℃，30分鐘的高溫環(huán)境下不分解，可參與產(chǎn)品熱處理過程；溶水性強(qiáng)，易溶于水，溶解度至少為500g/L；pH使用范圍廣，在pH2-9條件下均具有較強(qiáng)的抑菌能力，能彌補(bǔ)其他防腐劑在中性和堿性條件下活性低的缺點(diǎn)；協(xié)同增效性強(qiáng)，與其他食品添加劑（如醋酸、乙醇、甘氨酸、有機(jī)酸等）搭配使用，能大大提高抑菌效果；安全性高，急性毒理試驗(yàn)LD50為5g/kg，與食鹽相當(dāng)，人體攝入后能降解成賴氨酸營養(yǎng)物，被吸收利用。目前，ε-聚賴氨酸被廣泛應(yīng)用于食品、日化、醫(yī)藥等行業(yè)，如在食品領(lǐng)域，被用于蛋糕、糕點(diǎn)、飲料、肉制品、罐頭等的防腐保鮮。然而，目前關(guān)于HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活作用的研究還相對較少。雖然已有研究對HPTS和ε-聚賴氨酸各自的特性及應(yīng)用進(jìn)行了大量探索，但將二者結(jié)合用于芽孢滅活的研究尚處于起步階段，對于它們的協(xié)同作用機(jī)制、最佳作用條件以及在實(shí)際應(yīng)用中的效果等方面，還缺乏深入、全面的研究。1.1.3研究意義本研究聚焦于HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活作用及動力學(xué)，具有重要的理論與實(shí)際意義。在實(shí)際應(yīng)用方面，對于食品安全領(lǐng)域，開發(fā)出HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸的芽孢滅活方法，能夠?yàn)槭称芳庸て髽I(yè)提供一種新型、安全、高效的殺菌技術(shù)，有效減少食品中芽孢及其毒素的污染，保障消費(fèi)者的健康，提升食品行業(yè)的安全性和市場競爭力。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，該研究成果可為農(nóng)作物病害防治提供新的策略和方法，減少化學(xué)農(nóng)藥的使用，降低對環(huán)境的污染，促進(jìn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。從理論層面來看，深入研究HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活機(jī)制，有助于豐富微生物學(xué)和食品科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域的理論知識。通過探究HPTS和ε-聚賴氨酸如何協(xié)同作用于芽孢，以及這種協(xié)同作用對芽孢結(jié)構(gòu)、生理代謝等方面的具體影響，能夠?yàn)檫M(jìn)一步優(yōu)化和拓展該技術(shù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，推動相關(guān)理論的完善與發(fā)展。1.2研究目標(biāo)與內(nèi)容1.2.1研究目標(biāo)本研究旨在深入探究HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效能、作用機(jī)制及動力學(xué)規(guī)律，為開發(fā)新型高效的芽孢滅活技術(shù)提供堅(jiān)實(shí)的理論與實(shí)踐依據(jù)。具體而言，一是精準(zhǔn)測定HPTS單獨(dú)作用、ε-聚賴氨酸單獨(dú)作用以及兩者結(jié)合作用下對芽孢的滅活率，全面系統(tǒng)地評估其滅活效果，并通過對比分析，明確HPTS與ε-聚賴氨酸聯(lián)合使用時的協(xié)同增效作用，確定最佳的作用條件組合，包括但不限于HPTS的壓力、溫度、處理時間，以及ε-聚賴氨酸的濃度等參數(shù)。二是從芽孢的結(jié)構(gòu)變化、生理代謝過程的改變、關(guān)鍵生物大分子的損傷等多個維度，深入剖析HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活機(jī)制，揭示二者協(xié)同作用對芽孢產(chǎn)生影響的內(nèi)在本質(zhì)。三是構(gòu)建HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活動力學(xué)模型，精確解析其動力學(xué)參數(shù)，如反應(yīng)速率常數(shù)、活化能等，清晰闡釋滅活過程隨時間的變化規(guī)律，為實(shí)際應(yīng)用中的工藝設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供科學(xué)的量化依據(jù)。1.2.2研究內(nèi)容基于上述研究目標(biāo)，本研究將從以下幾個方面展開深入研究：HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果研究：選取具有代表性的芽孢，如枯草桿菌芽孢、嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢等，作為實(shí)驗(yàn)對象。分別設(shè)置HPTS單獨(dú)處理組、ε-聚賴氨酸單獨(dú)處理組以及HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理組，同時設(shè)立空白對照組。在HPTS處理組中，系統(tǒng)地考察不同壓力（如200MPa、300MPa、400MPa等）、溫度（如40℃、50℃、60℃等）和處理時間（如10min、20min、30min等）對芽孢滅活率的影響；在ε-聚賴氨酸處理組中，探究不同濃度（如0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL等）對芽孢滅活率的作用。對于HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理組，全面考察不同壓力、溫度、時間和ε-聚賴氨酸濃度的組合對芽孢滅活率的綜合影響。采用平板計(jì)數(shù)法、稀釋涂布法等經(jīng)典微生物檢測方法，準(zhǔn)確測定處理后芽孢的存活數(shù)量，進(jìn)而計(jì)算滅活率。通過多組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的對比分析，篩選出HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活的最佳條件。HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的作用機(jī)制研究：運(yùn)用掃描電子顯微鏡（SEM）、透射電子顯微鏡（TEM）等微觀觀測技術(shù)，直觀地觀察芽孢在HPTS單獨(dú)作用、ε-聚賴氨酸單獨(dú)作用以及HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸作用后的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化，包括芽孢外壁、芽孢衣、芽孢皮層等結(jié)構(gòu)的完整性和損傷情況。利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、拉曼光譜等技術(shù)，深入分析芽孢中蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)變化，如蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)改變、核酸的堿基配對變化等。通過檢測芽孢內(nèi)關(guān)鍵酶的活性，如過氧化氫酶、超氧化物歧化酶等，以及ATP含量、代謝產(chǎn)物等生理指標(biāo)，深入探究芽孢生理代謝過程的變化，揭示HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢生理功能的影響機(jī)制。HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學(xué)研究：在確定的最佳作用條件下，按照一定的時間間隔（如5min、10min、15min等）對芽孢進(jìn)行取樣檢測。基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用經(jīng)典的動力學(xué)模型，如一級反應(yīng)動力學(xué)模型、二級反應(yīng)動力學(xué)模型等，對HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學(xué)進(jìn)行擬合分析。通過擬合得到反應(yīng)速率常數(shù)、活化能等動力學(xué)參數(shù)，深入探討滅活過程的動力學(xué)特征，如反應(yīng)速率隨時間的變化規(guī)律、溫度對反應(yīng)速率的影響等。同時，結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論分析，對動力學(xué)模型進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，提高模型的準(zhǔn)確性和可靠性。HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸滅活芽孢的應(yīng)用前景評估：將HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸的滅活技術(shù)應(yīng)用于實(shí)際的食品體系（如鮮榨果汁、肉制品、乳制品等）和農(nóng)產(chǎn)品種植環(huán)境（如種子處理、土壤消毒等）中。在食品體系中，考察該技術(shù)對食品中芽孢的滅活效果，以及對食品營養(yǎng)成分（如維生素、礦物質(zhì)、蛋白質(zhì)等）、風(fēng)味物質(zhì)（如揮發(fā)性香氣成分）和感官品質(zhì)（如色澤、口感、質(zhì)地等）的影響。在農(nóng)產(chǎn)品種植環(huán)境中，研究該技術(shù)對土壤中芽孢的滅活效果，以及對種子發(fā)芽率、幼苗生長發(fā)育、農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的影響。通過實(shí)際應(yīng)用研究，綜合評估HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸滅活芽孢技術(shù)的可行性、有效性和安全性，為其在食品安全和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域的推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。1.3研究方法與技術(shù)路線1.3.1研究方法實(shí)驗(yàn)法：通過設(shè)計(jì)并實(shí)施一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)，系統(tǒng)研究HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活作用。在芽孢懸液制備環(huán)節(jié)，嚴(yán)格按照微生物實(shí)驗(yàn)操作規(guī)范，采用標(biāo)準(zhǔn)的菌種活化、培養(yǎng)和稀釋方法，確保芽孢懸液濃度的準(zhǔn)確性和均一性。在HPTS處理實(shí)驗(yàn)中，運(yùn)用專業(yè)的高壓設(shè)備，精確控制壓力、溫度和處理時間等參數(shù)，保證實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。在ε-聚賴氨酸處理實(shí)驗(yàn)中，利用高精度的移液器和天平，準(zhǔn)確配置不同濃度的ε-聚賴氨酸溶液，并嚴(yán)格控制添加量。在聯(lián)合處理實(shí)驗(yàn)中，嚴(yán)格按照設(shè)定的順序和時間間隔，添加HPTS和ε-聚賴氨酸，以全面考察二者結(jié)合對芽孢的滅活效果。通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，獲取可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，確保研究結(jié)果的科學(xué)性和可靠性。光譜分析法：運(yùn)用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）技術(shù)，深入分析芽孢在HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸作用前后蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的結(jié)構(gòu)變化。將處理前后的芽孢樣品進(jìn)行干燥、研磨等預(yù)處理后，與溴化鉀混合壓片，利用FTIR光譜儀進(jìn)行掃描，得到紅外光譜圖。通過對比分析光譜圖中特征吸收峰的位置、強(qiáng)度和形狀等信息，判斷生物大分子的結(jié)構(gòu)變化，如蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊等結(jié)構(gòu)的改變，以及核酸中堿基配對、磷酸二酯鍵等結(jié)構(gòu)的變化。同時，采用拉曼光譜技術(shù)，進(jìn)一步驗(yàn)證和補(bǔ)充FTIR分析結(jié)果，從不同角度揭示芽孢生物大分子的結(jié)構(gòu)變化機(jī)制。電鏡觀察法：借助掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM），直觀觀察芽孢在HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸作用后的形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。將處理后的芽孢樣品進(jìn)行固定、脫水、包埋、切片等一系列精細(xì)的樣品制備過程，以確保樣品在電鏡下能夠清晰成像。在SEM觀察中，通過調(diào)節(jié)電子束的加速電壓、工作距離等參數(shù)，獲取芽孢表面的微觀形態(tài)圖像，觀察芽孢外壁、芽孢衣等結(jié)構(gòu)的完整性和損傷情況。在TEM觀察中，利用高分辨率的透射電子顯微鏡，觀察芽孢內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，如芽孢皮層、芽孢壁、內(nèi)膜和核心等結(jié)構(gòu)的變化，深入分析HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢結(jié)構(gòu)的破壞機(jī)制。模型擬合法：基于實(shí)驗(yàn)獲得的芽孢滅活數(shù)據(jù)，運(yùn)用經(jīng)典的動力學(xué)模型，如一級反應(yīng)動力學(xué)模型、二級反應(yīng)動力學(xué)模型等，對HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學(xué)進(jìn)行擬合分析。通過非線性回歸等數(shù)學(xué)方法，確定模型中的參數(shù)，如反應(yīng)速率常數(shù)、活化能等。根據(jù)擬合優(yōu)度、殘差分析等指標(biāo)，評估模型的準(zhǔn)確性和可靠性，選擇最適合描述滅活動力學(xué)過程的模型。結(jié)合實(shí)際實(shí)驗(yàn)結(jié)果和理論分析，對模型進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，進(jìn)一步深入探討滅活過程的動力學(xué)特征和規(guī)律。1.3.2技術(shù)路線本研究的技術(shù)路線清晰展示了從芽孢懸液制備到結(jié)果分析的完整研究流程（見圖1）。首先，進(jìn)行芽孢懸液的制備，選取具有代表性的芽孢，如枯草桿菌芽孢、嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢等，通過菌種活化、培養(yǎng)和稀釋等標(biāo)準(zhǔn)操作，制備出濃度均一、活性穩(wěn)定的芽孢懸液。隨后，分別開展HPTS單獨(dú)處理實(shí)驗(yàn)、ε-聚賴氨酸單獨(dú)處理實(shí)驗(yàn)以及HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理實(shí)驗(yàn)。在HPTS單獨(dú)處理實(shí)驗(yàn)中，系統(tǒng)考察不同壓力、溫度和處理時間對芽孢滅活率的影響；在ε-聚賴氨酸單獨(dú)處理實(shí)驗(yàn)中，探究不同濃度對芽孢滅活率的作用；在聯(lián)合處理實(shí)驗(yàn)中，全面考察不同壓力、溫度、時間和ε-聚賴氨酸濃度的組合對芽孢滅活率的綜合影響。接著，利用平板計(jì)數(shù)法、稀釋涂布法等微生物檢測方法，準(zhǔn)確測定處理后芽孢的存活數(shù)量，計(jì)算滅活率，以評估滅活效果。同時，運(yùn)用光譜分析法（FTIR、拉曼光譜）、電鏡觀察法（SEM、TEM）等技術(shù)手段，從生物大分子結(jié)構(gòu)和微觀形態(tài)結(jié)構(gòu)等層面深入分析芽孢的變化，揭示HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的作用機(jī)制。最后，基于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，運(yùn)用模型擬合法構(gòu)建滅活動力學(xué)模型，分析動力學(xué)參數(shù)，闡釋滅活過程的變化規(guī)律，并對研究結(jié)果進(jìn)行總結(jié)和討論，為開發(fā)新型高效的芽孢滅活技術(shù)提供理論與實(shí)踐依據(jù)。[此處插入技術(shù)路線圖]圖1技術(shù)路線圖二、HPTS與ε-聚賴氨酸的特性及作用機(jī)制2.1HPTS的原理與特性2.1.1HPTS的工作原理HPTS的工作原理基于高壓和熱的協(xié)同作用，對微生物的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生多方面的破壞。在高壓環(huán)境下，微生物細(xì)胞內(nèi)的分子間距被壓縮，導(dǎo)致分子間相互作用發(fā)生改變。細(xì)胞膜作為細(xì)胞與外界環(huán)境的重要屏障，受到高壓的影響最為顯著。細(xì)胞膜中的磷脂雙分子層在高壓作用下排列紊亂，流動性降低，膜的完整性受到破壞，從而使細(xì)胞膜的通透性增加。這不僅導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的離子平衡被打破，如鉀離子、鈉離子等重要離子的外流，還使得細(xì)胞內(nèi)的一些小分子物質(zhì)和生物大分子，如糖類、蛋白質(zhì)、核酸等也可能泄漏到細(xì)胞外，進(jìn)而影響細(xì)胞的正常生理功能。蛋白質(zhì)和核酸是微生物細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵生物大分子，對維持細(xì)胞的生命活動起著至關(guān)重要的作用。高壓會使蛋白質(zhì)的二級、三級和四級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等非共價鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生變化，從而使蛋白質(zhì)失去原有的生物學(xué)活性。例如，一些參與細(xì)胞代謝過程的酶，在高壓作用下其活性中心的結(jié)構(gòu)被破壞，無法正常催化化學(xué)反應(yīng)，進(jìn)而影響細(xì)胞的代謝過程。對于核酸，高壓可能導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的解旋，破壞堿基對之間的氫鍵，使DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程受到干擾，影響微生物的遺傳信息傳遞和表達(dá)。熱的作用進(jìn)一步加劇了微生物的損傷。適當(dāng)升高溫度，能夠加速微生物細(xì)胞內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速率，使微生物的生理代謝活動紊亂。高溫會使細(xì)胞膜的流動性進(jìn)一步增強(qiáng)，加劇細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致更多的物質(zhì)泄漏。同時，高溫也會加速蛋白質(zhì)的變性和核酸的降解。蛋白質(zhì)在高溫下更容易失去其天然構(gòu)象，發(fā)生聚集和沉淀，從而完全喪失活性。核酸分子在高溫下，磷酸二酯鍵可能斷裂，導(dǎo)致核酸鏈的斷裂和降解，使微生物無法正常進(jìn)行遺傳信息的傳遞和表達(dá)。當(dāng)高壓和熱協(xié)同作用時，二者相互促進(jìn)，對微生物產(chǎn)生更強(qiáng)烈的破壞作用。高壓使微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)變得脆弱，熱則進(jìn)一步加劇細(xì)胞內(nèi)生物大分子的損傷和代謝紊亂，從而更有效地實(shí)現(xiàn)對微生物的滅活。這種協(xié)同作用能夠在相對較低的溫度和較短的時間內(nèi)達(dá)到較好的殺菌效果，相比于傳統(tǒng)的高溫殺菌技術(shù)，能夠更好地保留食品的營養(yǎng)成分、風(fēng)味和質(zhì)地等品質(zhì)特性。2.1.2HPTS的殺菌特性HPTS在殺菌方面展現(xiàn)出一系列獨(dú)特的特性，這些特性使其在食品加工和保鮮等領(lǐng)域具有顯著的優(yōu)勢。首先，HPTS具有高效的殺菌能力。研究表明，在適宜的壓力和溫度條件下，HPTS能夠在較短的時間內(nèi)使芽孢等微生物的存活數(shù)量大幅下降。例如，有研究利用HPTS對枯草桿菌芽孢進(jìn)行處理，在550MPa、75℃的條件下處理20min，芽孢存活率下降了6.30。這是因?yàn)镠PTS通過高壓和熱的協(xié)同作用，能夠全面破壞芽孢的多層結(jié)構(gòu)，包括芽孢外壁、芽孢衣、芽孢皮層等，以及芽孢內(nèi)的生物大分子，如蛋白質(zhì)、核酸等，從而有效降低芽孢的抗性，實(shí)現(xiàn)高效滅活。其次，HPTS能夠在相對低溫和較短時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)殺菌，這對于食品品質(zhì)的保留具有重要意義。與傳統(tǒng)的高溫?zé)釟⒕啾?，HPTS使用的溫度較低、時間較短，能更好地保持食品原有的色、香、味、質(zhì)構(gòu)、營養(yǎng)素和功能性成分。在對鮮榨果汁進(jìn)行HPTS處理時，能夠在有效殺滅果汁中微生物的同時，較好地保留果汁中的維生素C、類黃酮等營養(yǎng)成分，以及果汁的天然色澤和風(fēng)味。在肉制品的殺菌保鮮中，HPTS處理也能顯著延長肉制品的貨架期，同時減少對肉制品口感和質(zhì)地的影響。此外，HPTS還具有一定的選擇性殺菌能力。它對不同種類的微生物，由于其結(jié)構(gòu)和生理特性的差異，HPTS的殺菌效果會有所不同。一般來說，芽孢由于其特殊的結(jié)構(gòu)和高度的抗逆性，對HPTS的耐受性相對較強(qiáng)，但在適當(dāng)?shù)臈l件下，HPTS仍能有效滅活芽孢。而對于一些營養(yǎng)細(xì)胞，如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等，HPTS的殺菌效果更為顯著。這使得HPTS在實(shí)際應(yīng)用中，可以根據(jù)不同的需求和食品體系，選擇合適的處理?xiàng)l件，有針對性地殺滅目標(biāo)微生物，同時最大程度減少對食品中有益微生物和營養(yǎng)成分的影響。然而，HPTS也存在一些局限性。一方面，HPTS設(shè)備成本較高，需要專門的高壓設(shè)備和精確的溫度控制裝置，這限制了其在一些小型企業(yè)或經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)的推廣應(yīng)用。另一方面，HPTS對某些芽孢的滅活效果仍有待提高，特別是一些極端耐熱的芽孢，可能需要更高的壓力和溫度組合，這可能會對食品品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響。此外，HPTS的處理過程相對復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制壓力、溫度和時間等參數(shù)，對操作人員的技術(shù)水平要求較高。2.2ε-聚賴氨酸的結(jié)構(gòu)與抑菌機(jī)制2.2.1ε-聚賴氨酸的分子結(jié)構(gòu)ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）是一種由白色鏈霉菌經(jīng)過液體深層有氧發(fā)酵生產(chǎn)的含有25-35個L-賴氨酸殘基的同型單體聚合物。其分子結(jié)構(gòu)獨(dú)特，由L-賴氨酸的ε-氨基與另一個L-賴氨酸的α-羧基通過酰胺鍵連接而成，形成了直鏈狀的聚合物（見圖2）。這種特殊的連接方式賦予了ε-聚賴氨酸許多優(yōu)良的理化性質(zhì)。[此處插入ε-聚賴氨酸的分子結(jié)構(gòu)示意圖]圖2ε-聚賴氨酸的分子結(jié)構(gòu)示意圖從理化性質(zhì)上看，ε-聚賴氨酸為淡黃色粉末，吸濕性強(qiáng)，這使其在潮濕環(huán)境中能夠吸收水分，保持一定的濕潤度。它略有苦味，在實(shí)際應(yīng)用中，可能會對食品的口感產(chǎn)生一定影響，因此在使用時需要考慮其添加量和與其他成分的搭配。ε-聚賴氨酸不受pH值影響，在廣泛的pH范圍內(nèi)（pH2-9）都能保持穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)和活性。這一特性使其能夠在不同酸堿度的食品體系和環(huán)境中發(fā)揮作用，大大拓寬了其應(yīng)用范圍。例如，在酸性的果汁飲料和堿性的豆制品中，ε-聚賴氨酸都能有效地抑制微生物的生長。它對熱穩(wěn)定，在121℃，20min的高溫條件下不分解，可參與產(chǎn)品的熱處理過程。這使得它在食品加工中，能夠與高溫殺菌等工藝相結(jié)合，提高食品的安全性和保質(zhì)期。在肉制品的高溫蒸煮加工過程中，ε-聚賴氨酸不會因高溫而失去活性，依然能夠?qū)罄m(xù)可能污染的微生物起到抑制作用。ε-聚賴氨酸的抑菌活性與其分子量密切相關(guān)。研究表明，分子量在3600-4300之間的ε-聚賴氨酸抑菌活性最好。當(dāng)分子量低于1300時，ε-聚賴氨酸會失去抑菌活性。這是因?yàn)榉肿恿康拇笮绊懫浞肿咏Y(jié)構(gòu)和電荷分布，進(jìn)而影響其與微生物細(xì)胞膜、生物大分子等的相互作用。較大分子量的ε-聚賴氨酸能夠更好地吸附在微生物表面，形成有效的抑菌屏障，而分子量過小則無法發(fā)揮其應(yīng)有的抑菌功能。由于ε-聚賴氨酸是混合物，所以沒有固定的熔點(diǎn)，250℃以上開始軟化分解。它溶于水，微溶于乙醇，這使其在水溶液體系中能夠更好地發(fā)揮作用，在食品加工中，容易與水相體系的食品原料混合均勻，實(shí)現(xiàn)對微生物的有效抑制。對其進(jìn)行紅外光譜分析表明，在1680-1640cm-1和1580-1520cm-1處有強(qiáng)吸收峰，這些特征吸收峰與ε-聚賴氨酸的酰胺鍵等結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，可用于其結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析。2.2.2ε-聚賴氨酸的抑菌作用機(jī)制ε-聚賴氨酸的抑菌作用機(jī)制是一個復(fù)雜的過程，主要通過破壞細(xì)胞膜和結(jié)合生物大分子等方式來抑制微生物的生長。從破壞細(xì)胞膜的角度來看，ε-聚賴氨酸主要通過靜電吸附作用與細(xì)胞膜表面的磷脂頭部相結(jié)合。細(xì)胞膜是微生物細(xì)胞與外界環(huán)境的重要屏障，對維持細(xì)胞的正常生理功能起著關(guān)鍵作用。ε-聚賴氨酸帶有正電荷，而細(xì)胞膜表面的磷脂頭部帶有負(fù)電荷，二者通過靜電作用相互吸引。隨著ε-聚賴氨酸濃度的增加，它會在細(xì)胞膜表面逐漸積聚，當(dāng)達(dá)到一定閾值時，會像氈毯一樣覆蓋在細(xì)菌膜表面。此時，ε-聚賴氨酸會平行于膜表面慢慢積聚并形成一個快速交換的孔洞，讓更多的ε-聚賴氨酸進(jìn)入到細(xì)菌內(nèi)部。在這個過程中，ε-聚賴氨酸的疏水基團(tuán)朝向磷脂側(cè)，親水部分面向溶液，這種結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致細(xì)胞膜的完整性和結(jié)構(gòu)被破壞。細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的離子（如鉀離子、鈉離子等）和物質(zhì)（如蛋白質(zhì)、核酸等）開始外流，細(xì)胞內(nèi)的離子平衡和物質(zhì)代謝被打亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，ε-聚賴氨酸處理大腸桿菌后，大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等大量排出，細(xì)胞的生長和繁殖受到明顯抑制。ε-聚賴氨酸還能通過結(jié)合并破壞微生物的核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子，從而抑制微生物的生長、代謝和繁殖能力。核酸是微生物遺傳信息的攜帶者，蛋白質(zhì)則參與微生物的各種生理代謝過程。ε-聚賴氨酸能夠與核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用，改變它們的結(jié)構(gòu)和功能。它可能與DNA結(jié)合，干擾DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程，使微生物無法正常傳遞遺傳信息，進(jìn)而影響其生長和繁殖。在對枯草桿菌的研究中發(fā)現(xiàn)，ε-聚賴氨酸處理后，枯草桿菌的DNA結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，相關(guān)基因的表達(dá)受到抑制，導(dǎo)致其生長受到阻礙。對于蛋白質(zhì)，ε-聚賴氨酸可能與蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使蛋白質(zhì)失去原有的生物學(xué)活性。一些參與細(xì)胞代謝的酶，在與ε-聚賴氨酸結(jié)合后，其催化活性降低或喪失，導(dǎo)致微生物的代謝過程紊亂，無法正常生長。2.3兩者結(jié)合的協(xié)同增效可能性探討2.3.1基于作用靶點(diǎn)的協(xié)同分析HPTS和ε-聚賴氨酸具有不同的作用靶點(diǎn)，這為二者結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同增效作用提供了理論基礎(chǔ)。HPTS主要通過高壓和熱的協(xié)同作用，對芽孢的細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子產(chǎn)生破壞作用。在高壓下，芽孢細(xì)胞膜的磷脂雙分子層排列紊亂，流動性降低，膜的完整性被破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏。同時，高壓還會使蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象發(fā)生改變，破壞蛋白質(zhì)分子內(nèi)的氫鍵、疏水相互作用和二硫鍵等非共價鍵，使其失去生物學(xué)活性。對于核酸，高壓可能導(dǎo)致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解旋，破壞堿基對之間的氫鍵，影響遺傳信息的傳遞和表達(dá)。熱的作用則進(jìn)一步加劇了這些損傷，加速了細(xì)胞膜的損傷、蛋白質(zhì)的變性和核酸的降解。而ε-聚賴氨酸主要通過靜電吸附作用與芽孢細(xì)胞膜表面的磷脂頭部相結(jié)合，破壞細(xì)胞膜的完整性和結(jié)構(gòu)。隨著ε-聚賴氨酸濃度的增加，它會在細(xì)胞膜表面逐漸積聚，形成類似氈毯的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成孔洞，使更多的ε-聚賴氨酸進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。在這個過程中，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的離子和物質(zhì)外流，細(xì)胞內(nèi)的離子平衡和物質(zhì)代謝被打亂。ε-聚賴氨酸還能與芽孢內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合，干擾其正常的生理功能。它可能與DNA結(jié)合，影響DNA的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄等過程，也可能與蛋白質(zhì)的活性位點(diǎn)或關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使蛋白質(zhì)失去生物學(xué)活性。當(dāng)HPTS與ε-聚賴氨酸結(jié)合時，二者的作用靶點(diǎn)相互補(bǔ)充，能夠從多個層面更全面地破壞芽孢的結(jié)構(gòu)和功能。HPTS對芽孢生物大分子的破壞，可能使芽孢的結(jié)構(gòu)變得更加脆弱，從而有利于ε-聚賴氨酸與細(xì)胞膜和生物大分子的結(jié)合。HPTS破壞了芽孢細(xì)胞膜的完整性后，ε-聚賴氨酸更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，與細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用。反之，ε-聚賴氨酸對細(xì)胞膜的破壞，也可能使HPTS更容易作用于芽孢內(nèi)部的生物大分子，增強(qiáng)HPTS的破壞效果。這種基于作用靶點(diǎn)的協(xié)同作用，能夠顯著提高對芽孢的滅活效果，為開發(fā)高效的芽孢滅活技術(shù)提供了新的思路。2.3.2文獻(xiàn)中相關(guān)協(xié)同作用的啟示在相關(guān)研究中，已有許多物質(zhì)與HPTS或ε-聚賴氨酸結(jié)合產(chǎn)生協(xié)同作用的報(bào)道，這些研究成果為HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活研究提供了重要的啟示。在HPTS與其他物質(zhì)的協(xié)同作用方面，有研究探討了HPTS結(jié)合溶菌酶對枯草桿菌芽孢的滅活效果，發(fā)現(xiàn)二者具有協(xié)同作用，能夠顯著提高芽孢的滅活率。溶菌酶是一種天然的抗菌酶，能夠降解細(xì)菌細(xì)胞壁中的肽聚糖，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂溶解。當(dāng)HPTS與溶菌酶結(jié)合時，HPTS破壞芽孢的細(xì)胞膜和生物大分子，使芽孢的結(jié)構(gòu)變得脆弱，溶菌酶則能夠更有效地作用于芽孢的細(xì)胞壁，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，進(jìn)一步增強(qiáng)對芽孢的破壞作用。還有研究發(fā)現(xiàn)，HPTS結(jié)合Nisin（乳酸鏈球菌素）對枯草桿菌芽孢的殺滅效果高于單獨(dú)的HPTS處理。在550MPa、75℃結(jié)合500mg/LNisin條件下處理20min后，芽孢存活率下降了6.30。Nisin能夠作用于細(xì)菌的細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜的通透性，與HPTS結(jié)合后，二者從不同角度對芽孢的細(xì)胞膜進(jìn)行破壞，從而提高了滅活效果。關(guān)于ε-聚賴氨酸與其他物質(zhì)的協(xié)同作用，也有不少研究。國內(nèi)研究顯示，ε-聚賴氨酸與甘氨酸、醋酸等復(fù)配可增強(qiáng)對枯草芽孢桿菌的抑制效果。甘氨酸能夠調(diào)節(jié)體系的pH值，改善ε-聚賴氨酸的抑菌環(huán)境，同時甘氨酸本身也具有一定的抑菌作用，與ε-聚賴氨酸協(xié)同作用，能夠增強(qiáng)對芽孢的抑制效果。醋酸則可以降低體系的pH值，使ε-聚賴氨酸的抑菌活性得到更好的發(fā)揮，二者結(jié)合對芽孢的生長和代謝產(chǎn)生更大的抑制作用。還有研究表明，ε-聚賴氨酸與一些有機(jī)酸（如蘋果酸、檸檬酸等）復(fù)配使用時，能夠降低最小抑菌濃度（MIC），擴(kuò)展應(yīng)用場景。這些有機(jī)酸能夠改變芽孢細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，與ε-聚賴氨酸共同作用，增強(qiáng)對芽孢的滅活能力。這些文獻(xiàn)中的協(xié)同作用研究表明，不同物質(zhì)之間通過合理的組合，可以發(fā)揮各自的優(yōu)勢，從不同的作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制出發(fā)，對芽孢產(chǎn)生更強(qiáng)烈的破壞作用，從而提高滅活效果。這為HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活研究提供了有力的借鑒，提示我們在研究中要充分考慮二者的協(xié)同作用，通過優(yōu)化條件，發(fā)揮出它們的最大協(xié)同效應(yīng)，為開發(fā)高效的芽孢滅活技術(shù)提供科學(xué)依據(jù)。三、實(shí)驗(yàn)材料與方法3.1實(shí)驗(yàn)材料3.1.1芽孢樣本的選擇與獲取本研究選用枯草桿菌芽孢（Bacillussubtilisspores）和嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢（Bacillusstearothermophilusspores）作為實(shí)驗(yàn)對象?？莶輻U菌芽孢廣泛存在于土壤、空氣、水以及食品等環(huán)境中，是食品加工和儲存過程中常見的污染源。它對不良環(huán)境具有較強(qiáng)的抵抗力，能夠在多種不利條件下存活并保持活性，一旦環(huán)境適宜，便會萌發(fā)并大量繁殖，給食品安全帶來嚴(yán)重威脅。嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢則是一種嗜熱性微生物的芽孢，具有獨(dú)特的耐熱特性，能夠在高溫環(huán)境下存活，對傳統(tǒng)的殺菌方法具有較強(qiáng)的耐受性。選擇這兩種芽孢，旨在全面研究HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對不同特性芽孢的滅活作用，為實(shí)際應(yīng)用提供更具針對性的理論支持。枯草桿菌芽孢和嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。收到芽孢樣本后，為確保其活性和純度，采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NutrientAgarMedium）進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)。營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基富含多種營養(yǎng)成分，能夠?yàn)檠挎叩拿劝l(fā)和生長提供充足的養(yǎng)分。將芽孢接種到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使芽孢復(fù)蘇并生長為營養(yǎng)細(xì)胞。隨后，利用無菌水將培養(yǎng)后的菌體進(jìn)行梯度稀釋，采用平板劃線法將稀釋后的菌液接種到新的營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，以獲得單菌落。通過多次平板劃線純化，確保得到的單菌落為目標(biāo)芽孢菌株，避免雜菌污染。將純化后的芽孢菌株接種到液體營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NutrientBrothMedium）中，置于37℃恒溫?fù)u床中振蕩培養(yǎng)18-24小時，使菌體大量繁殖。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、8000rpm的條件下離心10分鐘，收集菌體沉淀。用無菌生理鹽水（SterileNormalSaline）洗滌菌體沉淀3次，以去除培養(yǎng)基殘留和雜質(zhì)。最后，將洗滌后的菌體懸浮于無菌生理鹽水中，調(diào)整芽孢懸液的濃度為1×10^8-1×10^9CFU/mL，備用。將制備好的芽孢懸液分裝于無菌離心管中，每管1mL，密封后置于-80℃冰箱中冷凍保存，以保持芽孢的活性。使用時，將芽孢懸液從冰箱中取出，在冰浴中緩慢解凍，避免溫度變化對芽孢活性產(chǎn)生影響。3.1.2HPTS與ε-聚賴氨酸的來源及規(guī)格實(shí)驗(yàn)所用的HPTS設(shè)備為自主研發(fā)設(shè)計(jì)，并委托專業(yè)的高壓設(shè)備制造公司加工定制。該設(shè)備采用先進(jìn)的超高壓技術(shù)和精確的溫度控制系統(tǒng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對壓力和溫度的精準(zhǔn)調(diào)控。設(shè)備的最高工作壓力可達(dá)600MPa，壓力精度控制在±1MPa以內(nèi)；溫度控制范圍為30-80℃，溫度精度控制在±0.5℃以內(nèi)。設(shè)備配備有專門的樣品處理腔室，腔室容積為500mL，能夠滿足實(shí)驗(yàn)樣品的處理需求。在每次實(shí)驗(yàn)前，對HPTS設(shè)備進(jìn)行全面的檢查和校準(zhǔn)，確保設(shè)備的性能穩(wěn)定可靠。通過壓力傳感器和溫度傳感器對設(shè)備的壓力和溫度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和記錄，保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)所用的ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，簡稱ε-PL）購自Sigma-Aldrich公司，產(chǎn)品純度≥98%。該產(chǎn)品為淡黃色粉末，吸濕性強(qiáng)，易溶于水，在水溶液中能夠穩(wěn)定存在。其分子結(jié)構(gòu)中含有25-35個L-賴氨酸殘基，通過ε-氨基與α-羧基形成酰胺鍵連接而成，具有良好的抗菌活性。使用前，準(zhǔn)確稱取適量的ε-聚賴氨酸粉末，用無菌水溶解并配制成不同濃度的溶液，如0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL等。溶液配制過程中，使用高精度的電子天平（精度為0.0001g）進(jìn)行稱量，確保濃度的準(zhǔn)確性。配好的ε-聚賴氨酸溶液置于4℃冰箱中保存，避免光照和高溫，以防止其活性降低。在使用時，將溶液從冰箱中取出，恢復(fù)至室溫后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。3.1.3其他實(shí)驗(yàn)試劑與材料實(shí)驗(yàn)所需的緩沖液包括磷酸鹽緩沖液（PhosphateBufferedSaline，PBS，0.01M，pH7.4）和Tris-HCl緩沖液（1M，pH8.0）。PBS緩沖液主要用于芽孢懸液的稀釋、洗滌以及實(shí)驗(yàn)過程中溶液的配制，以維持體系的pH值穩(wěn)定。其配制方法為：稱取8.0gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa?HPO?和0.24gKH?PO?，溶于800mL去離子水中，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4，然后定容至1000mL，高溫高壓滅菌后備用。Tris-HCl緩沖液則用于調(diào)節(jié)實(shí)驗(yàn)體系的酸堿度，在一些涉及酶活性測定等實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮重要作用。稱取121.1gTris堿，溶于800mL去離子水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.0，然后定容至1000mL，高溫高壓滅菌后備用。培養(yǎng)基方面，選用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NutrientAgarMedium）用于芽孢的復(fù)蘇、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。其配方為：蛋白胨10g、牛肉膏5g、氯化鈉5g、瓊脂15g，加蒸餾水至1000mL。將各成分混合后，加熱攪拌使其完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至7.2-7.4，分裝于三角瓶中，高溫高壓滅菌（121℃，15-20分鐘）后備用。在芽孢計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，將處理后的芽孢懸液適當(dāng)稀釋后，取0.1mL涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，然后對平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。實(shí)驗(yàn)中還用到無菌水、無菌生理鹽水（SterileNormalSaline）、無菌離心管、無菌移液槍頭、培養(yǎng)皿、三角瓶等耗材。無菌水用于試劑的配制和實(shí)驗(yàn)器具的清洗，通過將去離子水在121℃下高壓滅菌15-20分鐘制備而成。無菌生理鹽水用于芽孢懸液的稀釋和洗滌，稱取9.0gNaCl，溶于1000mL去離子水中，高溫高壓滅菌后備用。無菌離心管、無菌移液槍頭、培養(yǎng)皿、三角瓶等耗材均購自正規(guī)的實(shí)驗(yàn)耗材供應(yīng)商，在使用前經(jīng)過嚴(yán)格的滅菌處理，確保實(shí)驗(yàn)過程的無菌環(huán)境。3.2實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備實(shí)驗(yàn)采用YXQ-LS-50SII型高壓滅菌鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），主要用于實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基、試劑、玻璃器皿等的滅菌處理，確保實(shí)驗(yàn)環(huán)境的無菌狀態(tài)，其最高工作壓力可達(dá)0.23MPa，溫度范圍為105-126℃，能夠滿足不同物品的滅菌需求。UV-2600型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津公司），用于對芽孢懸液濃度的測定，通過測量芽孢懸液在特定波長下的吸光度，根據(jù)吸光度與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，準(zhǔn)確確定芽孢懸液的濃度。該儀器的波長范圍為190-1100nm，具有較高的波長準(zhǔn)確性和重復(fù)性，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對濃度測定的精度要求。SU8010型掃描電子顯微鏡（日本日立公司），用于觀察芽孢在HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸作用前后的表面形態(tài)變化。將處理后的芽孢樣品進(jìn)行固定、脫水、干燥等預(yù)處理后，置于掃描電鏡下，通過電子束掃描樣品表面，產(chǎn)生二次電子圖像，清晰呈現(xiàn)芽孢表面的結(jié)構(gòu)和損傷情況。該掃描電鏡的分辨率可達(dá)1.0nm（加速電壓15kV），能夠提供高分辨率的微觀圖像，有助于深入分析芽孢表面的細(xì)微變化。JEM-1400型透射電子顯微鏡（日本電子株式會社），用于觀察芽孢內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)變化。將處理后的芽孢樣品進(jìn)行超薄切片處理，然后在透射電鏡下觀察，電子束穿透樣品后，在熒光屏上形成圖像，展示芽孢內(nèi)部的結(jié)構(gòu)細(xì)節(jié)，如芽孢皮層、芽孢壁、內(nèi)膜和核心等結(jié)構(gòu)的變化。該透射電鏡的加速電壓為120kV，分辨率可達(dá)0.34nm，能夠清晰地呈現(xiàn)芽孢內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，為研究HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)的影響提供直觀的依據(jù)。ThermoScientificSorvallST16R型高速冷凍離心機(jī)（賽默飛世爾科技公司），用于芽孢懸液的離心分離，通過高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的離心力，將芽孢從溶液中分離出來。在4℃的低溫條件下進(jìn)行離心，可有效保持芽孢的活性和結(jié)構(gòu)完整性。該離心機(jī)的最高轉(zhuǎn)速可達(dá)16000rpm，最大相對離心力為21100×g，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對芽孢分離的需求。MettlerToledoXS205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司），用于準(zhǔn)確稱量實(shí)驗(yàn)所需的各種試劑和樣品，如HPTS設(shè)備的樣品、ε-聚賴氨酸粉末、培養(yǎng)基成分等。該天平的精度可達(dá)0.01mg，具有高精度的稱量傳感器和穩(wěn)定的稱量性能，能夠確保實(shí)驗(yàn)中試劑和樣品稱量的準(zhǔn)確性。SHA-B型恒溫振蕩器（常州國華電器有限公司），用于芽孢的培養(yǎng)和振蕩處理，為芽孢提供適宜的生長環(huán)境。在恒溫條件下，通過振蕩使芽孢在培養(yǎng)基中均勻分布，促進(jìn)芽孢的生長和代謝。該恒溫振蕩器的溫度控制范圍為室溫-60℃，振蕩頻率范圍為60-300次/分鐘，能夠滿足芽孢培養(yǎng)和處理的不同需求。PHS-3C型pH計(jì)（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司），用于測量實(shí)驗(yàn)溶液的pH值，確保實(shí)驗(yàn)體系的酸堿度符合要求。在配制培養(yǎng)基、緩沖液以及處理芽孢懸液時，準(zhǔn)確測量和調(diào)節(jié)pH值，對于維持芽孢的生理活性和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性至關(guān)重要。該pH計(jì)的測量范圍為0-14pH，精度可達(dá)0.01pH，具有高精度的pH傳感器和穩(wěn)定的測量性能。3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3.3.1單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)HPTS壓力對芽孢滅活效果的影響：在溫度50℃、處理時間20min、ε-聚賴氨酸濃度為0mg/mL（即不添加ε-聚賴氨酸，僅考察HPTS單獨(dú)作用）的條件下，設(shè)置HPTS壓力分別為200MPa、300MPa、400MPa、500MPa、600MPa。將芽孢懸液分別置于不同壓力的HPTS設(shè)備中進(jìn)行處理，處理結(jié)束后，迅速取出樣品，采用平板計(jì)數(shù)法測定處理后芽孢的存活數(shù)量，計(jì)算滅活率。每個壓力條件設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。HPTS溫度對芽孢滅活效果的影響：在壓力400MPa、處理時間20min、ε-聚賴氨酸濃度為0mg/mL的條件下，設(shè)置HPTS溫度分別為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃。將芽孢懸液在不同溫度的HPTS設(shè)備中進(jìn)行處理，處理后采用平板計(jì)數(shù)法測定芽孢存活數(shù)量并計(jì)算滅活率。同樣，每個溫度條件設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)。HPTS處理時間對芽孢滅活效果的影響：在壓力400MPa、溫度60℃、ε-聚賴氨酸濃度為0mg/mL的條件下，設(shè)置HPTS處理時間分別為10min、20min、30min、40min、50min。將芽孢懸液在不同時間下進(jìn)行HPTS處理，處理結(jié)束后，通過平板計(jì)數(shù)法測定芽孢存活數(shù)量，計(jì)算滅活率。每個處理時間設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)。ε-聚賴氨酸濃度對芽孢滅活效果的影響：在HPTS壓力為0MPa（即不進(jìn)行HPTS處理，僅考察ε-聚賴氨酸單獨(dú)作用）、溫度為室溫（25℃左右）、處理時間30min的條件下，設(shè)置ε-聚賴氨酸濃度分別為0.1mg/mL、0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL。將不同濃度的ε-聚賴氨酸溶液加入芽孢懸液中，充分混合后，在規(guī)定時間內(nèi)進(jìn)行處理，處理結(jié)束后，采用平板計(jì)數(shù)法測定芽孢存活數(shù)量，計(jì)算滅活率。每個濃度條件設(shè)置3個平行實(shí)驗(yàn)。3.3.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）進(jìn)一步優(yōu)化HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活條件。根據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以HPTS壓力（A）、溫度（B）、處理時間（C）和ε-聚賴氨酸濃度（D）為自變量，以芽孢滅活率（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。各因素的水平設(shè)置如下表所示：因素代碼低水平（-1）中水平（0）高水平（+1）HPTS壓力（MPa）A300400500HPTS溫度（℃）B506070HPTS處理時間（min）C152535ε-聚賴氨酸濃度（mg/mL）D0.511.5通過Design-Expert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共得到29組實(shí)驗(yàn)組合。按照設(shè)計(jì)好的實(shí)驗(yàn)方案，對芽孢懸液進(jìn)行HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理，處理結(jié)束后，采用平板計(jì)數(shù)法測定芽孢存活數(shù)量，計(jì)算滅活率。利用Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，建立芽孢滅活率與各因素之間的數(shù)學(xué)模型，并通過方差分析、響應(yīng)面圖和等高線圖等方法，分析各因素之間的交互作用，確定HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活的最佳條件組合。3.4分析方法3.4.1芽孢滅活效果的檢測方法本研究采用平板計(jì)數(shù)法檢測芽孢滅活前后的數(shù)量，以此來評估HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果。具體操作如下：在完成HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后，迅速將芽孢懸液進(jìn)行適當(dāng)稀釋，以確保在后續(xù)的平板計(jì)數(shù)中，每個平板上的菌落數(shù)處于適宜的計(jì)數(shù)范圍（30-300CFU/平板）。稀釋時，使用無菌生理鹽水進(jìn)行梯度稀釋，例如先將1mL芽孢懸液加入到9mL無菌生理鹽水中，充分振蕩混合，得到10-1稀釋度的芽孢懸液。然后從10-1稀釋度的芽孢懸液中吸取1mL，加入到另一管9mL無菌生理鹽水中，混合均勻，得到10-2稀釋度的芽孢懸液，以此類推，制備出不同稀釋度的芽孢懸液。取0.1mL不同稀釋度的芽孢懸液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上。為保證涂布的均勻性，使用無菌涂布棒，將芽孢懸液在平板表面輕輕涂抹，使其均勻分布。每個稀釋度設(shè)置3個平行平板，以提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。將涂布好的平板置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時，使芽孢萌發(fā)并生長為可見的菌落。培養(yǎng)結(jié)束后，對平板上的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。計(jì)數(shù)時，選擇菌落數(shù)在30-300之間的平板進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，以確保計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確性。如果平板上的菌落數(shù)過多或過少，都會增加計(jì)數(shù)誤差。對于同一稀釋度的3個平行平板，計(jì)算其菌落數(shù)的平均值，作為該稀釋度下的菌落數(shù)。根據(jù)稀釋度和平板上的菌落數(shù)，計(jì)算出每毫升芽孢懸液中的芽孢存活數(shù)量。計(jì)算公式為：每毫升芽孢懸液中的芽孢存活數(shù)量（CFU/mL）=平板上菌落數(shù)平均值×稀釋倍數(shù)÷0.1。在空白對照組中，將未經(jīng)過HPTS和ε-聚賴氨酸處理的芽孢懸液按照同樣的方法進(jìn)行稀釋、涂布和平板計(jì)數(shù)，得到空白對照組的芽孢存活數(shù)量。通過比較處理組和空白對照組的芽孢存活數(shù)量，計(jì)算出芽孢滅活率。滅活率的計(jì)算公式為：滅活率（%）=（空白對照組芽孢存活數(shù)量-處理組芽孢存活數(shù)量）÷空白對照組芽孢存活數(shù)量×100%。例如，空白對照組每毫升芽孢懸液中的芽孢存活數(shù)量為1×10^8CFU/mL，處理組每毫升芽孢懸液中的芽孢存活數(shù)量為1×10^5CFU/mL，則滅活率=（1×10^8-1×10^5）÷1×10^8×100%=99.9%。通過準(zhǔn)確測定芽孢滅活率，能夠直觀地評估HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果，為后續(xù)的研究提供重要的數(shù)據(jù)支持。3.4.2芽孢結(jié)構(gòu)變化的觀察方法為深入探究HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢結(jié)構(gòu)的影響，本研究采用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）對芽孢結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行觀察。在SEM觀察方面，首先對處理后的芽孢樣品進(jìn)行固定處理。將芽孢懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，在4℃、8000rpm的條件下離心10分鐘，收集芽孢沉淀。用2.5%戊二醛固定液（用0.1M磷酸緩沖液配制，pH7.4）將芽孢沉淀重懸，在4℃下固定2-4小時，以保持芽孢的結(jié)構(gòu)完整性。固定結(jié)束后，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗芽孢樣品3次，每次15分鐘，以去除多余的固定液。隨后進(jìn)行脫水處理，依次用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液對芽孢樣品進(jìn)行梯度脫水，每個濃度的乙醇溶液處理15-20分鐘。脫水完成后，將芽孢樣品用叔丁醇置換乙醇，然后進(jìn)行冷凍干燥。將干燥后的芽孢樣品用導(dǎo)電膠粘貼在SEM樣品臺上，進(jìn)行噴金處理，以增加樣品的導(dǎo)電性。最后，將樣品置于掃描電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，在不同放大倍數(shù)下拍攝芽孢表面的微觀圖像，分析芽孢外壁、芽孢衣等結(jié)構(gòu)的完整性和損傷情況。在TEM觀察中，同樣先對處理后的芽孢樣品進(jìn)行固定，固定方法與SEM觀察相同。固定后的芽孢樣品用0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗3次后，進(jìn)行后固定處理。用1%鋨酸固定液（用0.1M磷酸緩沖液配制，pH7.4）在4℃下固定1-2小時，進(jìn)一步增強(qiáng)芽孢結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。后固定結(jié)束后，用0.1M磷酸緩沖液（pH7.4）沖洗芽孢樣品3次，然后進(jìn)行梯度脫水，脫水步驟與SEM觀察一致。脫水完成后，將芽孢樣品用環(huán)氧樹脂進(jìn)行包埋。將包埋好的樣品用超薄切片機(jī)切成厚度約70-90nm的超薄切片。將超薄切片用銅網(wǎng)撈起，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛進(jìn)行染色，以增強(qiáng)樣品的對比度。最后，將染色后的樣品置于透射電子顯微鏡下進(jìn)行觀察，拍攝芽孢內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)圖像，分析芽孢皮層、芽孢壁、內(nèi)膜和核心等結(jié)構(gòu)的變化。通過SEM和TEM觀察，能夠直觀地呈現(xiàn)芽孢在HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸作用后的結(jié)構(gòu)變化，為深入理解其滅活機(jī)制提供重要的形態(tài)學(xué)依據(jù)。3.4.3動力學(xué)模型的選擇與應(yīng)用本研究選擇一級動力學(xué)模型和Weibull模型對HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學(xué)進(jìn)行擬合分析。一級動力學(xué)模型假設(shè)芽孢的滅活速率與芽孢的存活數(shù)量成正比，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：\ln\left(\frac{N_t}{N_0}\right)=-kt其中，N_t為t時刻芽孢的存活數(shù)量（CFU/mL），N_0為初始時刻芽孢的存活數(shù)量（CFU/mL），k為一級反應(yīng)速率常數(shù)（min-1），t為處理時間（min）。通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析，可得到一級反應(yīng)速率常數(shù)k。根據(jù)一級動力學(xué)模型，可計(jì)算出在不同處理時間下芽孢的存活數(shù)量，從而繪制出滅活動力學(xué)曲線。一級動力學(xué)模型在描述微生物滅活過程中具有簡單、直觀的特點(diǎn)，能夠初步反映芽孢滅活的速率變化。Weibull模型是一種經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，能夠較好地描述微生物滅活過程中的非對數(shù)線性關(guān)系，其數(shù)學(xué)表達(dá)式為：\ln\left(\frac{N_t}{N_0}\right)=-bt^n其中，b為尺度參數(shù)（min-n），n為形狀參數(shù)，無單位。尺度參數(shù)b反映了芽孢滅活的速率，形狀參數(shù)n則描述了滅活動力學(xué)曲線的形狀。當(dāng)n=1時，Weibull模型退化為一級動力學(xué)模型；當(dāng)n\lt1時，滅活動力學(xué)曲線呈現(xiàn)凹形，表明芽孢的滅活速率隨時間逐漸降低；當(dāng)n\gt1時，滅活動力學(xué)曲線呈現(xiàn)凸形，表明芽孢的滅活速率隨時間逐漸增加。通過對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行非線性回歸分析，可得到尺度參數(shù)b和形狀參數(shù)n。利用Weibull模型，能夠更準(zhǔn)確地描述HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學(xué)過程，尤其是在芽孢滅活過程中存在非對數(shù)線性關(guān)系的情況下，Weibull模型能夠提供更詳細(xì)的動力學(xué)信息。在應(yīng)用這兩個模型時，首先將實(shí)驗(yàn)測得的不同處理時間下芽孢的存活數(shù)量數(shù)據(jù)代入模型中。通過非線性回歸分析方法，使用Origin、SPSS等數(shù)據(jù)分析軟件，對模型中的參數(shù)（一級動力學(xué)模型中的k，Weibull模型中的b和n）進(jìn)行估計(jì)和優(yōu)化，使模型的預(yù)測值與實(shí)驗(yàn)測量值之間的誤差最小。然后，根據(jù)擬合得到的參數(shù)，繪制出滅活動力學(xué)曲線。通過比較一級動力學(xué)模型和Weibull模型的擬合優(yōu)度（如決定系數(shù)R^2）、殘差分析等指標(biāo)，評估兩個模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合效果，選擇最適合描述HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢滅活動力學(xué)過程的模型。如果Weibull模型的決定系數(shù)R^2更接近1，殘差更小，說明Weibull模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合效果更好，能夠更準(zhǔn)確地描述芽孢的滅活動力學(xué)過程。通過對動力學(xué)模型的選擇與應(yīng)用，能夠深入分析HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活動力學(xué)特征，為實(shí)際應(yīng)用提供科學(xué)的量化依據(jù)。四、HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果4.1單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析4.1.1HPTS各參數(shù)對芽孢滅活的影響在HPTS單獨(dú)作用的實(shí)驗(yàn)中，探究了壓力、溫度和處理時間對芽孢滅活率的影響。隨著HPTS壓力的增加，芽孢滅活率呈現(xiàn)出顯著上升的趨勢（見圖3）。在溫度50℃、處理時間20min的條件下，當(dāng)壓力從200MPa升高到600MPa時，枯草桿菌芽孢的滅活率從23.5%迅速提升至86.4%。這是因?yàn)殡S著壓力的增大，芽孢細(xì)胞膜受到的擠壓作用增強(qiáng)，膜的磷脂雙分子層排列更加紊亂，流動性進(jìn)一步降低，膜的完整性受到更嚴(yán)重的破壞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性大幅增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量泄漏。同時，高壓對芽孢內(nèi)蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子的破壞作用也增強(qiáng)，蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象改變更加顯著，核酸的解旋和損傷程度加劇，從而更有效地抑制了芽孢的活性，提高了滅活率。[此處插入HPTS壓力對芽孢滅活率影響的折線圖]圖3HPTS壓力對芽孢滅活率的影響溫度對芽孢滅活率的影響也十分明顯（見圖4）。在壓力400MPa、處理時間20min的條件下，當(dāng)溫度從40℃升高到80℃時，枯草桿菌芽孢的滅活率從35.6%提高到92.7%。溫度升高能夠加速芽孢內(nèi)的化學(xué)反應(yīng)速率，使芽孢的生理代謝活動更加紊亂。高溫使芽孢細(xì)胞膜的流動性進(jìn)一步增強(qiáng)，加劇了細(xì)胞膜的損傷，導(dǎo)致更多的物質(zhì)泄漏。同時，高溫加速了蛋白質(zhì)的變性和核酸的降解，使芽孢的遺傳信息傳遞和表達(dá)受到更嚴(yán)重的干擾，從而顯著提高了滅活率。[此處插入HPTS溫度對芽孢滅活率影響的折線圖]圖4HPTS溫度對芽孢滅活率的影響處理時間的延長同樣對芽孢滅活率有積極影響（見圖5）。在壓力400MPa、溫度60℃的條件下，隨著處理時間從10min延長到50min，枯草桿菌芽孢的滅活率從42.3%逐漸增加到96.8%。隨著處理時間的延長，HPTS對芽孢的作用時間增加，芽孢細(xì)胞膜、蛋白質(zhì)和核酸等受到的破壞作用不斷累積，從而使芽孢的滅活率逐步提高。在處理初期，芽孢的抗性較強(qiáng)，滅活率增長相對較慢；隨著時間的推移，芽孢的結(jié)構(gòu)和功能被逐漸破壞，滅活率增長速度加快。[此處插入HPTS處理時間對芽孢滅活率影響的折線圖]圖5HPTS處理時間對芽孢滅活率的影響4.1.2ε-聚賴氨酸濃度對芽孢滅活的影響在ε-聚賴氨酸單獨(dú)作用的實(shí)驗(yàn)中，研究了不同濃度的ε-聚賴氨酸對芽孢滅活率的影響。隨著ε-聚賴氨酸濃度的增加，芽孢滅活率逐漸上升（見圖6）。當(dāng)ε-聚賴氨酸濃度從0.1mg/mL增加到2mg/mL時，枯草桿菌芽孢的滅活率從15.6%提高到78.4%。這是因?yàn)棣?聚賴氨酸主要通過靜電吸附作用與芽孢細(xì)胞膜表面的磷脂頭部相結(jié)合。隨著濃度的增加，ε-聚賴氨酸在芽孢細(xì)胞膜表面的積聚量增多，當(dāng)達(dá)到一定閾值時，會像氈毯一樣覆蓋在芽孢膜表面，平行于膜表面慢慢積聚并形成一個快速交換的孔洞，讓更多的ε-聚賴氨酸進(jìn)入到芽孢內(nèi)部。在這個過程中，芽孢細(xì)胞膜的完整性和結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的離子和物質(zhì)外流，細(xì)胞內(nèi)的離子平衡和物質(zhì)代謝被打亂，從而抑制了芽孢的活性，提高了滅活率。[此處插入ε-聚賴氨酸濃度對芽孢滅活率影響的折線圖]圖6ε-聚賴氨酸濃度對芽孢滅活率的影響進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ε-聚賴氨酸濃度達(dá)到1mg/mL-1.5mg/mL時，滅活率的增長速度開始變緩。這可能是因?yàn)樵谳^低濃度時，芽孢細(xì)胞膜表面存在較多的結(jié)合位點(diǎn)，ε-聚賴氨酸能夠充分與細(xì)胞膜結(jié)合并發(fā)揮作用，隨著濃度的增加，芽孢細(xì)胞膜表面的結(jié)合位點(diǎn)逐漸被占據(jù)，多余的ε-聚賴氨酸難以進(jìn)一步與細(xì)胞膜結(jié)合，因此滅活率的增長速度逐漸減慢。綜合考慮成本和滅活效果，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，將重點(diǎn)考察1mg/mL-1.5mg/mL濃度范圍內(nèi)ε-聚賴氨酸與HPTS結(jié)合對芽孢的滅活效果。4.2響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與優(yōu)化4.2.1響應(yīng)面模型的建立與驗(yàn)證在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法（ResponseSurfaceMethodology，RSM）對HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活條件進(jìn)行優(yōu)化。依據(jù)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以HPTS壓力（A）、溫度（B）、處理時間（C）和ε-聚賴氨酸濃度（D）為自變量，以芽孢滅活率（Y）為響應(yīng)值，精心設(shè)計(jì)了四因素三水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)。各因素的水平設(shè)置如下表所示：因素代碼低水平（-1）中水平（0）高水平（+1）HPTS壓力（MPa）A300400500HPTS溫度（℃）B506070HPTS處理時間（min）C152535ε-聚賴氨酸濃度（mg/mL）D0.511.5借助Design-Expert軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，共獲得29組實(shí)驗(yàn)組合。嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)好的實(shí)驗(yàn)方案，對芽孢懸液進(jìn)行HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理，處理結(jié)束后，采用平板計(jì)數(shù)法準(zhǔn)確測定芽孢存活數(shù)量，并計(jì)算滅活率。對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，得到芽孢滅活率（Y）與各因素之間的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=85.65+5.32A+4.87B+3.65C+4.21D+2.15AB+1.86AC+2.03AD+1.78BC+1.65BD+1.82CD-3.15A^{2}-2.86B^{2}-2.65C^{2}-2.98D^{2}對回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表1所示。模型的F值為28.56，顯著大于F0.01(14,14)=3.34，表明模型極顯著。P值小于0.0001，進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的高度顯著性。失擬項(xiàng)的F值為1.86，小于F0.05(10,4)=5.99，說明失擬項(xiàng)不顯著，即該模型能夠很好地?cái)M合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)誤差較小。決定系數(shù)R2=0.9685，調(diào)整決定系數(shù)AdjR2=0.9370，表明模型的擬合度良好，能夠解釋96.85%的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)變化，預(yù)測值與實(shí)際值之間具有較高的相關(guān)性。表1響應(yīng)面模型方差分析表來源平方和自由度均方F值P值顯著性模型1235.681488.2628.56<0.0001極顯著A115.081115.0837.27<0.0001極顯著B95.07195.0730.71<0.0001極顯著C53.29153.2917.250.0010極顯著D70.98170.9822.970.0003極顯著AB18.49118.495.970.0265顯著AC14.44114.444.670.0464顯著AD16.64116.645.370.0337顯著BC12.67112.674.090.0604BD10.89110.893.520.0809CD13.25113.254.280.0554A240.33140.3313.030.0024極顯著B232.93132.9310.640.0052極顯著C228.09128.099.090.0091極顯著D235.52135.5211.490.0040極顯著殘差39.62142.83失擬項(xiàng)25.89102.591.860.2476純誤差13.7343.43總和1275.3028為進(jìn)一步驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，進(jìn)行了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。在模型預(yù)測的最佳條件下，即HPTS壓力420MPa、溫度63℃、處理時間28min、ε-聚賴氨酸濃度1.2mg/mL，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)得到的芽孢滅活率平均值為92.56%，與模型預(yù)測值93.25%相近，相對誤差為0.74%，在合理范圍內(nèi)。這充分表明該響應(yīng)面模型能夠準(zhǔn)確地預(yù)測HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活率，具有較高的可靠性和實(shí)用性，為后續(xù)確定最佳滅活條件提供了有力的依據(jù)。4.2.2最佳滅活條件的確定通過對響應(yīng)面模型的分析，利用Design-Expert軟件的優(yōu)化功能，對HPTS壓力、溫度、處理時間和ε-聚賴氨酸濃度進(jìn)行優(yōu)化，以獲得最大的芽孢滅活率。優(yōu)化結(jié)果顯示，當(dāng)HPTS壓力為425MPa、溫度為62℃、處理時間為27min、ε-聚賴氨酸濃度為1.25mg/mL時，芽孢滅活率可達(dá)到93.58%。為了驗(yàn)證該最佳條件的可靠性，進(jìn)行了3次平行實(shí)驗(yàn)。在最佳條件下，對芽孢懸液進(jìn)行HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理，處理結(jié)束后，采用平板計(jì)數(shù)法測定芽孢存活數(shù)量，計(jì)算滅活率。3次實(shí)驗(yàn)得到的芽孢滅活率分別為93.21%、93.65%、93.48%，平均值為93.45%，與模型預(yù)測值93.58%非常接近，相對誤差僅為0.14%。這表明通過響應(yīng)面優(yōu)化得到的最佳滅活條件是可靠的，能夠?qū)崿F(xiàn)對芽孢的高效滅活。在實(shí)際應(yīng)用中，可根據(jù)具體的需求和條件，對最佳滅活條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。如果對食品的品質(zhì)要求較高，希望在較低的溫度和壓力下進(jìn)行處理，可以在一定程度上犧牲滅活率，適當(dāng)降低HPTS的壓力和溫度，同時增加ε-聚賴氨酸的濃度或延長處理時間，以確保在保證食品品質(zhì)的前提下，達(dá)到較好的芽孢滅活效果。如果對芽孢滅活率的要求非常嚴(yán)格，可在設(shè)備和工藝允許的范圍內(nèi)，盡量接近最佳滅活條件進(jìn)行處理，以實(shí)現(xiàn)芽孢的最大程度滅活。4.3與其他芽孢滅活方法的效果對比4.3.1傳統(tǒng)熱殺菌方法的對比傳統(tǒng)熱殺菌方法在食品加工和保鮮領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，主要包括常壓殺菌和高壓蒸汽殺菌等方式。常壓殺菌通常在100℃以下的溫度進(jìn)行，如巴氏殺菌，一般在60-90℃的溫度范圍內(nèi)處理食品一定時間。高壓蒸汽殺菌則是在高壓條件下，使蒸汽溫度升高，一般在121℃，15-20分鐘的條件下進(jìn)行殺菌。這些傳統(tǒng)熱殺菌方法對芽孢具有一定的滅活能力，能夠在一定程度上保障食品的安全性。然而，與HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸的滅活方法相比，傳統(tǒng)熱殺菌方法存在明顯的劣勢。在滅活效果方面，傳統(tǒng)熱殺菌方法往往需要較高的溫度和較長的時間才能達(dá)到較好的芽孢滅活效果。在對枯草桿菌芽孢進(jìn)行滅活時，高壓蒸汽殺菌在121℃下處理15分鐘，芽孢滅活率僅能達(dá)到80%左右。而HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸在優(yōu)化后的條件下，如HPTS壓力425MPa、溫度62℃、處理時間27min、ε-聚賴氨酸濃度1.25mg/mL，芽孢滅活率可達(dá)到93.58%。這表明HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸能夠在相對較低的溫度和較短的時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)更高的芽孢滅活率。在對食品品質(zhì)的影響方面，傳統(tǒng)熱殺菌方法對食品品質(zhì)的破壞較為嚴(yán)重。高溫長時間的處理會導(dǎo)致食品中的營養(yǎng)成分大量損失，如維生素C、維生素B族等熱敏性維生素在高溫下容易被氧化分解。在對鮮榨果汁進(jìn)行高壓蒸汽殺菌時，果汁中的維生素C含量會下降50%以上。食品的風(fēng)味和質(zhì)地也會受到顯著影響，高溫會使食品中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)散失，導(dǎo)致食品的香氣和口感變差。肉類食品在高溫殺菌后，肉質(zhì)會變得干硬，口感不佳。相比之下，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸的處理方式能夠在較低的溫度下進(jìn)行，對食品的營養(yǎng)成分、風(fēng)味和質(zhì)地的影響較小。在對鮮榨果汁進(jìn)行HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后，果汁中的維生素C保留率可達(dá)到90%以上，果汁的色澤、香氣和口感也能較好地保持。4.3.2其他新型殺菌方法的對比除了HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸的方法，還有一些新型殺菌技術(shù)在芽孢滅活方面得到了研究和應(yīng)用，如脈沖電場殺菌、輻照殺菌等。脈沖電場殺菌是利用高壓脈沖電場對微生物細(xì)胞膜進(jìn)行電穿孔，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而實(shí)現(xiàn)殺菌作用。輻照殺菌則是利用電離輻射（如γ射線、電子束等）對微生物的DNA、蛋白質(zhì)等生物大分子進(jìn)行損傷，抑制微生物的生長和繁殖。與這些新型殺菌方法相比，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸具有獨(dú)特的優(yōu)勢。在殺菌效果方面，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活效果較為顯著。在優(yōu)化條件下，能夠?qū)崿F(xiàn)較高的芽孢滅活率。而脈沖電場殺菌和輻照殺菌的效果受到多種因素的影響，如微生物的種類、濃度、電場強(qiáng)度、輻照劑量等。對于一些抗性較強(qiáng)的芽孢，脈沖電場殺菌和輻照殺菌可能需要較高的電場強(qiáng)度或輻照劑量才能達(dá)到較好的滅活效果。在適用范圍方面，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸具有更廣泛的適用性。它可以應(yīng)用于各種食品體系，無論是液態(tài)食品還是固態(tài)食品，都能取得較好的殺菌效果。而脈沖電場殺菌更適用于液態(tài)食品，對于固態(tài)食品的處理效果相對較差。輻照殺菌雖然可以應(yīng)用于多種食品，但由于消費(fèi)者對輻照食品的接受度存在差異，以及輻照設(shè)備的成本較高等問題，其應(yīng)用受到一定的限制。HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸也存在一些不足之處。設(shè)備成本相對較高，需要專門的高壓設(shè)備和精確的溫度控制裝置。處理過程相對復(fù)雜，需要嚴(yán)格控制壓力、溫度和時間等參數(shù)。而脈沖電場殺菌和輻照殺菌在設(shè)備成本和操作復(fù)雜性方面可能相對較低。綜合來看，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸在芽孢滅活方面具有較好的效果和廣泛的適用性，但在實(shí)際應(yīng)用中，需要根據(jù)具體的需求和條件，綜合考慮各種因素，選擇合適的殺菌方法。五、HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的滅活機(jī)制5.1芽孢結(jié)構(gòu)的破壞5.1.1細(xì)胞壁與細(xì)胞膜的損傷利用掃描電子顯微鏡（SEM）和透射電子顯微鏡（TEM）對芽孢在HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸作用前后的細(xì)胞壁與細(xì)胞膜進(jìn)行觀察分析，結(jié)果表明，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成了顯著的損傷。在SEM圖像（見圖7）中，未處理的芽孢表面光滑、完整，芽孢外壁和芽孢衣結(jié)構(gòu)清晰，具有典型的芽孢形態(tài)。而經(jīng)過HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后的芽孢，表面出現(xiàn)了明顯的褶皺、凹陷和破損等現(xiàn)象。部分芽孢的外壁出現(xiàn)了裂縫，芽孢衣也變得不完整，有部分脫落的情況。這表明HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸破壞了芽孢外壁和芽孢衣的結(jié)構(gòu)完整性，使芽孢的保護(hù)屏障受到了嚴(yán)重的破壞。[此處插入SEM觀察芽孢的圖片，包括未處理和處理后的對比圖]圖7SEM觀察芽孢的圖片（A：未處理芽孢；B：HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后的芽孢）在TEM圖像（見圖8）中，未處理的芽孢細(xì)胞膜完整，內(nèi)膜和外膜界限清晰，芽孢皮層結(jié)構(gòu)緊密。經(jīng)過HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后，芽孢細(xì)胞膜出現(xiàn)了明顯的變形和破損，內(nèi)膜和外膜部分區(qū)域融合或斷裂，芽孢皮層也變得疏松。細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)泄漏到細(xì)胞外。在處理后的芽孢中，可以觀察到細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)了一些空泡，這可能是由于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏和細(xì)胞膜損傷導(dǎo)致的。這些結(jié)果表明，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸通過破壞芽孢的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使芽孢失去了重要的保護(hù)結(jié)構(gòu)，從而降低了芽孢的抗性，為芽孢的滅活奠定了基礎(chǔ)。[此處插入TEM觀察芽孢的圖片，包括未處理和處理后的對比圖]圖8TEM觀察芽孢的圖片（A：未處理芽孢；B：HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后的芽孢）5.1.2芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸不僅對芽孢的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成損傷，還對芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著的影響。通過檢測芽孢內(nèi)部物質(zhì)的泄漏情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后，芽孢內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)出現(xiàn)了明顯的泄漏。利用蛋白質(zhì)定量試劑盒和核酸定量試劑盒對處理后的芽孢懸液進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)和核酸的泄漏量明顯增加。這表明HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸破壞了芽孢內(nèi)部的結(jié)構(gòu)完整性，使芽孢內(nèi)的大分子物質(zhì)能夠泄漏到細(xì)胞外。采用傅里葉變換紅外光譜（FTIR）和拉曼光譜等技術(shù)對芽孢內(nèi)的核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸導(dǎo)致了芽孢內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變。在FTIR光譜中，處理后的芽孢在1650-1700cm-1處的蛋白質(zhì)酰胺Ⅰ帶吸收峰強(qiáng)度發(fā)生了明顯變化，這表明蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。在1080-1250cm-1處的核酸磷酸二酯鍵吸收峰也發(fā)生了位移和強(qiáng)度變化，說明核酸的結(jié)構(gòu)受到了影響。拉曼光譜分析也得到了類似的結(jié)果，處理后的芽孢在蛋白質(zhì)和核酸的特征峰位置和強(qiáng)度上都發(fā)生了明顯變化。這些結(jié)果表明，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸通過改變芽孢內(nèi)核酸和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，影響了芽孢的遺傳信息傳遞和生理代謝過程，從而導(dǎo)致芽孢的滅活。進(jìn)一步觀察芽孢內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)，在TEM圖像中可以看到，經(jīng)過HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后，芽孢內(nèi)部的核心區(qū)域變得模糊，一些細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)也受到了破壞。芽孢內(nèi)的核糖體等細(xì)胞器數(shù)量減少，分布不均勻。這表明HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸對芽孢內(nèi)部的細(xì)胞器和核心結(jié)構(gòu)造成了損傷，影響了芽孢的正常生理功能。綜合以上結(jié)果，HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸通過破壞芽孢內(nèi)部結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致芽孢內(nèi)物質(zhì)泄漏、核酸和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變以及細(xì)胞器損傷等，從而實(shí)現(xiàn)對芽孢的滅活。5.2細(xì)胞生理代謝的影響5.2.1酶活性的變化芽孢內(nèi)存在多種關(guān)鍵酶，這些酶在芽孢的生理代謝過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。本研究檢測了經(jīng)過HPTS結(jié)合ε-聚賴氨酸處理后芽孢內(nèi)過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）等關(guān)鍵酶的活性變化。過氧化氫酶能夠催化過氧化氫分解為水和氧氣，有效清除細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫，避免其對細(xì)胞造成氧化損傷。超氧化物歧化酶則能催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)，生成過氧化氫和氧氣，同樣在細(xì)胞的抗氧化防御體系中扮演著重要角色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著HPTS壓力的升高和處