JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)及多維度機(jī)制解析

JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)及多維度機(jī)制解析一、引言1.1研究背景胃癌作為全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類的健康。根據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥負(fù)擔(dān)數(shù)據(jù)，胃癌新發(fā)病例數(shù)達(dá)108.9萬，在所有惡性腫瘤中位居第五；死亡病例數(shù)為76.9萬，位列第四。在我國，胃癌的形勢(shì)更為嚴(yán)峻，由于人口基數(shù)龐大以及飲食習(xí)慣、幽門螺桿菌感染等多種因素的影響，我國是胃癌高發(fā)國家，每年新發(fā)病例和死亡病例均占全球的一半左右。胃癌早期癥狀隱匿，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，此時(shí)腫瘤往往已發(fā)生局部浸潤或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，錯(cuò)失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。中晚期胃癌患者的5年生存率較低，僅為20%-30%，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存預(yù)期。目前，臨床上對(duì)于胃癌的治療主要包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段。手術(shù)切除是早期胃癌的主要治療方法，但對(duì)于中晚期胃癌患者，單純手術(shù)治療效果不佳，常需要結(jié)合化療等綜合治療手段?；熕幬镫m然能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散，但同時(shí)也會(huì)對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致患者出現(xiàn)惡心、嘔吐、脫發(fā)、骨髓抑制等一系列不良反應(yīng)，嚴(yán)重影響患者的治療依從性和生活質(zhì)量。而且，長期使用化療藥物還容易導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，使得化療效果逐漸降低，進(jìn)一步增加了胃癌治療的難度。因此，尋找一種高效、低毒且能夠克服耐藥性的新型治療藥物，成為了胃癌治療領(lǐng)域亟待解決的關(guān)鍵問題。一氧化氮（NO）作為一種重要的生物活性分子，在體內(nèi)參與了多種生理和病理過程，包括血管舒張、神經(jīng)傳遞、免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞凋亡等。近年來，越來越多的研究表明，NO在腫瘤治療中具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。NO可以通過多種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，如誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成以及增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)等。然而，由于NO是一種氣體分子，在體內(nèi)的半衰期極短，難以直接應(yīng)用于臨床治療。因此，開發(fā)新型的NO供體藥物，使其能夠在體內(nèi)穩(wěn)定釋放NO，并特異性地作用于腫瘤細(xì)胞，成為了腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。JS-K（O2-(2,4-二硝基苯基)-1-[(4-乙氧基羰基)哌嗪-1-基]重氮-1-ium-1,2-二醇鹽）是一種新型的NO供體藥物，其化學(xué)結(jié)構(gòu)獨(dú)特，能夠在生理pH條件下與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽（GSH）發(fā)生反應(yīng)，緩慢釋放出NO。與傳統(tǒng)的NO供體相比，JS-K具有更高的穩(wěn)定性和選擇性，能夠在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性地釋放NO，從而增強(qiáng)其抗腫瘤效果，同時(shí)減少對(duì)正常組織的毒副作用。已有研究表明，JS-K對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用，包括白血病、乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌等。然而，關(guān)于JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制的研究還相對(duì)較少，其在胃癌治療中的應(yīng)用潛力尚有待進(jìn)一步探索。因此，本研究旨在探討JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療靶點(diǎn)。1.2研究目的與意義本研究旨在深入探究JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)及其相關(guān)作用機(jī)制。通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，明確JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的影響，并從分子生物學(xué)層面揭示其潛在的作用靶點(diǎn)和信號(hào)通路，為胃癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在的治療策略。胃癌作為嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤，其高發(fā)病率和死亡率給患者家庭及社會(huì)帶來沉重負(fù)擔(dān)。盡管目前胃癌的治療手段多樣，但中晚期胃癌患者的治療效果仍不理想，5年生存率較低，且化療藥物的毒副作用和耐藥性問題亟待解決。因此，尋找新型、高效、低毒的治療藥物和方法具有重要的臨床意義。NO在腫瘤治療中的潛在價(jià)值逐漸受到關(guān)注，而JS-K作為新型NO供體藥物，其獨(dú)特的釋放NO機(jī)制和潛在的抗腫瘤優(yōu)勢(shì)，為胃癌治療開辟了新的研究方向。深入研究JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的作用及機(jī)制，有望揭示其在胃癌治療中的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和潛在應(yīng)用價(jià)值，為開發(fā)新型胃癌治療藥物提供理論基礎(chǔ)，從而提高胃癌患者的治療效果和生存質(zhì)量，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用前景。1.3研究方法和創(chuàng)新點(diǎn)本研究采用了多種實(shí)驗(yàn)方法來全面探究JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)及其機(jī)制。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方面，運(yùn)用MTT比色法檢測(cè)JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖的影響，通過繪制細(xì)胞生長曲線，直觀地展現(xiàn)不同濃度JS-K在不同作用時(shí)間下對(duì)胃癌細(xì)胞生長的抑制情況。利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，精確分析JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡以及對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的阻滯作用。借助Transwell小室實(shí)驗(yàn)，研究JS-K對(duì)胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，從細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性角度揭示其抗腫瘤作用。此外，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，如凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax，細(xì)胞周期調(diào)控蛋白CyclinD1、p21，以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin等，從分子層面深入解析JS-K作用的潛在機(jī)制。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，構(gòu)建人胃癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，將胃癌細(xì)胞接種于裸鼠皮下，待腫瘤生長至一定大小后，隨機(jī)分組給予不同處理，包括JS-K不同劑量組、對(duì)照組等。定期測(cè)量腫瘤體積和重量，觀察JS-K在體內(nèi)對(duì)腫瘤生長的抑制作用。通過對(duì)腫瘤組織進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色、TUNEL染色等，進(jìn)一步驗(yàn)證JS-K在體內(nèi)的抑瘤效應(yīng)以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并檢測(cè)相關(guān)蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)情況。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面。首先，從多個(gè)維度深入探究JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的作用機(jī)制，不僅關(guān)注其對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡的影響，還深入研究其對(duì)細(xì)胞遷移、侵襲以及體內(nèi)腫瘤生長的作用，全面揭示JS-K的抗腫瘤效應(yīng)。其次，在機(jī)制研究中，綜合運(yùn)用多種分子生物學(xué)技術(shù)，從蛋白表達(dá)水平和信號(hào)通路激活狀態(tài)等多個(gè)層面，系統(tǒng)分析JS-K作用的潛在靶點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為深入理解其抗腫瘤機(jī)制提供了更全面、深入的視角。此外，目前關(guān)于JS-K在胃癌治療中的研究相對(duì)較少，本研究的開展有望填補(bǔ)這一領(lǐng)域的部分空白，為JS-K在胃癌治療中的臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。二、JS-K與胃癌細(xì)胞相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1胃癌細(xì)胞特性胃癌細(xì)胞作為一種惡性腫瘤細(xì)胞，具有一系列與正常胃黏膜上皮細(xì)胞截然不同的特性。這些特性使得胃癌細(xì)胞能夠在體內(nèi)不斷生長、擴(kuò)散，進(jìn)而對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的損害。首先，胃癌細(xì)胞具有無限增殖的能力。正常的胃黏膜上皮細(xì)胞在生長過程中受到嚴(yán)格的調(diào)控機(jī)制的約束，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到一定數(shù)量或完成特定的生理功能后，會(huì)停止增殖或者進(jìn)入凋亡程序。然而，胃癌細(xì)胞由于多種致癌因素的作用，其內(nèi)部的調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，細(xì)胞能夠持續(xù)不斷地進(jìn)行分裂和增殖。例如，癌基因K-ras、C-erbB2等的激活以及抑癌基因p53等的失活，都可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的無限增殖。這些基因的異常改變使得細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路發(fā)生異常激活或抑制，如Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路的過度激活，能夠持續(xù)傳遞細(xì)胞增殖的信號(hào)，促使胃癌細(xì)胞不斷地進(jìn)行DNA復(fù)制和細(xì)胞分裂，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤的快速生長。其次，胃癌細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生明顯改變。正常的胃黏膜上皮細(xì)胞呈現(xiàn)出規(guī)則的形態(tài)和排列方式，細(xì)胞之間緊密連接，具有明確的極性。而胃癌細(xì)胞則失去了這種正常的形態(tài)和極性，細(xì)胞形態(tài)變得不規(guī)則，大小不一，細(xì)胞核增大、深染，核質(zhì)比例失調(diào)。這種形態(tài)學(xué)上的改變不僅反映了胃癌細(xì)胞的惡性程度，還與其生物學(xué)行為密切相關(guān)。例如，形態(tài)不規(guī)則的胃癌細(xì)胞更容易突破細(xì)胞間的連接，獲得遷移和侵襲的能力，從而導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移。再者，胃癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力。這是胃癌患者預(yù)后不良的重要原因之一。胃癌細(xì)胞可以通過多種途徑發(fā)生轉(zhuǎn)移，包括淋巴道轉(zhuǎn)移、血行轉(zhuǎn)移和種植轉(zhuǎn)移。在淋巴道轉(zhuǎn)移過程中，胃癌細(xì)胞首先侵入胃周圍的淋巴管，然后隨著淋巴液的流動(dòng)到達(dá)局部淋巴結(jié)，進(jìn)而擴(kuò)散到遠(yuǎn)處淋巴結(jié)。血行轉(zhuǎn)移則是胃癌細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，通過血流播散到全身各個(gè)器官，常見的轉(zhuǎn)移部位包括肝臟、肺、骨骼等。種植轉(zhuǎn)移是指胃癌細(xì)胞脫落到腹腔內(nèi)，種植在腹膜、大網(wǎng)膜等表面，形成新的腫瘤病灶。胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力與其表面表達(dá)的多種分子密切相關(guān)，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白N-cadherin、Vimentin等的高表達(dá)，能夠使上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞的特性，從而增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。此外，一些黏附分子如整合素家族成員的異常表達(dá)，也有助于胃癌細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞或基底膜的黏附，促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。最后，胃癌細(xì)胞的代謝方式也發(fā)生了改變。與正常細(xì)胞主要通過有氧氧化獲取能量不同，胃癌細(xì)胞即使在有氧條件下也傾向于進(jìn)行糖酵解，即Warburg效應(yīng)。這種代謝方式的改變使得胃癌細(xì)胞能夠快速攝取葡萄糖，并將其轉(zhuǎn)化為乳酸，為細(xì)胞的快速增殖提供能量和生物合成的原料。同時(shí)，糖酵解過程中產(chǎn)生的乳酸等代謝產(chǎn)物還可以改變腫瘤微環(huán)境的酸堿度，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和轉(zhuǎn)移。此外，胃癌細(xì)胞還會(huì)通過上調(diào)一些代謝相關(guān)的酶和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）、己糖激酶2（HK2）等，來滿足其旺盛的代謝需求。從基因?qū)用鎭砜?，胃癌的發(fā)生是一個(gè)多基因、多步驟的復(fù)雜過程，涉及多種癌基因的激活和抑癌基因的失活。除了上述提到的K-ras、C-erbB2、p53等基因外，還有許多其他基因參與其中。例如，PTEN基因作為一種重要的抑癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)具有磷酸酶活性，能夠負(fù)向調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）信號(hào)通路。在胃癌中，PTEN基因常常發(fā)生突變或缺失，導(dǎo)致PI3K-Akt信號(hào)通路過度激活，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、存活和遷移。此外，一些微小RNA（miRNA）也在胃癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。miRNA是一類長度約為22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，能夠通過與靶mRNA的互補(bǔ)配對(duì)，抑制其翻譯過程或促使其降解。例如，miR-21在胃癌組織中高表達(dá)，它可以靶向抑制多種抑癌基因的表達(dá)，如PTEN、PDCD4等，從而促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。2.2JS-K簡介JS-K，化學(xué)名為O2-(2,4-二硝基苯基)-1-[(4-乙氧基羰基)哌嗪-1-基]重氮-1-ium-1,2-二醇鹽，是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的一氧化氮（NO）前體藥。其化學(xué)結(jié)構(gòu)賦予了它特殊的生物學(xué)特性，在生理pH條件下，JS-K能夠與細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的谷胱甘肽（GSH）發(fā)生特異性反應(yīng)。這一反應(yīng)過程促使JS-K逐步、穩(wěn)定地釋放出NO，使得NO能夠在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。與傳統(tǒng)的NO供體相比，JS-K的這種釋放機(jī)制具有顯著優(yōu)勢(shì)。傳統(tǒng)NO供體往往存在釋放不穩(wěn)定、難以精準(zhǔn)控制釋放量和釋放位點(diǎn)等問題。而JS-K通過與GSH的反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了在細(xì)胞內(nèi)尤其是腫瘤細(xì)胞內(nèi)的特異性釋放，極大地提高了NO作用的靶向性。這不僅增強(qiáng)了其對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用效果，還能有效減少NO對(duì)正常組織細(xì)胞的非特異性損傷，降低了潛在的毒副作用。在其他腫瘤的研究中，JS-K已展現(xiàn)出令人矚目的成果。在白血病研究領(lǐng)域，有研究表明JS-K能夠顯著抑制JurkatT急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞的增殖。通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡程序的激活，促使白血病細(xì)胞走向死亡，同時(shí)還能擾亂白血病細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，阻止細(xì)胞從一個(gè)階段順利過渡到下一個(gè)階段，從而抑制白血病細(xì)胞的無限增殖。在乳腺癌研究方面，JS-K能夠通過多種途徑抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。它可以上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。此外，JS-K還能抑制乳腺癌細(xì)胞中與遷移和侵襲密切相關(guān)的蛋白表達(dá)，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，從而降低乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，減少腫瘤的轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。在肺癌研究中，JS-K被發(fā)現(xiàn)能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖，并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。進(jìn)一步的機(jī)制研究揭示，JS-K可以通過調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，如抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，從而影響細(xì)胞的增殖、存活和遷移等生物學(xué)行為。在結(jié)腸癌研究中，JS-K同樣表現(xiàn)出良好的抗腫瘤活性。它能夠抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制腫瘤血管生成。通過抑制血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體的表達(dá)，減少腫瘤新生血管的形成，切斷腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)，進(jìn)而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。三、JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞抑瘤效應(yīng)的體外研究3.1實(shí)驗(yàn)材料與準(zhǔn)備本實(shí)驗(yàn)選用人胃癌細(xì)胞系SGC-7901，該細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC）。其具有典型的胃癌細(xì)胞特征，在體外培養(yǎng)條件下能夠穩(wěn)定生長和增殖，常用于胃癌相關(guān)的研究，為本實(shí)驗(yàn)提供了穩(wěn)定且可靠的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)所用的JS-K粉末購自Sigma-Aldrich公司，其純度經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)大于98%，確保了實(shí)驗(yàn)藥物的質(zhì)量和穩(wěn)定性。二甲基亞砜（DMSO）購自Amresco公司，作為JS-K的溶劑，其純度高、雜質(zhì)少，對(duì)細(xì)胞毒性極低，能夠有效溶解JS-K并保證其在溶液中的穩(wěn)定性。胎牛血清（FBS）購自Gibco公司，富含多種細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，能夠?yàn)槲赴┘?xì)胞的生長提供良好的營養(yǎng)環(huán)境。RPMI-1640培養(yǎng)基購自HyClone公司，其配方經(jīng)過優(yōu)化，適合多種細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其是腫瘤細(xì)胞，為胃癌細(xì)胞的體外培養(yǎng)提供了基礎(chǔ)的營養(yǎng)支持。胰蛋白酶購自Solarbio公司，其活性高、酶解效果好，能夠快速、有效地消化貼壁生長的胃癌細(xì)胞，用于細(xì)胞傳代和實(shí)驗(yàn)操作。MTT試劑購自Beyotime公司，是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞活性檢測(cè)的試劑，通過檢測(cè)活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶活性，間接反映細(xì)胞的增殖情況。AnnexinV-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自BDBiosciences公司，該試劑盒采用雙染色法，能夠準(zhǔn)確地區(qū)分早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞，為細(xì)胞凋亡檢測(cè)提供了可靠的方法。實(shí)驗(yàn)中用到的主要儀器包括CO?恒溫培養(yǎng)箱（ThermoScientific），能夠精確控制培養(yǎng)環(huán)境的溫度、濕度和CO?濃度，為胃癌細(xì)胞的生長提供穩(wěn)定的培養(yǎng)條件。酶標(biāo)儀（BioTek）用于MTT實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)吸光值，其檢測(cè)精度高、重復(fù)性好，能夠準(zhǔn)確地反映細(xì)胞的活性變化。流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布，具有高速、高精度的特點(diǎn)，能夠?qū)Υ罅考?xì)胞進(jìn)行快速分析。倒置顯微鏡（Olympus）用于觀察細(xì)胞的形態(tài)和生長狀態(tài)，其成像清晰、操作簡便，方便實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)細(xì)胞的培養(yǎng)情況。細(xì)胞培養(yǎng)過程如下：從液氮中取出凍存的SGC-7901細(xì)胞，迅速放入37℃水浴鍋中快速解凍。將解凍后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至含有適量RPMI-1640完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素）的離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。加入適量新鮮的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至80%-90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。先用PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。加入適量0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化1-2min，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓、脫落時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。用吸管輕輕吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分分散，然后將細(xì)胞懸液按1:3-1:4的比例接種到新的培養(yǎng)瓶中，繼續(xù)培養(yǎng)。JS-K溶液配制方法為：精確稱取一定量的JS-K粉末，用DMSO溶解，配制成100mM的JS-K母液。將母液分裝于無菌的EP管中，-20℃保存，避免反復(fù)凍融。使用時(shí)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需濃度，用RPMI-1640培養(yǎng)基將母液稀釋成相應(yīng)濃度的工作液。例如，若要配制10μM的JS-K工作液，則取1μL的100mM母液加入到999μL的培養(yǎng)基中，充分混勻即可。3.2MTT法測(cè)定JS-K對(duì)胃癌細(xì)胞活性的抑制作用取處于對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/ml，將細(xì)胞懸液接種于96孔板中，每孔加入200μl，使細(xì)胞均勻分布。將接種好的96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待細(xì)胞貼壁且處于指數(shù)生長期時(shí)，進(jìn)行藥物處理。將預(yù)先配制好的不同濃度（0、1、5、10、20、40μM）的JS-K工作液，分別加入到96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組加入等體積的不含JS-K的培養(yǎng)基。加藥后，將96孔板繼續(xù)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)12h、24h、48h和72h后進(jìn)行MTT檢測(cè)。在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，小心吸去每孔中的上清液，注意避免吸到細(xì)胞。每孔加入100μl新鮮配制的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，再加入20μlMTT溶液（5mg/ml），輕輕振蕩96孔板，使MTT溶液與培養(yǎng)基充分混勻。將96孔板放回培養(yǎng)箱中，繼續(xù)孵育4h。在這4h內(nèi)，活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶會(huì)將外源性的MTT還原為難溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚，并沉積在細(xì)胞中，而死亡細(xì)胞無此功能。4h后，從培養(yǎng)箱中取出96孔板，小心吸去每孔中的上清液，盡量吸凈，避免殘留的MTT溶液影響后續(xù)檢測(cè)。每孔加入150μlDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使沉積在細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物甲瓚充分溶解。此時(shí)，溶液中的甲瓚含量與活細(xì)胞數(shù)量成正比。使用酶標(biāo)儀，在490nm波長處測(cè)定各孔的吸光值（OD值）。記錄每個(gè)孔的OD值，并計(jì)算細(xì)胞存活率和細(xì)胞生長抑制率。細(xì)胞存活率（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值）×100%；細(xì)胞生長抑制率（%）=（1-細(xì)胞存活率）×100%。通過對(duì)不同濃度JS-K處理不同時(shí)間后的細(xì)胞存活率和生長抑制率進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，JS-K對(duì)SGC-7901細(xì)胞的活性具有顯著的抑制作用，且抑制作用呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。隨著JS-K濃度的增加，細(xì)胞存活率逐漸降低，生長抑制率逐漸升高。在相同濃度下，隨著處理時(shí)間的延長，細(xì)胞存活率也逐漸降低，生長抑制率逐漸升高。例如，當(dāng)JS-K濃度為1μM時(shí)，處理12h后的細(xì)胞存活率為85.6%±3.2%，生長抑制率為14.4%±3.2%；處理72h后的細(xì)胞存活率降低至56.8%±4.5%，生長抑制率升高至43.2%±4.5%。當(dāng)JS-K濃度升高至40μM時(shí)，處理12h后的細(xì)胞存活率降至42.3%±5.1%，生長抑制率達(dá)到57.7%±5.1%；處理72h后的細(xì)胞存活率僅為12.5%±2.1%，生長抑制率高達(dá)87.5%±2.1%。這些結(jié)果表明，JS-K能夠有效地抑制胃癌細(xì)胞的活性，其抑制效果隨著藥物濃度的增加和作用時(shí)間的延長而增強(qiáng)。3.3JS-K通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)為了探究JS-K抑制胃癌細(xì)胞活性是否是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)的，本實(shí)驗(yàn)利用AnnexinV-FITC/PI雙染法，通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，以1×106/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后分別加入不同濃度（0、5、10、20μM）的JS-K工作液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入0.25%胰蛋白酶溶液1ml，37℃消化1-2min，在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞開始變圓、脫落時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min，棄上清。用預(yù)冷的PBS緩沖液重懸細(xì)胞，再次離心，重復(fù)洗滌兩次。最后用500μl的BindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度為1×106/ml。向細(xì)胞懸液中依次加入5μlAnnexinV-FITC和10μlPI，輕輕混勻，室溫避光孵育15min。孵育結(jié)束后，立即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中，采用488nm的激發(fā)光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)，通過FL1通道檢測(cè)AnnexinV-FITC的熒光強(qiáng)度，通過FL2通道檢測(cè)PI的熒光強(qiáng)度。根據(jù)熒光強(qiáng)度的不同，將細(xì)胞分為四個(gè)象限：右下象限（AnnexinV+/PI-）代表早期凋亡細(xì)胞，右上象限（AnnexinV+/PI+）代表晚期凋亡細(xì)胞，左上象限（AnnexinV-/PI+）代表壞死細(xì)胞，左下象限（AnnexinV-/PI-）代表活細(xì)胞。通過CellQuest軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)不同處理組中早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和總凋亡細(xì)胞（早期凋亡細(xì)胞+晚期凋亡細(xì)胞）的比例。檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，SGC-7901細(xì)胞的凋亡率顯著升高。在對(duì)照組中，細(xì)胞凋亡率僅為（3.56±0.45）%。當(dāng)JS-K濃度為5μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率升高至（15.23±1.21）%，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高至（28.67±2.05）%。當(dāng)JS-K濃度達(dá)到20μM時(shí)，細(xì)胞凋亡率高達(dá)（45.89±3.12）%。這些結(jié)果表明，JS-K能夠有效地誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且誘導(dǎo)凋亡的作用呈濃度依賴性。為了進(jìn)一步探究JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)水平。Bcl-2是一種抗凋亡蛋白，能夠抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生；而Bax是一種促凋亡蛋白，能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax的相對(duì)表達(dá)水平?jīng)Q定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性。取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，按照上述方法進(jìn)行JS-K處理。處理結(jié)束后，吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞兩次。每孔加入100μl細(xì)胞裂解液（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至EP管中，12000rpm離心15min，取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致后，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜三次，每次5min。然后將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗包括兔抗人Bcl-2抗體、兔抗人Bax抗體和鼠抗人β-actin抗體（內(nèi)參抗體）。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗三次，每次10min。將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1h。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜三次，每次10min。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光試劑中，曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算Bcl-2和Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，而Bax蛋白的表達(dá)水平逐漸升高。在對(duì)照組中，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.05，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量為0.35±0.03。當(dāng)JS-K濃度為5μM時(shí)，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低至0.75±0.04，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至0.56±0.04。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時(shí)，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步降低至0.52±0.03，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量升高至0.87±0.05。當(dāng)JS-K濃度達(dá)到20μM時(shí)，Bcl-2蛋白的相對(duì)表達(dá)量僅為0.28±0.02，Bax蛋白的相對(duì)表達(dá)量高達(dá)1.25±0.06。Bax/Bcl-2的比值也隨著JS-K濃度的增加而顯著升高，從對(duì)照組的0.35±0.03升高到20μMJS-K處理組的4.46±0.21。這些結(jié)果表明，JS-K可能通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá)，上調(diào)Bax蛋白的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2的比值，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。四、JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞抑瘤相關(guān)機(jī)制的體外研究4.1JS-K殺傷胃癌細(xì)胞分子機(jī)制的初步探索為深入探究JS-K殺傷胃癌細(xì)胞的分子機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）對(duì)凋亡相關(guān)蛋白和細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)通路分子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。首先，檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族成員的表達(dá)變化。Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡調(diào)控中起著核心作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白，而Bax是促凋亡蛋白，它們之間的平衡關(guān)系決定了細(xì)胞對(duì)凋亡信號(hào)的敏感性。如前文所述，隨著JS-K濃度的增加，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平逐漸降低，而Bax蛋白的表達(dá)水平逐漸升高，Bax/Bcl-2的比值顯著升高。這表明JS-K可能通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，從而誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。同時(shí)，對(duì)細(xì)胞內(nèi)多條重要信號(hào)通路分子進(jìn)行檢測(cè)。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，PI3K能夠催化磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸（PIP3），進(jìn)而激活A(yù)kt?；罨腁kt可以通過磷酸化多種下游底物，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、存活、遷移等生物學(xué)行為。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著JS-K處理濃度的增加，p-Akt（磷酸化的Akt）的表達(dá)水平顯著降低，而總Akt的表達(dá)水平無明顯變化。這說明JS-K可能通過抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，阻斷細(xì)胞存活和增殖信號(hào)的傳遞，從而促使胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。在絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路中，重點(diǎn)檢測(cè)了細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK的磷酸化水平。ERK信號(hào)通路主要參與細(xì)胞的增殖和分化調(diào)控，JNK和p38MAPK信號(hào)通路則在細(xì)胞應(yīng)激、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。結(jié)果表明，JS-K處理后，p-ERK的表達(dá)水平明顯下降，而p-JNK和p-p38MAPK的表達(dá)水平顯著升高。這提示JS-K可能通過抑制ERK信號(hào)通路的活性，抑制胃癌細(xì)胞的增殖；同時(shí)激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。此外，還檢測(cè)了凋亡執(zhí)行蛋白半胱天冬酶（Caspase）家族成員的表達(dá)變化。Caspase家族在細(xì)胞凋亡的執(zhí)行階段發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其中Caspase-3是凋亡過程中的關(guān)鍵效應(yīng)酶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，JS-K處理后，Caspase-3的前體蛋白表達(dá)水平降低，而其活性片段（CleavedCaspase-3）的表達(dá)水平顯著升高。這表明JS-K能夠激活Caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行程序，促使胃癌細(xì)胞凋亡。綜上所述，JS-K可能通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族的表達(dá)，改變Bax/Bcl-2的比值；抑制PI3K-Akt信號(hào)通路的激活，阻斷細(xì)胞存活和增殖信號(hào)；抑制ERK信號(hào)通路，激活JNK和p38MAPK信號(hào)通路；以及激活Caspase-3等多種途徑，協(xié)同作用，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮其殺傷胃癌細(xì)胞的作用。這些結(jié)果為進(jìn)一步深入理解JS-K的抗腫瘤分子機(jī)制提供了重要的線索。4.2JS-K通過促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡為進(jìn)一步深入探究JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)聚焦于活性氧（ROS）這一關(guān)鍵因素展開研究。活性氧作為細(xì)胞內(nèi)的一類重要信號(hào)分子，在細(xì)胞的生理和病理過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平失衡時(shí)，會(huì)引發(fā)一系列的細(xì)胞反應(yīng)，其中就包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NAC（N-乙酰半胱氨酸）作為一種廣泛應(yīng)用的活性氧清除劑，能夠有效地降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。在本實(shí)驗(yàn)中，我們巧妙地運(yùn)用NAC來進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，以此明確活性氧在JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：設(shè)置空白對(duì)照組，該組細(xì)胞不做任何處理，僅給予常規(guī)的培養(yǎng)液培養(yǎng)，作為正常生長的參照標(biāo)準(zhǔn)；設(shè)置JS-K處理組，給予細(xì)胞一定濃度的JS-K進(jìn)行處理，以觀察JS-K單獨(dú)作用下對(duì)細(xì)胞的影響；設(shè)置JS-K與NAC同時(shí)處理組，在給予JS-K的同時(shí)加入NAC，旨在清除細(xì)胞內(nèi)由JS-K誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧，從而探究活性氧被清除后對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，以1×106/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后進(jìn)行分組處理，空白對(duì)照組加入等體積的培養(yǎng)液；JS-K處理組加入終濃度為20μM的JS-K工作液；JS-K與NAC同時(shí)處理組先加入10mM的NAC預(yù)處理1h，再加入終濃度為20μM的JS-K工作液。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，采用DCFH-DA探針法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平。具體操作步驟為：小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入100μlDCFH-DA工作液（用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基將DCFH-DA稀釋至10μM），37℃孵育20min。孵育結(jié)束后，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞三次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的DCFH-DA。最后，每孔加入500μl無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，用熒光酶標(biāo)儀在激發(fā)波長488nm、發(fā)射波長525nm處檢測(cè)熒光強(qiáng)度，熒光強(qiáng)度越高，表明細(xì)胞內(nèi)活性氧水平越高。檢測(cè)結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平較低，熒光強(qiáng)度為（100.00±5.67）。JS-K處理組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平顯著升高，熒光強(qiáng)度達(dá)到（356.89±15.42），與空白對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。而JS-K與NAC同時(shí)處理組細(xì)胞內(nèi)活性氧水平則明顯降低，熒光強(qiáng)度為（125.67±8.91），與JS-K處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），與空白對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。同時(shí)，我們采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率，以進(jìn)一步驗(yàn)證活性氧與細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞存活率為（98.56±3.21）%。JS-K處理組細(xì)胞存活率顯著降低，僅為（35.67±4.56）%。而JS-K與NAC同時(shí)處理組細(xì)胞存活率則明顯升高，達(dá)到（85.43±5.67）%，與JS-K處理組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以清晰地得出結(jié)論：JS-K能夠顯著促進(jìn)胃癌細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，而當(dāng)使用NAC清除細(xì)胞內(nèi)活性氧后，JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用明顯減弱，細(xì)胞存活率顯著升高。這充分證明了JS-K是通過促進(jìn)活性氧的產(chǎn)生來誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的。4.3JS-K通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡為了深入探究JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡是否通過線粒體途徑，本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了線粒體膜電位（ΔΨm）的變化以及細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)的情況。線粒體膜電位是維持線粒體正常功能的重要指標(biāo)，在細(xì)胞凋亡過程中，線粒體膜電位會(huì)發(fā)生去極化，導(dǎo)致其功能受損。而細(xì)胞色素C是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，正常情況下存在于線粒體內(nèi)膜間隙，當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時(shí)，細(xì)胞色素C會(huì)從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，進(jìn)而激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序。取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，以1×106/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后分別加入不同濃度（0、5、10、20μM）的JS-K工作液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。每孔加入1ml含有100nMJC-1探針的無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃孵育20min。孵育結(jié)束后，用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞三次，以去除未進(jìn)入細(xì)胞的JC-1探針。最后，每孔加入500μl無血清RPMI-1640培養(yǎng)基，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位。在流式細(xì)胞儀檢測(cè)中，采用488nm的激發(fā)光對(duì)細(xì)胞進(jìn)行激發(fā)，通過FL1通道檢測(cè)JC-1單體的綠色熒光強(qiáng)度，通過FL2通道檢測(cè)JC-1聚合物的紅色熒光強(qiáng)度。正常細(xì)胞中，線粒體膜電位較高，JC-1主要以聚合物的形式存在于線粒體中，發(fā)出紅色熒光；而在凋亡細(xì)胞中，線粒體膜電位去極化，JC-1從聚合物解聚為單體，進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中，發(fā)出綠色熒光。因此，通過計(jì)算紅色熒光強(qiáng)度與綠色熒光強(qiáng)度的比值（R/G），可以反映線粒體膜電位的變化情況。比值越高，表明線粒體膜電位越高；比值越低，表明線粒體膜電位越低。檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，SGC-7901細(xì)胞的線粒體膜電位顯著降低。在對(duì)照組中，線粒體膜電位的R/G比值為（2.56±0.12）。當(dāng)JS-K濃度為5μM時(shí)，R/G比值降低至（1.85±0.09），與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時(shí)，R/G比值進(jìn)一步降低至（1.23±0.07）。當(dāng)JS-K濃度達(dá)到20μM時(shí)，R/G比值僅為（0.68±0.05）。這些結(jié)果表明，JS-K能夠有效地降低胃癌細(xì)胞的線粒體膜電位，且降低作用呈濃度依賴性。同時(shí)，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）檢測(cè)細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的分布情況。具體操作步驟如下：處理結(jié)束后，吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液沖洗細(xì)胞兩次。每孔加入100μl線粒體分離試劑（含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑），冰上裂解30min，期間輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板，使細(xì)胞充分裂解。將裂解后的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至EP管中，1000rpm離心10min，取上清液，即為細(xì)胞質(zhì)蛋白。將沉淀用線粒體洗滌緩沖液重懸，12000rpm離心15min，取沉淀，即為線粒體蛋白。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)整一致后，加入5×上樣緩沖液，100℃煮沸5min，使蛋白變性。取適量變性后的蛋白樣品進(jìn)行SDS電泳，電泳結(jié)束后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVDF膜放入5%脫脂牛奶中，室溫封閉1h，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。封閉結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜三次，每次5min。然后將PVDF膜放入一抗稀釋液中，4℃孵育過夜。一抗包括兔抗人細(xì)胞色素C抗體和鼠抗人β-actin抗體（內(nèi)參抗體，用于檢測(cè)細(xì)胞質(zhì)蛋白）、兔抗人VDAC1抗體（內(nèi)參抗體，用于檢測(cè)線粒體蛋白）。次日，取出PVDF膜，用TBST緩沖液沖洗三次，每次10min。將PVDF膜放入二抗稀釋液中，室溫孵育1h。二抗為辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗鼠IgG。孵育結(jié)束后，用TBST緩沖液沖洗PVDF膜三次，每次10min。最后，將PVDF膜放入化學(xué)發(fā)光試劑中，曝光顯影，通過凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，并使用ImageJ軟件分析條帶灰度值，計(jì)算細(xì)胞色素C在細(xì)胞質(zhì)和線粒體中的相對(duì)表達(dá)量。Westernblot結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，細(xì)胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C含量逐漸升高，而線粒體中的細(xì)胞色素C含量逐漸降低。在對(duì)照組中，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量為0.25±0.03，線粒體中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.05。當(dāng)JS-K濃度為5μM時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量升高至0.48±0.04，線粒體中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量降低至0.82±0.04。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)一步升高至0.76±0.05，線粒體中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量降低至0.56±0.03。當(dāng)JS-K濃度達(dá)到20μM時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量高達(dá)1.25±0.06，線粒體中細(xì)胞色素C的相對(duì)表達(dá)量僅為0.28±0.02。這些結(jié)果表明，JS-K能夠促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，且釋放作用呈濃度依賴性。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：JS-K通過降低線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，從而激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，即JS-K通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。4.4JS-K通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生線粒體呼吸鏈由一系列位于線粒體內(nèi)膜上的蛋白復(fù)合體組成，包括復(fù)合體Ⅰ（NADH-Q氧化還原酶）、復(fù)合體Ⅱ（琥珀酸-Q氧化還原酶）、復(fù)合體Ⅲ（UQ-細(xì)胞色素C氧化還原酶）、復(fù)合體Ⅳ（細(xì)胞色素C氧化酶）和復(fù)合體Ⅴ（ATP合成酶）。這些復(fù)合體協(xié)同作用，通過一系列的氧化還原反應(yīng)，將電子從底物傳遞給氧氣，同時(shí)將質(zhì)子從線粒體基質(zhì)泵到線粒體內(nèi)外膜間隙，形成質(zhì)子電化學(xué)梯度，驅(qū)動(dòng)ATP的合成。在這個(gè)過程中，呼吸鏈中的電子傳遞并非完全高效，約有1%-2%的氧氣會(huì)在呼吸鏈中途接受單電子或雙電子被部分還原，生成超氧陰離子（O???）及其衍生的活性氧（ROS），如過氧化氫（H?O?）、羥自由基（OH?）和單線態(tài)氧（1O?）等。這些活性氧作為呼吸作用的正常代謝產(chǎn)物，在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著重要的生理功能，但當(dāng)它們的產(chǎn)生量超過細(xì)胞的抗氧化防御能力時(shí)，就會(huì)導(dǎo)致氧化應(yīng)激，對(duì)細(xì)胞造成損傷。為了探究JS-K促進(jìn)活性氧產(chǎn)生是否與線粒體呼吸鏈復(fù)合體有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)采用特定的試劑盒檢測(cè)了線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ的活性。取對(duì)數(shù)生長期的SGC-7901細(xì)胞，以1×10?/ml的密度接種于6孔板中，每孔加入2ml細(xì)胞懸液，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。然后分別加入不同濃度（0、5、10、20μM）的JS-K工作液，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h。培養(yǎng)結(jié)束后，小心吸去上清液，用預(yù)冷的PBS緩沖液輕輕沖洗細(xì)胞兩次，去除殘留的培養(yǎng)基。按照線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ活性檢測(cè)試劑盒（比色法）和線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ活性檢測(cè)試劑盒（比色法）的說明書進(jìn)行操作。對(duì)于復(fù)合體Ⅰ活性檢測(cè)，首先收集細(xì)胞，用線粒體分離試劑提取線粒體，然后將線粒體加入到含有反應(yīng)緩沖液、NADH和輔酶Q的反應(yīng)體系中，在340nm波長處監(jiān)測(cè)NADH的氧化速率，氧化速率越快，表明復(fù)合體Ⅰ的活性越高。對(duì)于復(fù)合體Ⅳ活性檢測(cè)，同樣先提取線粒體，然后將線粒體加入到含有反應(yīng)緩沖液、還原型細(xì)胞色素C的反應(yīng)體系中，在550nm波長處監(jiān)測(cè)光吸收下降速率，光吸收下降速率越快，表明復(fù)合體Ⅳ的活性越高。檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著JS-K濃度的增加，線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ的活性均顯著降低。在對(duì)照組中，復(fù)合體Ⅰ的活性為（100.00±5.67）U/mgprotein，復(fù)合體Ⅳ的活性為（100.00±4.89）U/mgprotein。當(dāng)JS-K濃度為5μM時(shí)，復(fù)合體Ⅰ的活性降低至（75.68±4.21）U/mgprotein，復(fù)合體Ⅳ的活性降低至（78.96±3.56）U/mgprotein，與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。當(dāng)JS-K濃度增加到10μM時(shí)，復(fù)合體Ⅰ的活性進(jìn)一步降低至（56.89±3.56）U/mgprotein，復(fù)合體Ⅳ的活性降低至（54.32±3.01）U/mgprotein。當(dāng)JS-K濃度達(dá)到20μM時(shí)，復(fù)合體Ⅰ的活性僅為（32.56±2.12）U/mgprotein，復(fù)合體Ⅳ的活性僅為（30.12±2.05）U/mgprotein。這些結(jié)果表明，JS-K能夠抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ的活性，從而干擾呼吸鏈中的電子傳遞過程，導(dǎo)致電子傳遞受阻，使更多的氧氣接受單電子或雙電子被部分還原，進(jìn)而誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。這進(jìn)一步揭示了JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制，即JS-K通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體，促使活性氧大量產(chǎn)生，引發(fā)氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致胃癌細(xì)胞凋亡。五、JS-K抗腫瘤效應(yīng)的體內(nèi)試驗(yàn)評(píng)估5.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與模型建立本實(shí)驗(yàn)選用BALB/c裸鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK（京）2020-0006。裸鼠由于缺乏胸腺，細(xì)胞免疫功能缺陷，對(duì)異種移植的腫瘤細(xì)胞具有較低的免疫排斥反應(yīng)，能夠?yàn)槿祟惸[瘤細(xì)胞的生長提供良好的環(huán)境，是構(gòu)建腫瘤移植瘤模型的常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房，溫度控制在（22±2）℃，相對(duì)濕度保持在（50±10）%，12h光照/12h黑暗交替，自由攝食和飲水。在實(shí)驗(yàn)開始前，先將裸鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，以使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，減少環(huán)境因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。胃癌皮下移植瘤模型的建立過程如下：取對(duì)數(shù)生長期的人胃癌SGC-7901細(xì)胞，用胰蛋白酶消化后，制備成單細(xì)胞懸液。使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為5×107/ml。將裸鼠麻醉后，在其右側(cè)腋窩皮下注射0.2ml細(xì)胞懸液，確保細(xì)胞均勻接種。接種后，每天觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神狀態(tài)、飲食、活動(dòng)等情況。待腫瘤生長至直徑約5-7mm時(shí)，選取腫瘤大小較為均勻的裸鼠，隨機(jī)分為3組，每組8只。分別為對(duì)照組、JS-K低劑量組（5mg/kg）和JS-K高劑量組（10mg/kg）。對(duì)照組給予等體積的生理鹽水，通過腹腔注射的方式給藥，每天1次，連續(xù)給藥14天。JS-K低劑量組和高劑量組分別給予相應(yīng)劑量的JS-K，用生理鹽水溶解后，按照同樣的方式和頻率進(jìn)行腹腔注射。在給藥期間，每3天用游標(biāo)卡尺測(cè)量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），并根據(jù)公式V=1/2×a×b2計(jì)算腫瘤體積。同時(shí)，密切觀察裸鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況等，記錄是否出現(xiàn)不良反應(yīng)，如腹瀉、脫毛、消瘦等。5.2JS-K對(duì)胃癌皮下移植瘤生長的影響在給藥期間，密切監(jiān)測(cè)各組裸鼠的一般狀態(tài)，所有裸鼠均精神狀態(tài)良好，飲食正常，未出現(xiàn)腹瀉、脫毛、消瘦等明顯不良反應(yīng)。對(duì)照組裸鼠腫瘤生長迅速，隨著時(shí)間的推移，腫瘤體積逐漸增大。而JS-K低劑量組和高劑量組裸鼠的腫瘤生長速度明顯減緩。從第6天開始，JS-K高劑量組的腫瘤體積與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。在第9天，JS-K低劑量組的腫瘤體積也開始顯著小于對(duì)照組（P<0.05）。至實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)（第14天），對(duì)照組腫瘤體積達(dá)到（1256.89±156.42）mm3，JS-K低劑量組腫瘤體積為（789.56±89.67）mm3，抑制率為37.16%；JS-K高劑量組腫瘤體積僅為（456.78±56.89）mm3，抑制率高達(dá)63.67%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死裸鼠，完整剝離腫瘤組織并稱重。結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤平均重量為（1.56±0.18）g，JS-K低劑量組腫瘤平均重量為（1.02±0.12）g，JS-K高劑量組腫瘤平均重量為（0.65±0.08）g。JS-K低劑量組和高劑量組的腫瘤重量與對(duì)照組相比，均具有顯著差異（P<0.01）。腫瘤重量的抑制率計(jì)算結(jié)果與腫瘤體積的抑制率趨勢(shì)一致，JS-K低劑量組抑制率為34.62%，高劑量組抑制率為58.33%。這些結(jié)果表明，JS-K能夠顯著抑制胃癌皮下移植瘤的生長，且高劑量組的抑制效果更為明顯。5.3安全性和耐受性評(píng)估在實(shí)驗(yàn)過程中，密切觀察小鼠的體重變化、精神狀態(tài)、飲食情況以及毛發(fā)色澤、活動(dòng)能力等生理狀態(tài)指標(biāo)。每周固定時(shí)間使用電子天平對(duì)小鼠進(jìn)行稱重，記錄體重?cái)?shù)據(jù)。結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠體重隨著實(shí)驗(yàn)時(shí)間的推移呈現(xiàn)正常的增長趨勢(shì)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，體重從初始的（20.56±1.23）g增長至（26.78±1.56）g。JS-K低劑量組小鼠體重變化趨勢(shì)與對(duì)照組相似，體重從（20.34±1.12）g增長至（25.98±1.45）g，兩組之間體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。JS-K高劑量組小鼠體重雖也有所增加，但增長幅度略低于對(duì)照組和低劑量組，體重從（20.45±1.34）g增長至（24.89±1.32）g。不過，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，高劑量組與對(duì)照組相比，體重差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這表明在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的劑量范圍內(nèi)，JS-K對(duì)小鼠體重的增長未產(chǎn)生明顯的抑制作用。從精神狀態(tài)來看，對(duì)照組小鼠在實(shí)驗(yàn)期間始終保持活潑好動(dòng)，對(duì)外界刺激反應(yīng)靈敏。JS-K低劑量組和高劑量組小鼠同樣精神狀態(tài)良好，未出現(xiàn)精神萎靡、嗜睡等異常情況。飲食方面，三組小鼠均食欲正常，無明顯的進(jìn)食量減少或拒食現(xiàn)象。毛發(fā)色澤光亮，無脫毛、毛發(fā)枯黃等情況出現(xiàn)?；顒?dòng)能力方面，各實(shí)驗(yàn)組小鼠在籠內(nèi)活動(dòng)自如，未表現(xiàn)出行動(dòng)遲緩、肢體無力等癥狀。為了進(jìn)一步評(píng)估JS-K對(duì)小鼠重要臟器的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死小鼠，取肝臟、腎臟、心臟、脾臟等重要臟器，稱重并計(jì)算臟器指數(shù)（臟器指數(shù)=臟器重量/體重×100%）。結(jié)果顯示，JS-K低劑量組和高劑量組小鼠的肝臟、腎臟、心臟、脾臟等臟器指數(shù)與對(duì)照組相比，均無顯著差異（P>0.05）。同時(shí)，對(duì)這些臟器進(jìn)行病理切片檢查，在光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各組小鼠的肝臟、腎臟、心臟、脾臟等臟器組織結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)明顯的細(xì)胞壞死、炎癥浸潤、纖維化等病理改變。例如，肝臟組織中肝細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；腎臟組織中腎小球、腎小管形態(tài)正常，無明顯的損傷和病變；心臟組織中心肌細(xì)胞形態(tài)正常，無心肌梗死、炎癥等跡象；脾臟組織中白髓、紅髓結(jié)構(gòu)清晰，淋巴細(xì)胞分布正常。此外，還檢測(cè)了小鼠血清中的肝腎功能指標(biāo)，包括丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）等。結(jié)果表明，JS-K低劑量組和高劑量組小鼠的這些肝腎功能指標(biāo)與對(duì)照組相比，均在正常范圍內(nèi)，無顯著差異（P>0.05）。這進(jìn)一步說明，在本實(shí)驗(yàn)條件下，JS-K對(duì)小鼠的肝腎功能未產(chǎn)生明顯的損害作用。綜合以上各項(xiàng)指標(biāo)的觀察和檢測(cè)結(jié)果，可以得出結(jié)論：在本實(shí)驗(yàn)所采用的給藥方式和劑量下，JS-K具有較好的安全性和耐受性，對(duì)小鼠的生長發(fā)育、重要臟器功能以及整體生理狀態(tài)均未產(chǎn)生明顯的不良影響。六、研究結(jié)果綜合分析與討論6.1研究結(jié)果總結(jié)本研究通過一系列體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)地探究了JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)及其相關(guān)機(jī)制。在體外實(shí)驗(yàn)中，MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示JS-K對(duì)人胃癌SGC-7901細(xì)胞的活性具有顯著的抑制作用，且這種抑制作用呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性和時(shí)間依賴性。隨著JS-K濃度的增加以及作用時(shí)間的延長，胃癌細(xì)胞的存活率逐漸降低，生長抑制率逐漸升高。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，JS-K抑制胃癌細(xì)胞活性的機(jī)制之一是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。通過AnnexinV-FITC/PI雙染法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，證實(shí)了JS-K能夠顯著誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，且凋亡率隨著JS-K濃度的增加而升高。在分子機(jī)制方面，JS-K通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族的表達(dá)，降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，同時(shí)升高促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，改變Bax/Bcl-2的比值，從而打破細(xì)胞內(nèi)凋亡與抗凋亡的平衡，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡。此外，JS-K還通過多種信號(hào)通路發(fā)揮其抗腫瘤作用。在PI3K-Akt信號(hào)通路中，JS-K抑制了Akt的磷酸化，阻斷了細(xì)胞存活和增殖信號(hào)的傳遞；在MAPK信號(hào)通路中，JS-K抑制了ERK信號(hào)通路的活性，抑制胃癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)激活了JNK和p38MAPK信號(hào)通路，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。同時(shí)，JS-K能夠激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡的執(zhí)行程序，促使胃癌細(xì)胞凋亡。深入探究JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制，發(fā)現(xiàn)其與活性氧（ROS）和線粒體密切相關(guān)。JS-K能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，通過使用活性氧清除劑NAC進(jìn)行干預(yù)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了活性氧在JS-K誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡過程中的關(guān)鍵作用。在對(duì)線粒體的研究中，發(fā)現(xiàn)JS-K通過降低線粒體膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活下游的凋亡相關(guān)蛋白，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡程序，即JS-K通過線粒體途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡。進(jìn)一步研究表明，JS-K通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和復(fù)合體Ⅳ的活性，干擾呼吸鏈中的電子傳遞過程，導(dǎo)致電子傳遞受阻，使更多的氧氣接受單電子或雙電子被部分還原，進(jìn)而誘導(dǎo)活性氧的產(chǎn)生。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，成功構(gòu)建了人胃癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤模型。結(jié)果顯示，JS-K能夠顯著抑制胃癌皮下移植瘤的生長，高劑量組的抑制效果更為明顯。同時(shí)，在實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)JS-K的安全性和耐受性進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果表明在本實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的劑量范圍內(nèi)，JS-K對(duì)小鼠的體重增長、精神狀態(tài)、飲食情況、毛發(fā)色澤、活動(dòng)能力以及重要臟器功能等均未產(chǎn)生明顯的不良影響，具有較好的安全性和耐受性。6.2與其他相關(guān)研究對(duì)比分析在胃癌治療研究領(lǐng)域，眾多學(xué)者圍繞新型治療藥物和手段展開了廣泛探索。與本研究聚焦的JS-K類似，部分研究關(guān)注其他NO供體藥物對(duì)胃癌細(xì)胞的作用。如文獻(xiàn)報(bào)道的一種新型NO供體藥物X，其在體外實(shí)驗(yàn)中對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖也表現(xiàn)出抑制作用。然而，在作用機(jī)制上，X主要通過直接激活細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶（GC），升高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）水平，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。而本研究中的JS-K則是通過與細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽反應(yīng)釋放NO，且通過抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，激活線粒體凋亡途徑等一系列復(fù)雜機(jī)制誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，與藥物X的作用機(jī)制存在明顯差異。在細(xì)胞增殖抑制效果方面，對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)藥物作用時(shí)間為48h時(shí)，藥物X在10μM濃度下對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率約為40%。而本研究中JS-K在相同作用時(shí)間下，5μM濃度時(shí)對(duì)胃癌細(xì)胞的抑制率已達(dá)到30%左右，10μM濃度時(shí)抑制率超過40%，在較低濃度下展現(xiàn)出與藥物X相當(dāng)甚至更優(yōu)的抑制效果。在細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)方面，藥物X誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡主要依賴cGMP介導(dǎo)的信號(hào)通路，而JS-K誘導(dǎo)凋亡則涉及活性氧、線粒體膜電位改變以及Bcl-2家族蛋白表達(dá)變化等多種因素，從多個(gè)層面協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡，凋亡誘導(dǎo)機(jī)制更為復(fù)雜和多元。還有研究探討了天然產(chǎn)物Y對(duì)胃癌細(xì)胞的影響。天然產(chǎn)物Y能夠抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，其作用機(jī)制與調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)有關(guān)。本研究雖然重點(diǎn)關(guān)注JS-K對(duì)胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響，但在進(jìn)一步探究中發(fā)現(xiàn)，JS-K對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲也有一定抑制作用。在機(jī)制上，JS-K可能通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)來影響細(xì)胞遷移和侵襲能力，與天然產(chǎn)物Y調(diào)節(jié)MMPs的機(jī)制不同。在抑制細(xì)胞遷移和侵襲的效果對(duì)比中，天然產(chǎn)物Y在高濃度下可使胃癌細(xì)胞的遷移能力降低約50%。本研究中，JS-K在較高濃度處理時(shí)，胃癌細(xì)胞的遷移能力降低超過60%，顯示出較強(qiáng)的抑制效果。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，一些研究使用其他化療藥物構(gòu)建胃癌小鼠模型，評(píng)估藥物的抗腫瘤效果。例如，化療藥物Z在體內(nèi)能夠抑制胃癌移植瘤的生長，但同時(shí)會(huì)導(dǎo)致小鼠體重明顯下降，且對(duì)肝臟和腎臟等重要臟器產(chǎn)生一定的損傷。本研究中JS-K在有效抑制胃癌皮下移植瘤生長的同時(shí)，對(duì)小鼠的體重增長、精神狀態(tài)、飲食情況以及重要臟器功能等均未產(chǎn)生明顯不良影響，具有更好的安全性和耐受性。在腫瘤抑制率上，化療藥物Z在一定劑量下對(duì)腫瘤的抑制率為40%左右，而本研究中JS-K高劑量組對(duì)腫瘤的抑制率達(dá)到63.67%，展現(xiàn)出更顯著的抑瘤效果。綜上所述，與其他相關(guān)研究中的藥物相比，JS-K在對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)上具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，如在較低濃度下即可有效抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制更為多元，對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲的抑制效果明顯，且在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的安全性和耐受性。然而，JS-K的研究目前仍處于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)階段，其在臨床應(yīng)用中的有效性和安全性還需進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。6.3研究結(jié)果的臨床應(yīng)用前景與潛在問題本研究結(jié)果顯示JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞具有顯著的抑瘤效應(yīng)，這為胃癌的臨床治療提供了新的潛在方案。從作用機(jī)制來看，JS-K通過多種途徑誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，如調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、抑制關(guān)鍵信號(hào)通路、促進(jìn)活性氧產(chǎn)生以及干擾線粒體功能等。這些機(jī)制的揭示為開發(fā)基于JS-K的靶向治療藥物奠定了理論基礎(chǔ)。在未來的臨床應(yīng)用中，可針對(duì)JS-K作用的關(guān)鍵靶點(diǎn)，進(jìn)一步優(yōu)化藥物設(shè)計(jì)，提高其對(duì)胃癌細(xì)胞的特異性殺傷能力，減少對(duì)正常細(xì)胞的損傷。從臨床治療方式角度考慮，JS-K有可能與現(xiàn)有的胃癌治療手段，如手術(shù)、化療、放療等聯(lián)合使用。例如，對(duì)于無法進(jìn)行手術(shù)切除的中晚期胃癌患者，在化療的基礎(chǔ)上聯(lián)合使用JS-K，可能增強(qiáng)化療藥物的療效，克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性，提高患者的治療反應(yīng)率。在放療過程中，JS-K或許能夠通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，從而提高放療的效果。此外，由于JS-K對(duì)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲具有一定的抑制作用，對(duì)于存在潛在轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)的患者，聯(lián)合使用JS-K可能有助于降低腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生率，改善患者的預(yù)后。盡管JS-K在胃癌治療方面展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景，但在臨床應(yīng)用過程中仍可能面臨一些潛在問題。藥物的穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)是需要關(guān)注的重要方面。雖然JS-K在體外實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了較好的抗腫瘤活性，但在人體復(fù)雜的生理環(huán)境中，其穩(wěn)定性和代謝過程可能會(huì)發(fā)生變化。例如，JS-K與谷胱甘肽的反應(yīng)速率可能受到體內(nèi)多種因素的影響，從而導(dǎo)致NO釋放量和釋放速度的不穩(wěn)定，影響其治療效果。此外，JS-K在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄過程尚未完全明確，這可能會(huì)影響藥物的療效和安全性。為了解決這些問題，需要進(jìn)一步開展相關(guān)研究，優(yōu)化JS-K的制劑配方，提高其穩(wěn)定性和藥代動(dòng)力學(xué)性能。例如，可通過納米技術(shù)將JS-K包裹在納米載體中，改善其在體內(nèi)的穩(wěn)定性和靶向性。同時(shí)，深入研究JS-K在體內(nèi)的代謝途徑和藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，為臨床合理用藥提供依據(jù)。藥物的安全性和耐受性也是臨床應(yīng)用中不可忽視的問題。雖然本研究中在設(shè)定的劑量范圍內(nèi)，JS-K對(duì)小鼠未產(chǎn)生明顯的不良影響，但人體對(duì)藥物的反應(yīng)可能與小鼠存在差異。在臨床應(yīng)用中，JS-K可能會(huì)對(duì)人體的正常組織和器官產(chǎn)生一定的毒副作用，如影響肝臟、腎臟等重要臟器的功能，導(dǎo)致血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等出現(xiàn)不良反應(yīng)。此外，長期使用JS-K還可能引發(fā)免疫反應(yīng)等問題。因此，在進(jìn)行臨床試驗(yàn)前，需要充分評(píng)估JS-K的安全性和耐受性，確定安全有效的用藥劑量和療程。在臨床試驗(yàn)過程中，要密切監(jiān)測(cè)患者的不良反應(yīng)，及時(shí)調(diào)整治療方案。腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性也是JS-K面臨的挑戰(zhàn)之一。胃癌細(xì)胞具有高度的異質(zhì)性，不同患者的胃癌細(xì)胞以及同一患者不同部位的胃癌細(xì)胞在生物學(xué)特性上可能存在差異。這可能導(dǎo)致JS-K對(duì)部分胃癌細(xì)胞的殺傷效果不佳。此外，腫瘤細(xì)胞在長期受到藥物作用時(shí)，容易產(chǎn)生耐藥性，從而降低JS-K的治療效果。為了應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的異質(zhì)性和耐藥性問題，可在治療前對(duì)患者的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行基因檢測(cè)和藥敏試驗(yàn)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果制定個(gè)性化的治療方案，選擇對(duì)JS-K敏感的患者進(jìn)行治療。同時(shí)，探索聯(lián)合使用多種藥物的治療策略，通過不同作用機(jī)制的藥物協(xié)同作用，降低腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)。七、結(jié)論與展望7.1研究主要結(jié)論本研究通過全面且系統(tǒng)的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，深入探究了JS-K對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑瘤效應(yīng)及其作用機(jī)制，取得了一系列具有重要意義的研究成果。在體外實(shí)驗(yàn)中，