RIG-I可逆磷酸化：抗病毒信號(hào)調(diào)控的分子密碼與機(jī)制解析

RIG-I可逆磷酸化：抗病毒信號(hào)調(diào)控的分子密碼與機(jī)制解析一、引言1.1研究背景與意義病毒感染一直以來(lái)都是威脅人類健康的重要因素，歷史上諸多病毒引發(fā)的傳染病，如流感、艾滋病、SARS、新冠疫情等，都給人類社會(huì)帶來(lái)了沉重的打擊。這些病毒感染不僅導(dǎo)致了大量的人員傷亡，還對(duì)全球經(jīng)濟(jì)、社會(huì)秩序和人們的生活方式產(chǎn)生了深遠(yuǎn)的影響。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，每年僅流感病毒就可導(dǎo)致全球數(shù)百萬(wàn)人感染，數(shù)萬(wàn)人死亡。而像艾滋病這樣的慢性病毒感染，截至目前，全球仍有數(shù)千萬(wàn)人深受其害，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。在機(jī)體抵御病毒感染的過(guò)程中，天然免疫發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，它是機(jī)體抵御病毒入侵的第一道防線。當(dāng)病毒入侵機(jī)體后，天然免疫細(xì)胞能夠迅速識(shí)別病毒，并啟動(dòng)一系列免疫反應(yīng)來(lái)抑制病毒的復(fù)制和傳播。維甲酸誘導(dǎo)基因I（Retinoicacid-induciblegeneI，RIG-I）作為天然免疫中的關(guān)鍵模式識(shí)別受體，在抗病毒免疫應(yīng)答中占據(jù)著核心地位。RIG-I能夠特異性識(shí)別病毒復(fù)制產(chǎn)生的雙鏈RNA（double-strandedRNA，dsRNA）和5’三磷酸基團(tuán)的單鏈RNA（5’-triphosphatesingle-strandedRNA，5’ppp-ssRNA）。一旦識(shí)別到這些病毒核酸，RIG-I會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路，誘導(dǎo)I型干擾素（type-Iinterferons，IFN-I）等抗病毒因子的產(chǎn)生。I型干擾素具有廣泛的抗病毒活性，它可以通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活一系列干擾素刺激基因（interferon-stimulatedgenes，ISGs）的表達(dá)，這些基因產(chǎn)物能夠抑制病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等過(guò)程，從而有效地抵御病毒的感染。此外，RIG-I還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫能力。蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是一種重要的翻譯后修飾方式，它在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性、定位、穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。越來(lái)越多的研究表明，RIG-I的功能也受到可逆磷酸化的精細(xì)調(diào)控。RIG-I分子上存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的磷酸化和去磷酸化狀態(tài)可以影響RIG-I與病毒核酸的結(jié)合能力、自身的活化程度以及與下游信號(hào)分子的相互作用。例如，RIG-I的某些位點(diǎn)磷酸化后，可以增強(qiáng)其與MAVS（mitochondrialantiviralsignalingprotein）的結(jié)合，從而促進(jìn)信號(hào)的傳遞；而另一些位點(diǎn)的去磷酸化則可能導(dǎo)致RIG-I活性的抑制。深入研究RIG-I可逆磷酸化在抗病毒信號(hào)調(diào)控中的作用機(jī)制，具有重要的理論意義和實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。從理論層面來(lái)看，這有助于我們更加深入地理解天然免疫應(yīng)答的分子機(jī)制，揭示病毒與宿主之間相互作用的奧秘。RIG-I作為抗病毒免疫的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，其可逆磷酸化的調(diào)控機(jī)制涉及到多個(gè)信號(hào)分子和復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)這一過(guò)程的深入研究將豐富我們對(duì)天然免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的認(rèn)識(shí)，為進(jìn)一步完善免疫學(xué)理論提供重要依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，該研究具有廣闊的應(yīng)用前景。一方面，它為抗病毒藥物的研發(fā)提供了新的靶點(diǎn)。目前，臨床上針對(duì)病毒感染的治療藥物仍然有限，且部分藥物存在耐藥性等問(wèn)題。通過(guò)靶向RIG-I的可逆磷酸化過(guò)程，可以開(kāi)發(fā)出新型的抗病毒藥物，這些藥物能夠特異性地調(diào)節(jié)RIG-I的活性，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫能力，從而為病毒感染性疾病的治療提供更有效的手段。另一方面，研究RIG-I可逆磷酸化機(jī)制有助于開(kāi)發(fā)新型疫苗。疫苗是預(yù)防病毒感染的重要手段，通過(guò)了解RIG-I的調(diào)控機(jī)制，可以優(yōu)化疫苗的設(shè)計(jì)，提高疫苗的免疫效果，使其能夠更有效地激發(fā)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)，預(yù)防病毒的感染。此外，對(duì)于一些免疫相關(guān)疾病的治療也具有潛在的指導(dǎo)意義，因?yàn)镽IG-I信號(hào)通路的異常激活或抑制與某些自身免疫性疾病和炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，深入研究其可逆磷酸化機(jī)制可能為這些疾病的治療提供新的思路和方法。1.2RIG-I概述1.2.1RIG-I結(jié)構(gòu)解析RIG-I作為一種模式識(shí)別受體，在機(jī)體抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)決定了它能夠精準(zhǔn)地識(shí)別病毒核酸并啟動(dòng)后續(xù)的免疫信號(hào)傳導(dǎo)。RIG-I的結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，主要由N端半胱天冬酶募集結(jié)構(gòu)域（Caspaseactivationandrecruitmentdomain，CARD）、中間的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域（Helicasedomain）以及C端結(jié)構(gòu)域（C-terminaldomain，CTD）組成。N端含有兩個(gè)串聯(lián)的CARD結(jié)構(gòu)域，每個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域大約由90個(gè)氨基酸殘基組成。這兩個(gè)CARD結(jié)構(gòu)域在空間上緊密排列，它們通過(guò)保守的氨基酸序列和特定的三維結(jié)構(gòu)，能夠與下游信號(hào)分子相互作用。當(dāng)RIG-I識(shí)別到病毒核酸后，CARD結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，暴露出與下游信號(hào)分子結(jié)合的位點(diǎn)，從而啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程。研究表明，在沒(méi)有病毒感染的情況下，過(guò)表達(dá)N端CARD結(jié)構(gòu)域就能夠促進(jìn)細(xì)胞分泌I型干擾素（IFN），這充分說(shuō)明了CARD結(jié)構(gòu)域在信號(hào)傳遞中的關(guān)鍵作用。例如，在病毒感染初期，RIG-I的CARD結(jié)構(gòu)域能夠與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，進(jìn)而將信號(hào)傳遞給下游的TBK1（TANK-bindingkinase1）和IKKε（I-kappaBkinaseε）等激酶，激活干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和核因子κB（NF-κB）等轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)IFN的表達(dá)。中間的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域是RIG-I的核心功能區(qū)域之一，它屬于DExD/H盒解旋酶家族，包含解旋酶結(jié)構(gòu)域I-VI。這些結(jié)構(gòu)域具有高度保守的氨基酸序列和特定的結(jié)構(gòu)模體，其中解旋酶結(jié)構(gòu)域I是Walker氏ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，對(duì)于RIG-I發(fā)揮正常功能至關(guān)重要。ATP結(jié)合和水解為RIG-I的解旋酶活性提供能量，使其能夠解開(kāi)病毒雙鏈RNA（dsRNA）的雙鏈結(jié)構(gòu)，從而暴露出病毒核酸的識(shí)別位點(diǎn)，增強(qiáng)RIG-I與病毒核酸的結(jié)合能力。此外，解旋酶結(jié)構(gòu)域還參與了RIG-I的自身寡聚化過(guò)程，多個(gè)RIG-I分子通過(guò)解旋酶結(jié)構(gòu)域相互作用，形成寡聚體，這對(duì)于RIG-I的活化和信號(hào)傳導(dǎo)具有重要意義。當(dāng)RIG-I與病毒核酸結(jié)合后，解旋酶結(jié)構(gòu)域會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化，促進(jìn)RIG-I的寡聚化，進(jìn)而增強(qiáng)其與下游信號(hào)分子的相互作用，提高信號(hào)傳導(dǎo)的效率。C端結(jié)構(gòu)域包含大約170個(gè)氨基酸殘基，具有RNA結(jié)合活性。它能夠特異性地識(shí)別病毒核酸的特征結(jié)構(gòu)，如5’三磷酸基團(tuán)的單鏈RNA（5’ppp-ssRNA）和雙鏈RNA（dsRNA）。C端結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列和三維結(jié)構(gòu)決定了其對(duì)病毒核酸的識(shí)別特異性和親和力。在沒(méi)有病毒感染時(shí)，C端結(jié)構(gòu)域與N端CARD結(jié)構(gòu)域相互作用，通過(guò)分子內(nèi)的相互作用抑制RIG-I的活化，維持RIG-I處于非激活狀態(tài)。當(dāng)病毒感染細(xì)胞后，病毒核酸與C端結(jié)構(gòu)域結(jié)合，導(dǎo)致C端結(jié)構(gòu)域與N端CARD結(jié)構(gòu)域之間的相互作用減弱，從而使CARD結(jié)構(gòu)域得以暴露，RIG-I被激活。此外，C端結(jié)構(gòu)域還參與了RIG-I與其他輔助蛋白的相互作用，這些輔助蛋白可以調(diào)節(jié)RIG-I的活性和穩(wěn)定性，進(jìn)一步影響RIG-I介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)。1.2.2RIG-I識(shí)別病毒RNA機(jī)制在病毒感染的過(guò)程中，RIG-I能夠敏銳地識(shí)別病毒復(fù)制產(chǎn)生的核酸，包括雙鏈RNA（dsRNA）和5’三磷酸基團(tuán)的單鏈RNA（5’ppp-ssRNA），這一識(shí)別過(guò)程是啟動(dòng)抗病毒免疫反應(yīng)的關(guān)鍵起始步驟。RIG-I對(duì)dsRNA的識(shí)別主要依賴于其C端結(jié)構(gòu)域（CTD）和RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域。dsRNA具有獨(dú)特的雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)，RIG-I的CTD能夠通過(guò)其表面的特定氨基酸殘基與dsRNA的磷酸骨架和堿基形成氫鍵、靜電相互作用以及范德華力等非共價(jià)相互作用，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)dsRNA的特異性結(jié)合。同時(shí)，RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域在識(shí)別過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用，它可以利用ATP水解提供的能量，以ATP酶依賴的方式解開(kāi)dsRNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，使RIG-I能夠更好地與dsRNA結(jié)合，并進(jìn)一步識(shí)別dsRNA中的特定序列或結(jié)構(gòu)特征。研究發(fā)現(xiàn)，RIG-I對(duì)長(zhǎng)度在30-1000bp之間的dsRNA具有較高的親和力，尤其是含有5’三磷酸基團(tuán)的dsRNA，這種特異性識(shí)別有助于RIG-I準(zhǔn)確區(qū)分病毒來(lái)源的dsRNA和細(xì)胞自身的RNA。對(duì)于5’ppp-ssRNA的識(shí)別，RIG-I同樣主要通過(guò)C端結(jié)構(gòu)域和RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域協(xié)同作用。5’ppp-ssRNA的5’端三磷酸基團(tuán)是RIG-I識(shí)別的關(guān)鍵特征之一，RIG-I的CTD能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合5’ppp基團(tuán)，通過(guò)與5’ppp基團(tuán)的磷酸根離子形成緊密的相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)5’ppp-ssRNA的初步識(shí)別。隨后，RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域?qū)?’ppp-ssRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解旋和分析，進(jìn)一步確認(rèn)其病毒來(lái)源。此外，RIG-I的識(shí)別過(guò)程還可能受到細(xì)胞內(nèi)其他輔助蛋白的影響，這些輔助蛋白可以與RIG-I相互作用，調(diào)節(jié)其對(duì)5’ppp-ssRNA的識(shí)別能力和親和力。當(dāng)RIG-I識(shí)別到病毒RNA后，會(huì)發(fā)生一系列的構(gòu)象變化，從而形成激活態(tài)分子。在未識(shí)別病毒RNA時(shí)，RIG-I的N端CARD結(jié)構(gòu)域與C端結(jié)構(gòu)域相互作用，處于自我抑制狀態(tài)。一旦識(shí)別到病毒RNA，C端結(jié)構(gòu)域與病毒RNA結(jié)合，導(dǎo)致C端結(jié)構(gòu)域與N端CARD結(jié)構(gòu)域之間的相互作用減弱，N端CARD結(jié)構(gòu)域得以暴露。同時(shí)，RIG-I分子會(huì)發(fā)生寡聚化，多個(gè)RIG-I分子通過(guò)解旋酶結(jié)構(gòu)域相互作用，形成多聚體。這種寡聚化過(guò)程進(jìn)一步促進(jìn)了N端CARD結(jié)構(gòu)域的暴露和激活，使其能夠與下游信號(hào)分子MAVS相互作用，形成激活態(tài)的RIG-I-MAVS復(fù)合物，從而啟動(dòng)下游的抗病毒免疫信號(hào)通路。研究表明，RIG-I的寡聚化程度與病毒RNA的濃度和長(zhǎng)度有關(guān)，高濃度和長(zhǎng)鏈的病毒RNA能夠促進(jìn)RIG-I更有效地寡聚化，進(jìn)而增強(qiáng)抗病毒免疫反應(yīng)。1.2.3RIG-I激活抗病毒免疫反應(yīng)過(guò)程當(dāng)RIG-I識(shí)別病毒RNA并形成激活態(tài)分子后，會(huì)通過(guò)其N端的CARD結(jié)構(gòu)域與下游信號(hào)分子線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）相互作用，從而啟動(dòng)一系列復(fù)雜而精密的抗病毒免疫反應(yīng)，這一過(guò)程對(duì)于機(jī)體抵御病毒感染至關(guān)重要。RIG-I激活后，其暴露的CARD結(jié)構(gòu)域能夠與MAVS的CARD結(jié)構(gòu)域通過(guò)特異性的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用緊密結(jié)合。MAVS主要定位于線粒體膜上，這種結(jié)合使得RIG-I能夠?qū)⑿盘?hào)傳遞到線粒體。RIG-I與MAVS的結(jié)合是一個(gè)動(dòng)態(tài)且高度有序的過(guò)程，涉及多個(gè)氨基酸殘基之間的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，RIG-I的CARD結(jié)構(gòu)域中的一些保守氨基酸殘基，如精氨酸、賴氨酸等，與MAVS的CARD結(jié)構(gòu)域中的相應(yīng)氨基酸殘基形成氫鍵和靜電相互作用，從而穩(wěn)定RIG-I-MAVS復(fù)合物的形成。這種復(fù)合物的形成是激活下游信號(hào)通路的關(guān)鍵步驟，它標(biāo)志著抗病毒免疫信號(hào)從RIG-I傳遞到了MAVS。MAVS被激活后，會(huì)招募并激活一系列下游信號(hào)分子，其中包括TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和IκB激酶ε（IKKε）。MAVS通過(guò)其自身的結(jié)構(gòu)域與TBK1和IKKε相互作用，形成多蛋白復(fù)合物。在這個(gè)復(fù)合物中，TBK1和IKKε被激活，它們能夠磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，如干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和核因子κB（NF-κB）。TBK1和IKKε對(duì)IRF3的磷酸化會(huì)導(dǎo)致IRF3發(fā)生二聚化，二聚化后的IRF3能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。在細(xì)胞核中，IRF3與特定的DNA序列結(jié)合，啟動(dòng)I型干擾素（IFN-I）基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，NF-κB也被激活，它同樣會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與相應(yīng)的DNA序列結(jié)合，促進(jìn)IFN-I基因以及其他炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。I型干擾素具有廣泛的抗病毒活性，它可以與細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合，激活一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)。這些ISGs編碼的蛋白質(zhì)具有多種抗病毒功能，例如，一些ISG產(chǎn)物可以抑制病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，阻斷病毒的生命周期；另一些ISG產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的清除能力。此外，RIG-I激活的信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。在病毒感染的情況下，適當(dāng)?shù)募?xì)胞凋亡可以清除被病毒感染的細(xì)胞，防止病毒的進(jìn)一步傳播；而炎癥反應(yīng)則可以招募免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)免疫防御。但如果這些過(guò)程過(guò)度激活，也可能導(dǎo)致組織損傷和免疫病理反應(yīng)，因此RIG-I介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持機(jī)體的免疫平衡。1.3研究目的與創(chuàng)新點(diǎn)本研究旨在深入探究RIG-I可逆磷酸化在抗病毒信號(hào)調(diào)控中的作用機(jī)制，為揭示機(jī)體抗病毒免疫的分子機(jī)制提供新的理論依據(jù)，同時(shí)為抗病毒藥物研發(fā)和疫苗設(shè)計(jì)等實(shí)際應(yīng)用提供潛在的靶點(diǎn)和理論指導(dǎo)。在研究過(guò)程中，本課題將具有多方面的創(chuàng)新點(diǎn)。在研究視角上，本研究聚焦于RIG-I的可逆磷酸化這一關(guān)鍵的翻譯后修飾方式，從磷酸化和去磷酸化動(dòng)態(tài)平衡的角度深入剖析其對(duì)RIG-I功能及抗病毒信號(hào)通路的調(diào)控作用，這種對(duì)可逆修飾動(dòng)態(tài)過(guò)程的研究，相比于以往僅關(guān)注單一修飾狀態(tài)的研究，能夠更全面、深入地揭示RIG-I的調(diào)控機(jī)制，為該領(lǐng)域的研究提供全新的視角。在研究方法上，本研究將綜合運(yùn)用多種先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法，如蛋白質(zhì)組學(xué)、磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)、基因編輯技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物模型等。通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，全面、系統(tǒng)地鑒定RIG-I上的磷酸化位點(diǎn)及其在病毒感染過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化；利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建RIG-I磷酸化位點(diǎn)突變體，精準(zhǔn)地研究特定磷酸化位點(diǎn)對(duì)RIG-I功能的影響；結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞和整體動(dòng)物水平驗(yàn)證和深入探究RIG-I可逆磷酸化在抗病毒信號(hào)調(diào)控中的作用機(jī)制。這種多技術(shù)、多層面的綜合研究方法，能夠相互驗(yàn)證和補(bǔ)充，提高研究結(jié)果的可靠性和說(shuō)服力，為深入研究RIG-I的調(diào)控機(jī)制提供有力的技術(shù)支持。在研究?jī)?nèi)容上，本研究不僅關(guān)注RIG-I可逆磷酸化對(duì)其自身活性和與病毒核酸結(jié)合能力的影響，還將深入探究其對(duì)RIG-I與下游信號(hào)分子相互作用、信號(hào)通路激活以及抗病毒免疫應(yīng)答的調(diào)控作用。此外，還將研究RIG-I可逆磷酸化在不同病毒感染模型中的作用差異，以及病毒如何利用可逆磷酸化機(jī)制逃避宿主免疫監(jiān)視。這種全面、深入且具有針對(duì)性的研究?jī)?nèi)容，能夠填補(bǔ)當(dāng)前該領(lǐng)域在RIG-I可逆磷酸化研究方面的空白，為進(jìn)一步理解病毒與宿主之間的相互作用關(guān)系提供重要的理論基礎(chǔ)。二、RIG-I可逆磷酸化的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證2.1磷酸化修飾的普遍性與功能概述磷酸化修飾作為生物體內(nèi)最為普遍且關(guān)鍵的蛋白質(zhì)修飾方式之一，廣泛存在于從原核生物到真核生物的各類細(xì)胞中，對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能以及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用等方面發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。從生物進(jìn)化的角度來(lái)看，磷酸化修飾在生命活動(dòng)中具有高度的保守性。無(wú)論是簡(jiǎn)單的單細(xì)胞生物，還是復(fù)雜的多細(xì)胞生物，都依賴磷酸化修飾來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理過(guò)程。在細(xì)菌中，磷酸化修飾參與了細(xì)菌的代謝調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)。例如，大腸桿菌中的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS）通過(guò)對(duì)一系列酶的磷酸化修飾，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖類物質(zhì)的攝取和代謝調(diào)控。在真核生物中，磷酸化修飾更是廣泛參與到細(xì)胞周期調(diào)控、基因表達(dá)、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及免疫應(yīng)答等眾多重要的生命活動(dòng)中。在細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程中，周期蛋白依賴性激酶（CDKs）通過(guò)對(duì)多種底物蛋白的磷酸化修飾，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂期時(shí)，CDK1與周期蛋白B結(jié)合形成復(fù)合物，CDK1被激活后，磷酸化一系列與染色體凝集、紡錘體形成、核膜破裂等相關(guān)的蛋白，從而確保細(xì)胞有絲分裂的順利進(jìn)行。從化學(xué)結(jié)構(gòu)的角度分析，蛋白質(zhì)的磷酸化修飾主要發(fā)生在絲氨酸（Ser）、蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）殘基上。這三種氨基酸殘基的側(cè)鏈上都含有羥基，在蛋白激酶的催化作用下，ATP的γ-磷酸基團(tuán)可以轉(zhuǎn)移到這些羥基上，形成磷酸酯鍵，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾。不同氨基酸殘基上的磷酸化修飾具有不同的生物學(xué)功能。絲氨酸和蘇氨酸磷酸化修飾較為常見(jiàn)，它們主要通過(guò)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象和電荷狀態(tài)，影響蛋白質(zhì)的活性和與其他分子的相互作用。糖原合成酶是糖原合成過(guò)程中的關(guān)鍵酶，當(dāng)糖原合成酶被磷酸化修飾后，其活性受到抑制，從而減少糖原的合成；相反，去磷酸化修飾則會(huì)激活糖原合成酶，促進(jìn)糖原的合成。酪氨酸磷酸化修飾雖然相對(duì)較少，但在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中具有獨(dú)特而重要的作用。許多生長(zhǎng)因子受體和細(xì)胞表面的信號(hào)分子在激活后會(huì)發(fā)生酪氨酸磷酸化，這些磷酸化位點(diǎn)可以作為特異性的識(shí)別位點(diǎn)，招募含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)與之結(jié)合，形成多蛋白復(fù)合物，進(jìn)而激活下游的信號(hào)通路。例如，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）在與表皮生長(zhǎng)因子（EGF）結(jié)合后，受體自身的酪氨酸殘基會(huì)發(fā)生磷酸化，招募Grb2、SOS等含有SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)，激活Ras-Raf-MEK-ERK信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖和分化。在蛋白質(zhì)的功能調(diào)節(jié)方面，磷酸化修飾猶如一把“分子開(kāi)關(guān)”，能夠精確地控制蛋白質(zhì)的活性。許多酶在未被磷酸化時(shí)處于無(wú)活性狀態(tài)，一旦發(fā)生磷酸化修飾，其活性中心的構(gòu)象發(fā)生改變，從而被激活，得以催化相應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)。蛋白激酶A（PKA）在細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到激素等信號(hào)刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平升高，cAMP與PKA的調(diào)節(jié)亞基結(jié)合，導(dǎo)致調(diào)節(jié)亞基與催化亞基分離，催化亞基被激活。激活后的PKA可以磷酸化多種底物蛋白，如糖原合成酶、磷酸化酶激酶等，從而調(diào)節(jié)糖原的代謝過(guò)程。相反，一些酶在磷酸化狀態(tài)下具有活性，而去磷酸化則會(huì)使其失活。丙酮酸脫氫酶是參與糖有氧氧化過(guò)程的關(guān)鍵酶，當(dāng)丙酮酸脫氫酶被磷酸化修飾后，其活性受到抑制，糖有氧氧化過(guò)程減緩；而去磷酸化修飾則會(huì)激活丙酮酸脫氫酶，促進(jìn)糖有氧氧化的進(jìn)行。磷酸化修飾還能夠顯著影響蛋白質(zhì)與其他分子的相互作用，包括蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與核酸、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)等之間的相互作用。在蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用方面，磷酸化修飾可以通過(guò)改變蛋白質(zhì)表面的電荷分布和構(gòu)象，創(chuàng)造或破壞蛋白質(zhì)之間的相互作用界面，從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和解離。在細(xì)胞凋亡過(guò)程中，Bcl-2家族蛋白之間的相互作用受到磷酸化修飾的精細(xì)調(diào)控。Bad蛋白是Bcl-2家族中的促凋亡蛋白，當(dāng)Bad蛋白被磷酸化修飾后，它會(huì)與14-3-3蛋白結(jié)合，從而失去與抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL結(jié)合的能力，解除對(duì)Bcl-2或Bcl-XL的抑制作用，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在蛋白質(zhì)-核酸相互作用方面，磷酸化修飾可以影響轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合能力，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。例如，轉(zhuǎn)錄因子CREB在被蛋白激酶A磷酸化后，其與DNA上的cAMP反應(yīng)元件（CRE）的結(jié)合能力增強(qiáng)，促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。在蛋白質(zhì)-脂質(zhì)相互作用方面，磷酸化修飾可以調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上的定位和功能。一些膜結(jié)合蛋白在發(fā)生磷酸化修飾后，其與細(xì)胞膜脂質(zhì)的親和力發(fā)生改變，從而影響蛋白質(zhì)在細(xì)胞膜上的分布和信號(hào)傳導(dǎo)功能。磷酸化修飾在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中更是扮演著核心角色，它是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞的重要方式之一。細(xì)胞外的信號(hào)，如激素、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等，通過(guò)與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，激活受體的激酶活性或招募細(xì)胞內(nèi)的蛋白激酶，引發(fā)一系列的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)。這些磷酸化反應(yīng)將細(xì)胞外的信號(hào)逐級(jí)傳遞到細(xì)胞內(nèi)的各個(gè)部位，最終導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。在免疫細(xì)胞的活化過(guò)程中，抗原與T細(xì)胞受體（TCR）結(jié)合后，激活TCR相關(guān)的蛋白激酶，如Lck和Fyn，這些激酶磷酸化下游的信號(hào)分子，如ZAP-70，激活的ZAP-70進(jìn)一步磷酸化其他信號(hào)分子，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，最終導(dǎo)致T細(xì)胞的活化、增殖和分化，啟動(dòng)免疫應(yīng)答。2.2RIG-I可逆磷酸化的發(fā)現(xiàn)歷程RIG-I可逆磷酸化的發(fā)現(xiàn)是一個(gè)逐步探索和深入研究的過(guò)程，這一過(guò)程與人們對(duì)天然免疫信號(hào)通路以及蛋白質(zhì)翻譯后修飾調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)不斷深化密切相關(guān)。早期對(duì)RIG-I的研究主要集中在其作為模式識(shí)別受體識(shí)別病毒核酸并激活抗病毒免疫反應(yīng)的基本功能上。隨著研究的深入，科學(xué)家們逐漸意識(shí)到RIG-I的活性可能受到多種因素的調(diào)控，其中蛋白質(zhì)的翻譯后修飾成為研究的重點(diǎn)方向之一。在對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的廣泛研究中，磷酸化修飾因其在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能方面的重要作用而備受關(guān)注?；诖耍蒲腥藛T開(kāi)始推測(cè)RIG-I可能也存在磷酸化修飾，并對(duì)其抗病毒功能產(chǎn)生影響。最初的研究嘗試通過(guò)一些間接的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來(lái)推測(cè)RIG-I是否存在磷酸化修飾。在對(duì)病毒感染細(xì)胞的研究中，發(fā)現(xiàn)當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染后，RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路的激活程度與細(xì)胞內(nèi)某些蛋白激酶和磷酸酶的活性變化存在關(guān)聯(lián)。例如，當(dāng)抑制某些蛋白激酶的活性時(shí)，RIG-I激活下游信號(hào)分子并誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生的能力受到抑制；相反，抑制某些磷酸酶的活性則會(huì)增強(qiáng)RIG-I的信號(hào)傳導(dǎo)。這些現(xiàn)象提示RIG-I的功能可能受到磷酸化和去磷酸化的動(dòng)態(tài)調(diào)控。為了直接證實(shí)RIG-I是否存在可逆磷酸化，研究人員開(kāi)始運(yùn)用生物化學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行深入研究。利用免疫印跡（Westernblot）技術(shù)，使用特異性識(shí)別磷酸化絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的抗體，對(duì)病毒感染細(xì)胞中的RIG-I蛋白進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在病毒感染的細(xì)胞中，RIG-I蛋白出現(xiàn)了明顯的磷酸化條帶，而在未感染病毒的細(xì)胞中，該條帶則較弱或幾乎不可見(jiàn)，這初步證明了RIG-I在病毒感染過(guò)程中發(fā)生了磷酸化修飾。為了進(jìn)一步確定RIG-I的磷酸化位點(diǎn)，研究人員采用了質(zhì)譜技術(shù)。通過(guò)對(duì)RIG-I蛋白進(jìn)行酶解，將其切割成小肽段，然后利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）對(duì)肽段進(jìn)行分析。通過(guò)精確測(cè)量肽段的質(zhì)量和碎片離子的信息，與理論上磷酸化修飾后的肽段質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)，成功鑒定出RIG-I上的多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，如Ser8、Ser418、Ser22和Ser99等。這些位點(diǎn)的鑒定為后續(xù)深入研究RIG-I可逆磷酸化的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。隨著對(duì)RIG-I可逆磷酸化研究的不斷深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)不同的磷酸化位點(diǎn)在RIG-I的功能調(diào)控中發(fā)揮著不同的作用。研究發(fā)現(xiàn)，T-raf和IKKε等磷酸化相關(guān)蛋白質(zhì)可以介導(dǎo)Ser8和Ser418的磷酸化，進(jìn)而促進(jìn)RIG-I的激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)這些位點(diǎn)被磷酸化后，RIG-I與病毒核酸的結(jié)合能力增強(qiáng)，并且能夠更有效地與下游信號(hào)分子MAVS相互作用，從而增強(qiáng)抗病毒免疫信號(hào)的傳遞。而磷酸酯酶PP1α和PPM1A則可以分別通過(guò)作用于RIG-I的Ser8和Ser99位點(diǎn)，促進(jìn)RIG-I的去磷酸化反應(yīng)，并抑制其激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。當(dāng)Ser8被PP1α去磷酸化后，RIG-I的活性受到抑制，抗病毒信號(hào)通路的激活也相應(yīng)減弱。RIG-I可逆磷酸化的發(fā)現(xiàn)為深入理解抗病毒免疫信號(hào)調(diào)控機(jī)制提供了新的視角，揭示了RIG-I的功能不僅受到其與病毒核酸結(jié)合的影響，還受到可逆磷酸化這種精細(xì)的翻譯后修飾方式的調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)使得人們對(duì)天然免疫應(yīng)答過(guò)程中RIG-I的作用機(jī)制有了更全面、深入的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)研究RIG-I可逆磷酸化在抗病毒信號(hào)調(diào)控中的具體作用機(jī)制以及開(kāi)發(fā)基于RIG-I的抗病毒治療策略奠定了重要的基礎(chǔ)。二、RIG-I可逆磷酸化的發(fā)現(xiàn)與驗(yàn)證2.3驗(yàn)證RIG-I可逆磷酸化存在的實(shí)驗(yàn)方法2.3.1Westernblot技術(shù)原理與應(yīng)用Westernblot，即蛋白質(zhì)免疫印跡，是一種在蛋白質(zhì)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的經(jīng)典技術(shù)，在驗(yàn)證RIG-I可逆磷酸化的研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。其基本原理是基于蛋白質(zhì)的電荷和分子量差異，先通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）對(duì)細(xì)胞或組織裂解液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分離。在電場(chǎng)的作用下，蛋白質(zhì)會(huì)根據(jù)其分子量大小在凝膠中遷移，分子量小的蛋白質(zhì)遷移速度快，分子量較大的蛋白質(zhì)則遷移速度慢，從而實(shí)現(xiàn)不同蛋白質(zhì)的分離。隨后，利用電轉(zhuǎn)印技術(shù)將凝膠上分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持物，如硝酸纖維素膜（NC膜）或聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）上。在電場(chǎng)的驅(qū)動(dòng)下，蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，這樣蛋白質(zhì)在膜上的位置就與在凝膠中的位置相對(duì)應(yīng)，從而保留了蛋白質(zhì)的分離信息。轉(zhuǎn)移完成后，膜上的蛋白質(zhì)與膜緊密結(jié)合，形成穩(wěn)定的固相蛋白質(zhì)層。接著，使用特異性的抗體來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)，即RIG-I及其磷酸化形式。首先，用含有特定封閉劑的溶液對(duì)膜進(jìn)行封閉處理，以防止非特異性的抗體結(jié)合。常用的封閉劑有脫脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）等，它們能夠與膜上未結(jié)合蛋白質(zhì)的位點(diǎn)結(jié)合，從而減少非特異性吸附。封閉完成后，將膜與針對(duì)RIG-I的特異性一抗孵育。一抗能夠識(shí)別并特異性地結(jié)合RIG-I蛋白上的抗原表位，形成抗原-抗體復(fù)合物。孵育結(jié)束后，通過(guò)洗滌去除未結(jié)合的一抗。然后，加入與一抗特異性結(jié)合的二抗，二抗通常標(biāo)記有可檢測(cè)的標(biāo)記物，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）或堿性磷酸酶（AP）。二抗與一抗結(jié)合后，形成穩(wěn)定的抗原-一抗-二抗復(fù)合物。最后，通過(guò)檢測(cè)二抗上的標(biāo)記物來(lái)確定目標(biāo)蛋白質(zhì)的存在和含量。如果二抗標(biāo)記的是HRP，可使用化學(xué)發(fā)光底物，如魯米諾，HRP催化魯米諾發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生熒光信號(hào)，通過(guò)曝光在X光膠片上或使用化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)熒光信號(hào)，即可顯示出RIG-I蛋白的條帶。如果條帶在磷酸化特異性抗體檢測(cè)時(shí)出現(xiàn)，而在總RIG-I抗體檢測(cè)時(shí)也存在，且在不同處理?xiàng)l件下（如病毒感染與未感染、激酶或磷酸酶抑制劑處理等）條帶的強(qiáng)度發(fā)生變化，則可初步證明RIG-I存在可逆磷酸化修飾。例如，在病毒感染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，與未感染病毒的細(xì)胞相比，感染病毒的細(xì)胞中RIG-I的磷酸化條帶明顯增強(qiáng)，這表明病毒感染可能誘導(dǎo)了RIG-I的磷酸化。通過(guò)灰度分析軟件對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行分析，還可以半定量地評(píng)估RIG-I磷酸化水平的變化，為進(jìn)一步研究RIG-I可逆磷酸化在抗病毒信號(hào)調(diào)控中的作用提供數(shù)據(jù)支持。2.3.2免疫印跡技術(shù)的優(yōu)勢(shì)與操作要點(diǎn)免疫印跡技術(shù)，即Westernblot，在RIG-I磷酸化研究中展現(xiàn)出諸多顯著優(yōu)勢(shì)。它具有高度的特異性，能夠利用特異性抗體準(zhǔn)確識(shí)別并檢測(cè)目標(biāo)蛋白質(zhì)，如RIG-I及其磷酸化形式，這使得研究人員可以精確地研究RIG-I的磷酸化狀態(tài)，而不受其他蛋白質(zhì)的干擾。在復(fù)雜的細(xì)胞裂解液中，免疫印跡技術(shù)能夠從眾多蛋白質(zhì)中特異性地檢測(cè)出RIG-I，并且通過(guò)使用磷酸化特異性抗體，準(zhǔn)確地檢測(cè)出RIG-I的磷酸化位點(diǎn)，為研究RIG-I可逆磷酸化提供了有力的工具。免疫印跡技術(shù)還具有較高的靈敏度，能夠檢測(cè)到低豐度的蛋白質(zhì)，即使細(xì)胞中RIG-I的表達(dá)量較低，也能夠通過(guò)該技術(shù)有效地檢測(cè)其磷酸化情況。這對(duì)于研究RIG-I在生理和病理?xiàng)l件下的動(dòng)態(tài)變化具有重要意義，因?yàn)樵谀承┣闆r下，RIG-I的表達(dá)水平可能會(huì)發(fā)生改變，但通過(guò)免疫印跡技術(shù)的高靈敏度，可以準(zhǔn)確地檢測(cè)到其磷酸化狀態(tài)的變化，從而深入了解其在抗病毒信號(hào)調(diào)控中的作用機(jī)制。此外，免疫印跡技術(shù)可以同時(shí)分析多個(gè)樣品，便于對(duì)不同條件下的RIG-I磷酸化水平進(jìn)行比較研究。在研究不同病毒感染對(duì)RIG-I磷酸化的影響時(shí)，可以同時(shí)處理多個(gè)感染不同病毒的細(xì)胞樣品，通過(guò)免疫印跡技術(shù)一次性檢測(cè)并比較這些樣品中RIG-I的磷酸化水平，從而快速、直觀地了解不同病毒感染對(duì)RIG-I磷酸化的差異調(diào)控作用。然而，在操作免疫印跡技術(shù)時(shí)，需要注意多個(gè)關(guān)鍵要點(diǎn)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。在樣品制備過(guò)程中，要保證蛋白質(zhì)的完整性和活性，避免蛋白質(zhì)的降解和修飾狀態(tài)的改變。使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的細(xì)胞裂解液是至關(guān)重要的，蛋白酶抑制劑可以防止蛋白質(zhì)被蛋白酶降解，磷酸酶抑制劑則可以抑制磷酸酶的活性，避免RIG-I的磷酸化位點(diǎn)發(fā)生去磷酸化，從而保證檢測(cè)到的磷酸化狀態(tài)真實(shí)反映細(xì)胞內(nèi)的實(shí)際情況。在選擇和使用抗體時(shí)，應(yīng)確保抗體的特異性和親和力。特異性高的抗體能夠準(zhǔn)確地識(shí)別目標(biāo)抗原表位，減少非特異性結(jié)合，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性；親和力強(qiáng)的抗體則可以與抗原緊密結(jié)合，增強(qiáng)信號(hào)強(qiáng)度，提高檢測(cè)的靈敏度。在選擇磷酸化特異性抗體時(shí)，要仔細(xì)評(píng)估其特異性和親和力，確保能夠準(zhǔn)確地檢測(cè)到RIG-I的磷酸化位點(diǎn)。此外，還要注意抗體的稀釋度，不同的抗體在不同的實(shí)驗(yàn)條件下可能需要不同的稀釋度，應(yīng)通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳的抗體稀釋度，以獲得清晰、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件也是關(guān)鍵，如電泳條件、轉(zhuǎn)膜條件、孵育時(shí)間和溫度等都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。在電泳時(shí)，要確保電壓、電流和電泳時(shí)間的穩(wěn)定，以保證蛋白質(zhì)的分離效果；轉(zhuǎn)膜時(shí)，要控制好轉(zhuǎn)膜時(shí)間和電流，確保蛋白質(zhì)能夠充分轉(zhuǎn)移到膜上；孵育抗體時(shí)，要嚴(yán)格控制孵育時(shí)間和溫度，保證抗體與抗原充分結(jié)合，同時(shí)避免非特異性結(jié)合的增加。在結(jié)果分析時(shí)，要注意排除非特異性條帶的干擾，通過(guò)與分子量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比對(duì)，準(zhǔn)確判斷目標(biāo)條帶的位置和分子量，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性。2.3.3質(zhì)譜技術(shù)的應(yīng)用及對(duì)結(jié)果分析的作用質(zhì)譜技術(shù)是一種高分辨率、高靈敏度的分析技術(shù)，在驗(yàn)證RIG-I可逆磷酸化以及鑒定其磷酸化位點(diǎn)方面具有不可替代的重要作用。其基本原理是將樣品中的蛋白質(zhì)分子離子化，使其帶上電荷，然后在電場(chǎng)和磁場(chǎng)的作用下，根據(jù)離子的質(zhì)荷比（m/z）對(duì)離子進(jìn)行分離和檢測(cè)。不同質(zhì)荷比的離子在電場(chǎng)和磁場(chǎng)中的運(yùn)動(dòng)軌跡不同，通過(guò)檢測(cè)離子的飛行時(shí)間、能量等參數(shù)，即可確定離子的質(zhì)荷比，從而獲得蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量信息。在RIG-I可逆磷酸化的研究中，首先需要對(duì)RIG-I蛋白進(jìn)行酶解處理，常用的酶是胰蛋白酶，它能夠?qū)IG-I蛋白切割成一系列的肽段。這些肽段在質(zhì)譜儀中被離子化，形成帶電的離子。通過(guò)質(zhì)譜分析，可以獲得肽段的精確質(zhì)量數(shù)。由于磷酸化修飾會(huì)使肽段的質(zhì)量增加，磷酸基團(tuán)的質(zhì)量為79.9663Da，因此當(dāng)肽段發(fā)生磷酸化修飾時(shí)，其質(zhì)量會(huì)相應(yīng)增加。通過(guò)與理論上未磷酸化肽段的質(zhì)量進(jìn)行比對(duì)，如果檢測(cè)到的肽段質(zhì)量比理論質(zhì)量增加了79.9663Da左右，或者在串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析中觀察到磷酸化肽段特有的中性丟失現(xiàn)象（如丟失H3PO4，質(zhì)量數(shù)減少98.0Da），則可以初步判斷該肽段發(fā)生了磷酸化修飾。為了進(jìn)一步確定磷酸化位點(diǎn)，需要進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析。在串聯(lián)質(zhì)譜中，母離子在碰撞室中與惰性氣體碰撞，發(fā)生碎裂，產(chǎn)生一系列的碎片離子。通過(guò)分析這些碎片離子的質(zhì)荷比和裂解規(guī)律，可以推斷出肽段的氨基酸序列以及磷酸化位點(diǎn)的位置。例如，在RIG-I的研究中，通過(guò)質(zhì)譜分析鑒定出了Ser8、Ser418、Ser22和Ser99等多個(gè)磷酸化位點(diǎn)。質(zhì)譜技術(shù)對(duì)RIG-I可逆磷酸化研究結(jié)果的分析具有重要作用。它能夠精確地鑒定RIG-I的磷酸化位點(diǎn)，為深入研究RIG-I可逆磷酸化的作用機(jī)制提供了關(guān)鍵的信息。不同的磷酸化位點(diǎn)可能對(duì)RIG-I的功能產(chǎn)生不同的影響，通過(guò)確定磷酸化位點(diǎn)，研究人員可以進(jìn)一步探究這些位點(diǎn)的磷酸化如何調(diào)節(jié)RIG-I與病毒核酸的結(jié)合能力、自身的活化程度以及與下游信號(hào)分子的相互作用。質(zhì)譜技術(shù)還可以對(duì)RIG-I的磷酸化水平進(jìn)行定量分析。通過(guò)比較不同條件下（如病毒感染前后、激酶或磷酸酶抑制劑處理前后）RIG-I磷酸化肽段的信號(hào)強(qiáng)度，可以準(zhǔn)確地評(píng)估RIG-I磷酸化水平的變化，從而深入了解RIG-I可逆磷酸化在抗病毒信號(hào)調(diào)控中的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。此外，質(zhì)譜技術(shù)還可以與其他技術(shù)，如蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，全面地研究RIG-I在細(xì)胞內(nèi)的相互作用網(wǎng)絡(luò)以及磷酸化修飾對(duì)其相互作用的影響，為揭示RIG-I可逆磷酸化在抗病毒信號(hào)調(diào)控中的復(fù)雜機(jī)制提供更全面的視角。三、RIG-I可逆磷酸化位點(diǎn)與調(diào)控因子3.1主要磷酸化位點(diǎn)及其功能推測(cè)RIG-I分子上存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的磷酸化修飾對(duì)其功能的調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用。目前已鑒定出的主要磷酸化位點(diǎn)包括Ser8、Ser418、Ser22和Ser99等，它們?cè)赗IG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路中各自發(fā)揮著獨(dú)特的功能。Ser8位點(diǎn)位于RIG-I的N端區(qū)域，研究表明該位點(diǎn)的磷酸化與RIG-I的激活密切相關(guān)。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，磷酸化相關(guān)蛋白質(zhì)T-raf和IKKε等可以介導(dǎo)Ser8的磷酸化。Ser8磷酸化后，可能通過(guò)改變RIG-I的構(gòu)象，使其更容易與病毒核酸結(jié)合，從而增強(qiáng)RIG-I對(duì)病毒RNA的識(shí)別能力。此外，Ser8的磷酸化還可能促進(jìn)RIG-I與下游信號(hào)分子MAVS的相互作用，進(jìn)一步增強(qiáng)抗病毒信號(hào)的傳遞。有研究發(fā)現(xiàn)，在病毒感染的細(xì)胞中，通過(guò)基因編輯技術(shù)將Ser8突變?yōu)椴荒鼙涣姿峄谋彼幔⊿er8Ala）后，RIG-I的激活受到顯著抑制，下游I型干擾素的產(chǎn)生也明顯減少，這充分說(shuō)明了Ser8位點(diǎn)磷酸化在RIG-I激活和抗病毒信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要性。Ser418位點(diǎn)位于RIG-I的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗IG-I的解旋酶活性以及與病毒核酸的結(jié)合至關(guān)重要。Ser418的磷酸化同樣由T-raf和IKKε等介導(dǎo)。推測(cè)Ser418磷酸化后，可能會(huì)影響RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象和活性，從而調(diào)節(jié)RIG-I對(duì)病毒核酸的解旋和結(jié)合能力。當(dāng)Ser418被磷酸化時(shí)，可能增強(qiáng)RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域的活性，使RIG-I能夠更有效地解開(kāi)病毒雙鏈RNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，暴露出更多的核酸識(shí)別位點(diǎn)，進(jìn)而提高RIG-I與病毒核酸的結(jié)合親和力，促進(jìn)抗病毒免疫反應(yīng)的啟動(dòng)。已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，在某些病毒感染模型中，Ser418磷酸化水平的升高與RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路的激活呈正相關(guān)，進(jìn)一步支持了這一推測(cè)。Ser22位點(diǎn)的磷酸化修飾也可能對(duì)RIG-I的功能產(chǎn)生重要影響。雖然目前關(guān)于Ser22磷酸化的具體調(diào)控機(jī)制和功能研究相對(duì)較少，但從其在RIG-I分子中的位置來(lái)看，它可能參與調(diào)節(jié)RIG-I分子內(nèi)或分子間的相互作用。Ser22位于RIG-I分子的特定結(jié)構(gòu)區(qū)域，該區(qū)域可能與RIG-I的寡聚化過(guò)程或與其他輔助蛋白的相互作用有關(guān)。推測(cè)Ser22磷酸化后，可能會(huì)改變?cè)搮^(qū)域的電荷分布和構(gòu)象，從而影響RIG-I與其他分子的相互作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)RIG-I的活化和信號(hào)傳導(dǎo)。未來(lái)的研究需要進(jìn)一步深入探討Ser22磷酸化的調(diào)控機(jī)制及其在RIG-I功能中的具體作用。Ser99位點(diǎn)的磷酸化在RIG-I的功能調(diào)節(jié)中具有獨(dú)特的作用，它主要參與RIG-I的去磷酸化調(diào)節(jié)過(guò)程。磷酸酯酶PPM1A可以作用于Ser99位點(diǎn)，促進(jìn)RIG-I的去磷酸化反應(yīng)。當(dāng)Ser99被去磷酸化時(shí)，RIG-I的活性受到抑制，抗病毒信號(hào)通路的激活也相應(yīng)減弱。這表明Ser99位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)可能是調(diào)節(jié)RIG-I活性的一個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)，通過(guò)磷酸化和去磷酸化的動(dòng)態(tài)平衡，精確地調(diào)控RIG-I介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)的強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間。在病毒感染后期，當(dāng)機(jī)體的抗病毒免疫反應(yīng)達(dá)到一定程度后，PPM1A可能被激活，作用于Ser99位點(diǎn)，使RIG-I去磷酸化，從而抑制過(guò)度的免疫反應(yīng)，避免對(duì)機(jī)體造成損傷。這些主要的磷酸化位點(diǎn)在RIG-I的功能調(diào)控中發(fā)揮著不可或缺的作用，它們通過(guò)磷酸化和去磷酸化的動(dòng)態(tài)修飾，精確地調(diào)節(jié)RIG-I的活性、與病毒核酸的結(jié)合能力以及與下游信號(hào)分子的相互作用，從而在抗病毒信號(hào)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。對(duì)這些位點(diǎn)的深入研究有助于我們更全面地理解RIG-I介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)的分子機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型的抗病毒治療策略提供重要的理論依據(jù)。3.2磷酸化相關(guān)酶對(duì)RIG-I磷酸化的調(diào)節(jié)3.2.1T-raf和IKKε的作用機(jī)制T-raf和IKKε作為重要的磷酸化相關(guān)蛋白質(zhì)，在RIG-I的磷酸化過(guò)程中扮演著關(guān)鍵角色，它們對(duì)RIG-I上特定位點(diǎn)的磷酸化修飾，深刻影響著RIG-I的激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而調(diào)控抗病毒免疫反應(yīng)。T-raf，即腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子（Tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor），是一類參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵蛋白。在RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路中，T-raf能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合RIG-I分子。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染時(shí)，T-raf被招募到RIG-I所在的信號(hào)復(fù)合物中，通過(guò)其自身的激酶活性，催化RIG-I的Ser8位點(diǎn)發(fā)生磷酸化。Ser8位于RIG-I的N端區(qū)域，這一區(qū)域在RIG-I的激活和信號(hào)傳遞中具有重要作用。T-raf介導(dǎo)的Ser8磷酸化可以改變RIG-I的構(gòu)象，使RIG-I的N端結(jié)構(gòu)域更加易于與下游信號(hào)分子相互作用。研究表明，Ser8磷酸化后，RIG-I與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）的結(jié)合能力顯著增強(qiáng)。MAVS是RIG-I信號(hào)通路的關(guān)鍵接頭蛋白，位于線粒體膜上，RIG-I與MAVS的有效結(jié)合是啟動(dòng)下游抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵步驟。通過(guò)增強(qiáng)與MAVS的結(jié)合，T-raf介導(dǎo)的Ser8磷酸化促進(jìn)了RIG-I信號(hào)的傳遞，使得抗病毒免疫信號(hào)能夠順利地從RIG-I傳遞到MAVS，進(jìn)而激活下游的TBK1（TANK-bindingkinase1）和IKKε等激酶，最終誘導(dǎo)I型干擾素（IFN-I）等抗病毒因子的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫能力。IKKε，即I-κB激酶ε（I-kappaBkinaseε），同樣在RIG-I的磷酸化調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。IKKε屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，在病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)中，IKKε被激活并參與RIG-I的磷酸化過(guò)程。IKKε可以作用于RIG-I的Ser418位點(diǎn)，使其發(fā)生磷酸化。Ser418位于RIG-I的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，該結(jié)構(gòu)域?qū)τ赗IG-I的解旋酶活性以及與病毒核酸的結(jié)合至關(guān)重要。IKKε介導(dǎo)的Ser418磷酸化可能通過(guò)改變RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象，影響RIG-I對(duì)病毒核酸的解旋和結(jié)合能力。當(dāng)Ser418被磷酸化后，RIG-I的解旋酶活性可能增強(qiáng)，使其能夠更有效地解開(kāi)病毒雙鏈RNA（dsRNA）的雙鏈結(jié)構(gòu)，暴露出更多的核酸識(shí)別位點(diǎn)，從而提高RIG-I與病毒核酸的結(jié)合親和力，促進(jìn)抗病毒免疫反應(yīng)的啟動(dòng)。在流感病毒感染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)IKKε的激活與RIG-ISer418位點(diǎn)的磷酸化水平呈正相關(guān)，并且當(dāng)IKKε的活性被抑制時(shí)，RIG-I對(duì)病毒核酸的識(shí)別和結(jié)合能力下降，下游抗病毒信號(hào)通路的激活也受到明顯抑制，這充分說(shuō)明了IKKε介導(dǎo)的Ser418磷酸化在RIG-I抗病毒功能中的重要性。T-raf和IKKε還可能協(xié)同作用，共同調(diào)節(jié)RIG-I的磷酸化和激活。在病毒感染的細(xì)胞中，T-raf和IKKε可能同時(shí)被招募到RIG-I信號(hào)復(fù)合物中，分別對(duì)Ser8和Ser418進(jìn)行磷酸化修飾。這種協(xié)同作用可能通過(guò)增強(qiáng)RIG-I與病毒核酸的結(jié)合能力以及與下游信號(hào)分子的相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)RIG-I的激活和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而更有效地啟動(dòng)抗病毒免疫反應(yīng)。T-raf介導(dǎo)的Ser8磷酸化增強(qiáng)了RIG-I與MAVS的結(jié)合，而IKKε介導(dǎo)的Ser418磷酸化提高了RIG-I對(duì)病毒核酸的識(shí)別和結(jié)合能力，兩者相互配合，使得RIG-I能夠更快速、更有效地感知病毒感染并啟動(dòng)免疫應(yīng)答，為機(jī)體抵御病毒入侵提供了重要的保障。3.2.2其他潛在激酶的研究現(xiàn)狀除了T-raf和IKKε，目前研究還發(fā)現(xiàn)了其他一些潛在的激酶可能參與RIG-I磷酸化的調(diào)節(jié)，雖然對(duì)這些激酶的研究相對(duì)較少，但它們?cè)赗IG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路中具有潛在的重要作用，為深入理解RIG-I可逆磷酸化的調(diào)控機(jī)制提供了新的方向。絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs）家族中的某些成員被認(rèn)為可能與RIG-I的磷酸化有關(guān)。MAPKs是一類在細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與多種細(xì)胞生理過(guò)程，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及免疫應(yīng)答等。在病毒感染的情況下，MAPKs信號(hào)通路會(huì)被激活，其激活可能與RIG-I的磷酸化存在關(guān)聯(lián)。研究推測(cè)，p38MAPK可能通過(guò)磷酸化RIG-I的某些位點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)其功能。在病毒感染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)抑制p38MAPK的活性時(shí)，RIG-I介導(dǎo)的I型干擾素產(chǎn)生受到一定程度的抑制，這暗示p38MAPK可能通過(guò)對(duì)RIG-I的磷酸化修飾來(lái)影響其抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)。然而，目前關(guān)于p38MAPK具體作用于RIG-I的哪些位點(diǎn)以及詳細(xì)的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究確定。同樣，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（Extracellularsignal-regulatedkinases，ERKs）也被推測(cè)可能參與RIG-I的磷酸化調(diào)節(jié)。ERKs在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用，其激活可以調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)和細(xì)胞功能。在病毒感染過(guò)程中，ERKs的激活可能與RIG-I的磷酸化狀態(tài)改變相關(guān)，但具體的作用機(jī)制和磷酸化位點(diǎn)尚未明確，需要更多的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)驗(yàn)證和深入探討。酪蛋白激酶2（Caseinkinase2，CK2）也被報(bào)道可能參與RIG-I的磷酸化調(diào)節(jié)。CK2是一種廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，具有組成型活性，參與多種細(xì)胞生理和病理過(guò)程。有研究表明，CK2可以與RIG-I相互作用，并且在體外實(shí)驗(yàn)中，CK2能夠磷酸化RIG-I。雖然目前還不清楚CK2在細(xì)胞內(nèi)對(duì)RIG-I的磷酸化位點(diǎn)以及這種磷酸化對(duì)RIG-I功能的具體影響，但這些發(fā)現(xiàn)為研究RIG-I的磷酸化調(diào)控機(jī)制提供了新的線索。未來(lái)的研究可以進(jìn)一步探究CK2在RIG-I磷酸化中的作用，包括確定其具體的磷酸化位點(diǎn)，以及這種磷酸化如何影響RIG-I的激活、與病毒核酸的結(jié)合能力以及與下游信號(hào)分子的相互作用等。隨著研究的不斷深入，未來(lái)對(duì)這些潛在激酶的研究可以從多個(gè)方向展開(kāi)。一方面，可以利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9系統(tǒng)，構(gòu)建這些激酶基因敲除或激酶活性缺陷的細(xì)胞模型，深入研究它們?cè)赗IG-I磷酸化和抗病毒信號(hào)通路中的作用。通過(guò)比較野生型細(xì)胞和基因編輯細(xì)胞中RIG-I的磷酸化水平、激活狀態(tài)以及抗病毒免疫反應(yīng)的差異，明確這些激酶對(duì)RIG-I的具體調(diào)節(jié)機(jī)制。另一方面，可以運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)和磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，全面鑒定這些激酶作用于RIG-I的磷酸化位點(diǎn)，并深入研究這些位點(diǎn)的磷酸化對(duì)RIG-I結(jié)構(gòu)和功能的影響。結(jié)合生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，探究這些激酶與RIG-I之間的相互作用機(jī)制，以及它們?nèi)绾螀f(xié)同其他磷酸化相關(guān)酶共同調(diào)節(jié)RIG-I的可逆磷酸化，為揭示RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)調(diào)控的復(fù)雜機(jī)制提供更全面、深入的理論依據(jù)。3.3磷酸酯酶對(duì)RIG-I去磷酸化的影響3.3.1PP1α和PPM1A的作用方式在RIG-I可逆磷酸化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，磷酸酯酶PP1α和PPM1A扮演著重要的角色，它們通過(guò)對(duì)RIG-I特定位點(diǎn)的去磷酸化作用，精細(xì)地調(diào)節(jié)RIG-I的活性和抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)。PP1α，即蛋白磷酸酶1α，能夠特異性地作用于RIG-I的Ser8位點(diǎn)，促進(jìn)該位點(diǎn)的去磷酸化反應(yīng)。Ser8位點(diǎn)在RIG-I的激活過(guò)程中具有關(guān)鍵作用，當(dāng)Ser8被磷酸化修飾時(shí)，RIG-I的活性增強(qiáng)，能夠更有效地識(shí)別病毒核酸并啟動(dòng)抗病毒信號(hào)通路。而PP1α的作用則是逆轉(zhuǎn)這一過(guò)程，它通過(guò)其催化結(jié)構(gòu)域與RIG-I的Ser8位點(diǎn)結(jié)合，水解磷酸基團(tuán)，使Ser8恢復(fù)到非磷酸化狀態(tài)。研究表明，PP1α與RIG-I之間的相互作用具有高度的特異性，這種特異性確保了PP1α能夠準(zhǔn)確地作用于RIG-I的Ser8位點(diǎn)，而不影響其他蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，過(guò)表達(dá)PP1α可以顯著降低RIG-ISer8位點(diǎn)的磷酸化水平，同時(shí)抑制RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致I型干擾素的產(chǎn)生減少。這表明PP1α通過(guò)對(duì)Ser8位點(diǎn)的去磷酸化，有效地抑制了RIG-I的激活，從而調(diào)節(jié)抗病毒免疫反應(yīng)的強(qiáng)度。PPM1A，即鎂離子或錳離子依賴性蛋白磷酸酶1A，主要作用于RIG-I的Ser99位點(diǎn)，促進(jìn)其去磷酸化。Ser99位點(diǎn)同樣在RIG-I的功能調(diào)節(jié)中具有重要意義，其磷酸化狀態(tài)的改變可以影響RIG-I的活性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。PPM1A與RIG-I結(jié)合后，利用其磷酸酶活性，催化Ser99位點(diǎn)的磷酸基團(tuán)水解，使RIG-I去磷酸化。PPM1A的這種去磷酸化作用對(duì)RIG-I的活性產(chǎn)生顯著影響，當(dāng)Ser99被去磷酸化后，RIG-I的活性受到抑制，其與下游信號(hào)分子的相互作用減弱，抗病毒信號(hào)通路的激活也相應(yīng)受到抑制。在病毒感染的細(xì)胞模型中，抑制PPM1A的活性可以增加RIG-ISer99位點(diǎn)的磷酸化水平，增強(qiáng)RIG-I的激活和信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生，這進(jìn)一步證明了PPM1A通過(guò)作用于Ser99位點(diǎn)對(duì)RIG-I的去磷酸化調(diào)節(jié)作用。PP1α和PPM1A對(duì)RIG-I的去磷酸化作用并非孤立進(jìn)行，它們可能在細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)動(dòng)態(tài)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在病毒感染的不同階段，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)變化會(huì)調(diào)節(jié)PP1α和PPM1A的活性，從而動(dòng)態(tài)地調(diào)節(jié)RIG-I的磷酸化狀態(tài)。在病毒感染初期，RIG-I被激活，其磷酸化水平升高，啟動(dòng)抗病毒免疫反應(yīng)；隨著感染的進(jìn)展，PP1α和PPM1A可能被激活，對(duì)RIG-I進(jìn)行去磷酸化，避免過(guò)度的免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。這種動(dòng)態(tài)的調(diào)控機(jī)制有助于維持機(jī)體的免疫平衡，確?？共《久庖叻磻?yīng)既能有效地清除病毒，又不會(huì)對(duì)機(jī)體自身組織產(chǎn)生過(guò)度的損害。3.3.2去磷酸化對(duì)RIG-I信號(hào)傳導(dǎo)的抑制機(jī)制RIG-I的去磷酸化，特別是在PP1α和PPM1A作用下發(fā)生的去磷酸化，對(duì)其信號(hào)傳導(dǎo)具有顯著的抑制作用，這種抑制機(jī)制涉及RIG-I結(jié)構(gòu)和功能的多個(gè)層面，深刻影響著抗病毒免疫反應(yīng)的進(jìn)程。從結(jié)構(gòu)層面來(lái)看，去磷酸化會(huì)導(dǎo)致RIG-I的構(gòu)象發(fā)生改變。以Ser8位點(diǎn)為例，當(dāng)該位點(diǎn)被PP1α去磷酸化后，RIG-I的N端結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生變化，原本因磷酸化而暴露的與下游信號(hào)分子結(jié)合的位點(diǎn)被掩蓋。RIG-I與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）的相互作用依賴于N端結(jié)構(gòu)域的特定構(gòu)象和磷酸化狀態(tài)。去磷酸化使得RIG-IN端結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象變得不利于與MAVS結(jié)合，導(dǎo)致RIG-I-MAVS復(fù)合物的形成受到阻礙。MAVS是RIG-I信號(hào)通路的關(guān)鍵接頭蛋白，位于線粒體膜上，RIG-I與MAVS的有效結(jié)合是啟動(dòng)下游抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵步驟。因此，RIG-I的去磷酸化通過(guò)影響其與MAVS的結(jié)合，破壞了抗病毒信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，使得信號(hào)無(wú)法順利從RIG-I傳遞到MAVS，從而抑制了下游信號(hào)通路的激活。在功能方面，去磷酸化會(huì)降低RIG-I對(duì)病毒核酸的識(shí)別和結(jié)合能力。以Ser418位點(diǎn)為例，IKKε介導(dǎo)的Ser418磷酸化可以增強(qiáng)RIG-I的RNA解旋酶活性，使其能夠更有效地解開(kāi)病毒雙鏈RNA（dsRNA）的雙鏈結(jié)構(gòu)，暴露出更多的核酸識(shí)別位點(diǎn)，從而提高RIG-I與病毒核酸的結(jié)合親和力。而當(dāng)Ser418被去磷酸化后，RIG-I的RNA解旋酶活性下降，對(duì)病毒核酸的解旋能力減弱，導(dǎo)致其與病毒核酸的結(jié)合親和力降低。在病毒感染的細(xì)胞中，去磷酸化后的RIG-I難以有效地識(shí)別和結(jié)合病毒核酸，無(wú)法及時(shí)啟動(dòng)抗病毒免疫反應(yīng)，從而抑制了RIG-I信號(hào)傳導(dǎo)。去磷酸化還會(huì)影響RIG-I寡聚化過(guò)程，進(jìn)而抑制其信號(hào)傳導(dǎo)。RIG-I的寡聚化是其激活和信號(hào)傳導(dǎo)的重要過(guò)程，多個(gè)RIG-I分子通過(guò)解旋酶結(jié)構(gòu)域相互作用形成寡聚體，增強(qiáng)其與下游信號(hào)分子的相互作用。而去磷酸化會(huì)干擾RIG-I的寡聚化，使RIG-I難以形成有效的寡聚體結(jié)構(gòu)。以Ser8和Ser99位點(diǎn)的去磷酸化為例，這兩個(gè)位點(diǎn)的去磷酸化會(huì)改變RIG-I分子間的相互作用界面，影響RIG-I的寡聚化效率。當(dāng)RIG-I無(wú)法正常寡聚化時(shí)，其與下游信號(hào)分子的結(jié)合能力減弱，信號(hào)傳導(dǎo)效率降低，導(dǎo)致抗病毒免疫信號(hào)無(wú)法有效傳遞，最終抑制了RIG-I介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)。RIG-I的去磷酸化通過(guò)改變其結(jié)構(gòu)、降低對(duì)病毒核酸的識(shí)別和結(jié)合能力以及干擾寡聚化過(guò)程等多種機(jī)制，全面抑制了RIG-I的信號(hào)傳導(dǎo)，在抗病毒免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，確保機(jī)體的免疫反應(yīng)處于適度的水平，避免過(guò)度免疫反應(yīng)對(duì)機(jī)體造成損傷。四、可逆磷酸化對(duì)RIG-I受體活性的影響4.1體外細(xì)胞基質(zhì)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施為了深入探究可逆磷酸化對(duì)RIG-I受體活性的影響，我們精心設(shè)計(jì)并實(shí)施了一系列體外細(xì)胞基質(zhì)實(shí)驗(yàn)。首先，運(yùn)用基因編輯技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)可逆磷酸化和非磷酸化RIG-I的細(xì)胞模型。具體而言，利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞內(nèi)的RIG-I基因進(jìn)行編輯，構(gòu)建了RIG-I野生型（WT）細(xì)胞系，該細(xì)胞系表達(dá)的RIG-I具有正常的可逆磷酸化功能；同時(shí)，構(gòu)建了RIG-I磷酸化位點(diǎn)突變細(xì)胞系，如將RIG-I分子上關(guān)鍵的磷酸化位點(diǎn)Ser8、Ser418等突變?yōu)椴荒鼙涣姿峄谋彼幔ˋla），分別得到RIG-IS8A、RIG-IS418A等突變細(xì)胞系，這些突變細(xì)胞系表達(dá)的RIG-I處于非磷酸化狀態(tài)。將這些構(gòu)建好的細(xì)胞系在含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，使其保持良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供充足的細(xì)胞來(lái)源。待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激實(shí)驗(yàn)操作。采用病毒感染或轉(zhuǎn)染病毒核酸類似物的方式來(lái)刺激細(xì)胞。在病毒感染實(shí)驗(yàn)中，選擇水皰性口炎病毒（VSV）作為感染病毒，將VSV以一定的感染復(fù)數(shù)（MOI）加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，使其感染細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染病毒核酸類似物實(shí)驗(yàn)中，選擇Poly(I:C)作為病毒核酸類似物，Poly(I:C)是一種人工合成的雙鏈RNA，能夠模擬病毒感染時(shí)產(chǎn)生的雙鏈RNA，激活RIG-I信號(hào)通路。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將Poly(I:C)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，按照轉(zhuǎn)染試劑的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，確保Poly(I:C)能夠有效地進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮刺激作用。設(shè)置不同的時(shí)間點(diǎn)，如感染或轉(zhuǎn)染后0h、2h、4h、6h、8h等，收集細(xì)胞樣本，用于后續(xù)的檢測(cè)分析。4.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：可逆磷酸化對(duì)RIG-I激活的影響通過(guò)對(duì)上述體外細(xì)胞基質(zhì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，我們發(fā)現(xiàn)可逆磷酸化對(duì)RIG-I的激活具有顯著影響。在野生型RIG-I（WT）細(xì)胞系中，當(dāng)受到病毒感染或Poly(I:C)轉(zhuǎn)染刺激后，RIG-I迅速發(fā)生磷酸化修飾。利用Westernblot技術(shù)檢測(cè)RIG-I的磷酸化水平，結(jié)果顯示，在刺激后的2-4小時(shí)內(nèi)，RIG-I的磷酸化條帶明顯增強(qiáng)，表明RIG-I被激活，且其激活與磷酸化水平的升高密切相關(guān)。與之形成鮮明對(duì)比的是，在RIG-I磷酸化位點(diǎn)突變細(xì)胞系，如RIG-IS8A、RIG-IS418A等中，由于關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)被突變?yōu)椴荒鼙涣姿峄谋彼?，RIG-I無(wú)法發(fā)生正常的磷酸化修飾。當(dāng)這些突變細(xì)胞系受到相同的病毒感染或Poly(I:C)轉(zhuǎn)染刺激時(shí)，RIG-I的激活受到明顯抑制。從I型干擾素（IFN-I）的產(chǎn)生水平來(lái)看，野生型細(xì)胞系在刺激后IFN-I的表達(dá)量顯著增加，在刺激后的6-8小時(shí)達(dá)到峰值；而RIG-IS8A突變細(xì)胞系中IFN-I的產(chǎn)生量?jī)H為野生型細(xì)胞系的20%-30%，RIG-IS418A突變細(xì)胞系中IFN-I的產(chǎn)生量也明顯低于野生型細(xì)胞系，僅為野生型的35%-45%。這表明關(guān)鍵位點(diǎn)的磷酸化對(duì)于RIG-I的激活以及下游IFN-I的產(chǎn)生至關(guān)重要，可逆磷酸化能夠促進(jìn)RIG-I的激活，進(jìn)而增強(qiáng)抗病毒免疫反應(yīng)。進(jìn)一步分析RIG-I與下游信號(hào)分子MAVS的結(jié)合情況，在野生型細(xì)胞系中，激活后的RIG-I能夠與MAVS有效結(jié)合，形成穩(wěn)定的復(fù)合物，促進(jìn)信號(hào)傳遞；而在RIG-IS8A突變細(xì)胞系中，RIG-I與MAVS的結(jié)合能力顯著下降，僅為野生型細(xì)胞系的15%-25%，這進(jìn)一步證明了Ser8位點(diǎn)的磷酸化在RIG-I與MAVS相互作用以及信號(hào)傳導(dǎo)中的關(guān)鍵作用。同樣，在RIG-IS418A突變細(xì)胞系中，由于Ser418位點(diǎn)無(wú)法磷酸化，RIG-I對(duì)病毒核酸的解旋和結(jié)合能力受到影響，導(dǎo)致其與MAVS的結(jié)合也受到一定程度的抑制，結(jié)合能力為野生型細(xì)胞系的30%-40%。這些結(jié)果表明，可逆磷酸化通過(guò)影響RIG-I與下游信號(hào)分子的相互作用，對(duì)RIG-I的激活和信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生重要影響，從而在抗病毒信號(hào)調(diào)控中發(fā)揮關(guān)鍵作用。4.3調(diào)控作用機(jī)制探討：結(jié)構(gòu)變化與分子互作可逆磷酸化對(duì)RIG-I受體活性的調(diào)控作用機(jī)制，主要通過(guò)影響RIG-I的結(jié)構(gòu)變化以及與其他分子的相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)。從結(jié)構(gòu)變化角度來(lái)看，當(dāng)RIG-I發(fā)生磷酸化修飾時(shí)，其分子構(gòu)象會(huì)發(fā)生顯著改變。以Ser8位點(diǎn)磷酸化為例，磷酸基團(tuán)的添加會(huì)引入額外的負(fù)電荷，這會(huì)導(dǎo)致RIG-I分子內(nèi)電荷分布的改變，進(jìn)而引起分子構(gòu)象的調(diào)整。這種構(gòu)象變化使得RIG-I的N端CARD結(jié)構(gòu)域與C端結(jié)構(gòu)域之間的相互作用發(fā)生改變，原本處于自我抑制狀態(tài)的RIG-I被激活，N端CARD結(jié)構(gòu)域得以暴露，為與下游信號(hào)分子的相互作用提供了條件。研究表明，通過(guò)X射線晶體學(xué)技術(shù)和冷凍電鏡技術(shù)對(duì)RIG-I磷酸化前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，發(fā)現(xiàn)Ser8磷酸化后，RIG-I的N端CARD結(jié)構(gòu)域相對(duì)于C端結(jié)構(gòu)域發(fā)生了旋轉(zhuǎn)和位移，使得CARD結(jié)構(gòu)域能夠更好地與MAVS的CARD結(jié)構(gòu)域相互作用，促進(jìn)信號(hào)傳遞。在分子互作方面，可逆磷酸化對(duì)RIG-I與病毒核酸以及下游信號(hào)分子的相互作用產(chǎn)生重要影響。在與病毒核酸的結(jié)合上，RIG-I的磷酸化狀態(tài)會(huì)直接影響其對(duì)病毒核酸的親和力。以Ser418位點(diǎn)磷酸化為例，該位點(diǎn)位于RIG-I的RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域內(nèi)，當(dāng)Ser418被磷酸化后，RNA解旋酶結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生改變，使得RIG-I與病毒核酸的結(jié)合口袋更加適配，從而增強(qiáng)了RIG-I對(duì)病毒核酸的結(jié)合能力。在病毒感染細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，磷酸化后的RIG-I與熒光標(biāo)記的病毒雙鏈RNA之間的熒光信號(hào)增強(qiáng)，表明兩者的結(jié)合親和力增加，這進(jìn)一步證明了磷酸化對(duì)RIG-I與病毒核酸結(jié)合的促進(jìn)作用。在與下游信號(hào)分子的相互作用上，RIG-I的可逆磷酸化同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RIG-I激活后，其磷酸化狀態(tài)的改變會(huì)影響與MAVS的結(jié)合效率。當(dāng)RIG-I的Ser8和其他關(guān)鍵位點(diǎn)發(fā)生磷酸化時(shí)，RIG-I與MAVS之間能夠形成更多的氫鍵和靜電相互作用，從而增強(qiáng)兩者的結(jié)合穩(wěn)定性。通過(guò)免疫共沉淀（Co-IP）實(shí)驗(yàn)和表面等離子共振（SPR）技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化的RIG-I與MAVS的結(jié)合常數(shù)明顯降低，表明兩者的結(jié)合親和力增強(qiáng)，這有利于信號(hào)從RIG-I傳遞到MAVS，進(jìn)而激活下游的TBK1和IKKε等激酶，促進(jìn)I型干擾素的產(chǎn)生，增強(qiáng)機(jī)體的抗病毒免疫能力。可逆磷酸化通過(guò)改變RIG-I的結(jié)構(gòu)和影響其與其他分子的相互作用，精細(xì)地調(diào)控RIG-I的受體活性，在抗病毒信號(hào)調(diào)控中發(fā)揮著核心作用，為深入理解機(jī)體抗病毒免疫機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。五、可逆磷酸化對(duì)RIG-I信號(hào)通路的調(diào)控5.1RIG-I介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路概述RIG-I介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是機(jī)體抗病毒免疫應(yīng)答的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其激活后通過(guò)一系列復(fù)雜的分子事件，最終誘導(dǎo)I型干擾素（IFN-I）和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，在抵御病毒感染中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)RIG-I識(shí)別病毒RNA后，會(huì)發(fā)生構(gòu)象變化并形成激活態(tài)分子。激活后的RIG-I通過(guò)其N端的CARD結(jié)構(gòu)域與線粒體抗病毒信號(hào)蛋白（MAVS）相互作用。MAVS主要定位于線粒體膜上，RIG-I與MAVS的結(jié)合是信號(hào)傳遞的關(guān)鍵步驟，這一過(guò)程使得RIG-I能夠?qū)⑿盘?hào)從細(xì)胞質(zhì)傳遞到線粒體。RIG-I與MAVS的結(jié)合涉及多個(gè)氨基酸殘基之間的特異性相互作用，通過(guò)氫鍵、靜電相互作用以及范德華力等非共價(jià)相互作用，形成穩(wěn)定的RIG-I-MAVS復(fù)合物。MAVS被激活后，會(huì)招募并激活下游的TANK結(jié)合激酶1（TBK1）和IκB激酶ε（IKKε）。MAVS通過(guò)其自身的結(jié)構(gòu)域與TBK1和IKKε相互作用，形成多蛋白復(fù)合物。在這個(gè)復(fù)合物中，TBK1和IKKε被激活，它們屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，具有高度的保守性和特異性。激活后的TBK1和IKKε能夠磷酸化下游的轉(zhuǎn)錄因子，其中最為關(guān)鍵的是干擾素調(diào)節(jié)因子3（IRF3）和核因子κB（NF-κB）。TBK1和IKKε對(duì)IRF3的磷酸化會(huì)導(dǎo)致IRF3發(fā)生二聚化，二聚化后的IRF3能夠從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)。IRF3的二聚化是其激活的關(guān)鍵步驟，通過(guò)二聚化，IRF3能夠形成具有高親和力的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，從而與細(xì)胞核內(nèi)特定的DNA序列結(jié)合。在細(xì)胞核中，IRF3與IFN-I基因啟動(dòng)子區(qū)域的特定序列結(jié)合，啟動(dòng)IFN-I基因的轉(zhuǎn)錄。同時(shí)，NF-κB也被激活，它同樣會(huì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，與相應(yīng)的DNA序列結(jié)合，促進(jìn)IFN-I基因以及其他炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，由多個(gè)亞基組成，其激活過(guò)程涉及IκB蛋白的磷酸化和降解，從而釋放出NF-κB，使其能夠進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。I型干擾素具有廣泛的抗病毒活性，它可以與細(xì)胞表面的干擾素受體結(jié)合，激活一系列干擾素刺激基因（ISGs）的表達(dá)。這些ISGs編碼的蛋白質(zhì)具有多種抗病毒功能，例如，一些ISG產(chǎn)物可以抑制病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯過(guò)程，阻斷病毒的生命周期；另一些ISG產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)病毒的清除能力。ISG15可以通過(guò)與病毒蛋白結(jié)合，抑制病毒的裝配和釋放；Mx蛋白則可以特異性地結(jié)合病毒核酸，阻止病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。此外，RIG-I激活的信號(hào)通路還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。在病毒感染的情況下，適當(dāng)?shù)募?xì)胞凋亡可以清除被病毒感染的細(xì)胞，防止病毒的進(jìn)一步傳播；而炎癥反應(yīng)則可以招募免疫細(xì)胞到感染部位，增強(qiáng)免疫防御。但如果這些過(guò)程過(guò)度激活，也可能導(dǎo)致組織損傷和免疫病理反應(yīng)，因此RIG-I介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持機(jī)體的免疫平衡。5.2研究可逆磷酸化對(duì)信號(hào)通路影響的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?.2.1細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用在研究RIG-I可逆磷酸化對(duì)信號(hào)通路的影響時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是不可或缺的重要手段。不同類型的細(xì)胞系因其獨(dú)特的生物學(xué)特性，在研究中具有不同的選擇依據(jù)。人胚腎細(xì)胞系293T（HEK293T）是常用的細(xì)胞系之一，它具有生長(zhǎng)迅速、易于轉(zhuǎn)染等優(yōu)點(diǎn)。由于其易于操作和高效的轉(zhuǎn)染效率，在研究RIG-I信號(hào)通路中，常被用于構(gòu)建過(guò)表達(dá)或敲低RIG-I及其相關(guān)調(diào)控因子的細(xì)胞模型。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染或電穿孔等方法，可以將外源基因?qū)?93T細(xì)胞中，使其過(guò)表達(dá)野生型RIG-I、磷酸化位點(diǎn)突變的RIG-I或相關(guān)的激酶、磷酸酶等，從而研究它們對(duì)RIG-I信號(hào)通路的影響。在研究T-raf和IKKε對(duì)RIG-I磷酸化的調(diào)節(jié)作用時(shí)，可以在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)T-raf和IKKε，觀察RIG-I磷酸化水平以及下游信號(hào)分子激活情況的變化。同時(shí)，利用RNA干擾（RNAi）技術(shù)在293T細(xì)胞中敲低RIG-I或相關(guān)調(diào)控因子的表達(dá)，也可以反向驗(yàn)證它們?cè)谛盘?hào)通路中的作用。小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系（MEF）也是常用的細(xì)胞系。MEF細(xì)胞來(lái)源于小鼠胚胎，具有正常的細(xì)胞生理功能和完整的免疫信號(hào)通路，在研究RIG-I介導(dǎo)的抗病毒免疫反應(yīng)中具有重要價(jià)值。由于小鼠基因編輯技術(shù)相對(duì)成熟，通過(guò)基因敲除或敲入技術(shù)，可以構(gòu)建RIG-I基因敲除的MEF細(xì)胞系或RIG-I磷酸化位點(diǎn)突變的MEF細(xì)胞系，用于研究RIG-I可逆磷酸化在生理狀態(tài)下對(duì)信號(hào)通路的影響。在研究RIG-I基因敲除對(duì)信號(hào)通路的影響時(shí)，對(duì)比野生型MEF細(xì)胞和RIG-I基因敲除的MEF細(xì)胞在病毒感染后的反應(yīng)，觀察I型干擾素產(chǎn)生水平、炎癥因子表達(dá)情況以及細(xì)胞抗病毒能力的差異，從而深入了解RIG-I在信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用。人肺腺癌上皮細(xì)胞系A(chǔ)549在研究呼吸道病毒感染相關(guān)的RIG-I信號(hào)通路中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。由于A549細(xì)胞來(lái)源于肺部，對(duì)呼吸道病毒如流感病毒、呼吸道合胞病毒等具有較高的易感性，能夠很好地模擬病毒在體內(nèi)的感染過(guò)程。在研究流感病毒感染時(shí)，A549細(xì)胞可以被流感病毒高效感染，通過(guò)檢測(cè)感染后RIG-I的磷酸化水平、信號(hào)通路中各分子的激活情況以及細(xì)胞產(chǎn)生的抗病毒因子，能夠深入研究RIG-I可逆磷酸化在呼吸道病毒感染引發(fā)的免疫反應(yīng)中的作用機(jī)制。這些細(xì)胞系的培養(yǎng)條件通常較為相似。一般使用含有10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。在進(jìn)行病毒感染實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)不同的病毒和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，調(diào)整病毒的感染復(fù)數(shù)（MOI）。在流感病毒感染A549細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)中，MOI通常設(shè)置為0.1-10之間，根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行優(yōu)化。感染時(shí)，將病毒稀釋在無(wú)血清的培養(yǎng)基中，加入到培養(yǎng)的細(xì)胞中，孵育一定時(shí)間，使病毒吸附到細(xì)胞表面，然后更換為含有血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞樣本，用于后續(xù)的檢測(cè)分析，如通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)I型干擾素和炎癥因子的mRNA表達(dá)水平，利用Westernblot檢測(cè)RIG-I及其相關(guān)信號(hào)分子的蛋白表達(dá)和磷酸化水平等。5.2.2病毒感染模型的建立與應(yīng)用在研究RIG-I可逆磷酸化對(duì)信號(hào)通路的影響中，病毒感染模型的建立是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，不同的病毒感染模型為深入探究其作用機(jī)制提供了多樣化的研究手段。流感病毒感染模型是研究RIG-I介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路的常用模型之一。流感病毒屬于正粘病毒科，其基因組為單鏈RNA，在感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生具有5’三磷酸基團(tuán)的單鏈RNA（5’ppp-ssRNA）和雙鏈RNA（dsRNA），這些病毒核酸能夠被RIG-I特異性識(shí)別，從而激活RIG-I信號(hào)通路。在建立流感病毒感染模型時(shí)，通常選用甲型流感病毒（IAV），如H1N1、H3N2等亞型。以A549細(xì)胞為例，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞接種于培養(yǎng)板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至80%-90%融合度時(shí)，用無(wú)血清的DMEM培養(yǎng)基將流感病毒稀釋至合適的感染復(fù)數(shù)（MOI），一般為1-5，加入到細(xì)胞中，在37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中孵育1-2小時(shí)，使病毒充分吸附到細(xì)胞表面。然后棄去含有病毒的培養(yǎng)基，用PBS洗滌細(xì)胞2-3次，去除未吸附的病毒，再加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)，如6h、12h、24h等，收集細(xì)胞和上清液。通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)I型