Rsf-1對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性的影響及機(jī)制探究

Rsf-1對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性的影響及機(jī)制探究一、引言1.1研究背景與意義肺癌作為全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率均居前列的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康。其中，非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）是肺癌中最常見的類型，約占肺癌總數(shù)的85%。盡管在過去幾十年中，NSCLC的治療取得了一定進(jìn)展，包括手術(shù)、化療、放療、靶向治療和免疫治療等多種手段的應(yīng)用，但總體5年生存率仍較低，僅為20%-30%。化療在NSCLC的綜合治療中占據(jù)重要地位，尤其是對于晚期無法手術(shù)切除或術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者。紫杉醇作為一種經(jīng)典的化療藥物，通過促進(jìn)微管蛋白聚合、抑制微管解聚，從而阻礙細(xì)胞有絲分裂，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長的目的。在NSCLC的治療中，紫杉醇常與其他藥物聯(lián)合使用，如順鉑、卡鉑等，組成聯(lián)合化療方案，在臨床實踐中顯示出一定的療效。然而，隨著治療的進(jìn)行，部分患者會出現(xiàn)對紫杉醇的耐藥現(xiàn)象，導(dǎo)致化療效果下降，腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。據(jù)統(tǒng)計，約有30%-50%的NSCLC患者在接受紫杉醇化療過程中會逐漸產(chǎn)生耐藥。耐藥性的產(chǎn)生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，涉及多種分子機(jī)制。尋找影響紫杉醇化療敏感性的生物標(biāo)志物，對于預(yù)測患者對紫杉醇化療的反應(yīng)、制定個性化的治療方案具有重要意義。通過精準(zhǔn)篩選出對紫杉醇敏感的患者，給予針對性的化療，不僅可以提高治療效果，還能避免不必要的化療毒副作用，減輕患者的痛苦和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。Rsf-1（也稱為HBXAP、HBXBP1、SNF2L11）是一種核內(nèi)蛋白，在多種生物過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。它能夠通過調(diào)節(jié)凝集酶I啟動子，促使癌細(xì)胞進(jìn)入增殖狀態(tài)。同時，Rsf-1還參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)重塑等重要過程，與細(xì)胞的生長、分化和腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。已有研究表明，Rsf-1在多種腫瘤組織中異常高表達(dá)，如卵巢癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等，并且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度、轉(zhuǎn)移潛能及患者預(yù)后相關(guān)。在卵巢癌和鼻咽癌中，Rsf-1被發(fā)現(xiàn)可通過核因子-κB（NF-κB）途徑增強(qiáng)癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性。然而，Rsf-1在NSCLC紫杉醇化療敏感性方面的作用及機(jī)制尚未完全明確。探究Rsf-1與NSCLC紫杉醇化療敏感性之間的關(guān)系，有望揭示NSCLC化療耐藥的新機(jī)制，為臨床治療提供新的靶點和策略。這不僅有助于提高NSCLC患者的化療療效，改善患者的生存狀況，還可能為開發(fā)新型的化療增敏劑或靶向治療藥物提供理論依據(jù)，具有重要的臨床意義和潛在的應(yīng)用價值。1.2研究目的與創(chuàng)新點本研究旨在深入探討Rsf-1對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性的影響及其潛在分子機(jī)制。具體而言，通過細(xì)胞實驗和動物實驗，檢測Rsf-1在不同紫杉醇化療敏感性的NSCLC細(xì)胞系中的表達(dá)差異，明確Rsf-1表達(dá)水平與紫杉醇化療敏感性的相關(guān)性；利用基因編輯技術(shù)，如CRISPR/Cas9敲除或RNA干擾技術(shù)1.3研究方法與技術(shù)路線文獻(xiàn)研究：系統(tǒng)檢索PubMed、WebofScience、Embase、中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，全面收集與Rsf-1、非小細(xì)胞肺癌以及紫杉醇化療敏感性相關(guān)的文獻(xiàn)資料。檢索詞涵蓋“Rsf-1”“Non-SmallCellLungCancer”“Paclitaxel”“Chemosensitivity”“Resistance”等及其同義詞。對篩選出的文獻(xiàn)進(jìn)行深入分析，梳理Rsf-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用、紫杉醇化療耐藥的機(jī)制以及兩者之間可能存在的聯(lián)系，總結(jié)現(xiàn)有研究的成果與不足，為后續(xù)實驗研究提供理論依據(jù)。細(xì)胞實驗：細(xì)胞培養(yǎng)：選取多種具有不同紫杉醇化療敏感性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，如A549、H1299、H460等，從美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）或其他可靠細(xì)胞庫獲取。將細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI-1640或DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，定期傳代和換液，維持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)。細(xì)胞分組：將每種細(xì)胞系隨機(jī)分為對照組、紫杉醇處理組、Rsf-1敲低組（通過RNA干擾技術(shù)或CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)降低Rsf-1表達(dá)）、Rsf-1過表達(dá)組（轉(zhuǎn)染Rsf-1表達(dá)質(zhì)粒）以及Rsf-1敲低+紫杉醇處理組、Rsf-1過表達(dá)+紫杉醇處理組等，每組設(shè)置多個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的可靠性。檢測指標(biāo)與方法：細(xì)胞增殖能力檢測：采用CCK-8法。在96孔板中接種適量細(xì)胞，培養(yǎng)24h后進(jìn)行相應(yīng)處理。分別在處理后24h、48h、72h等時間點，每孔加入10μLCCK-8試劑，繼續(xù)孵育1-4h，用酶標(biāo)儀測定450nm處的吸光度（OD值），根據(jù)OD值計算細(xì)胞增殖抑制率，比較不同組細(xì)胞的增殖能力差異。細(xì)胞凋亡檢測：利用AnnexinV-FITC/PI雙染法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)。收集處理后的細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次，加入BindingBuffer重懸細(xì)胞，再依次加入AnnexinV-FITC和PI染色液，避光孵育15-30min，在流式細(xì)胞儀上檢測細(xì)胞凋亡率，分析Rsf-1對紫杉醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的影響。細(xì)胞周期檢測：采用PI單染法。將細(xì)胞固定于70%冷乙醇中，4℃過夜，離心棄上清，用PBS洗滌后加入PI染色液，含RNaseA，37℃避光孵育30-60min，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期分布，觀察Rsf-1對細(xì)胞周期的調(diào)控作用以及與紫杉醇化療敏感性的關(guān)系。蛋白表達(dá)檢測：運(yùn)用Westernblotting技術(shù)。收集細(xì)胞，提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取等量蛋白進(jìn)行SDS電泳，將分離后的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用5%脫脂奶粉封閉1-2h，分別加入抗Rsf-1、p-P65、BcL2、CFLAR、XIAP等目的蛋白抗體以及內(nèi)參抗體（如β-actin或GAPDH），4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗，室溫孵育1-2h，用ECL化學(xué)發(fā)光試劑顯色，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并分析蛋白表達(dá)水平的變化，探究Rsf-1影響紫杉醇化療敏感性的相關(guān)信號通路。mRNA表達(dá)檢測：通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)。提取細(xì)胞總RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增，以GAPDH或β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算目的基因mRNA的相對表達(dá)量，驗證Rsf-1及相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平的變化與蛋白表達(dá)變化的一致性。動物實驗：動物模型建立：選用4-6周齡、體重18-22g的BALB/c裸鼠，購自正規(guī)實驗動物中心。將對數(shù)生長期的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（如H460細(xì)胞）以適量濃度（如5×10?個/mL）重懸于無血清培養(yǎng)基中，每只裸鼠腋下皮下注射0.1mL細(xì)胞懸液，建立裸鼠皮下移植瘤模型。待移植瘤體積長至約100-150mm3時，將裸鼠隨機(jī)分為對照組、紫杉醇組、Rsf-1敲除組（在細(xì)胞接種前對細(xì)胞進(jìn)行Rsf-1基因敲除處理）、Rsf-1敲除+紫杉醇組等，每組5-8只。藥物處理：紫杉醇組和Rsf-1敲除+紫杉醇組按照10-20mg/kg的劑量，每周2-3次腹腔注射紫杉醇溶液；對照組和Rsf-1敲除組給予等體積的生理鹽水或相應(yīng)的溶劑。在整個實驗過程中，密切觀察裸鼠的一般狀態(tài)，包括精神、飲食、活動等情況，每周用游標(biāo)卡尺測量移植瘤的長徑（a）和短徑（b），按照公式V=1/2×a×b2計算移植瘤體積，繪制腫瘤生長曲線。檢測指標(biāo)與方法：腫瘤組織形態(tài)學(xué)觀察：實驗結(jié)束后，脫頸椎處死裸鼠，完整取出移植瘤組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干水分，稱重并記錄。將部分腫瘤組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)和排列等變化。免疫組織化學(xué)染色（IHC）：將石蠟切片脫蠟、水化后，進(jìn)行抗原修復(fù)，用3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，5%牛血清白蛋白封閉非特異性結(jié)合位點，分別加入抗Rsf-1、Ki-67、Cleaved-caspase3等抗體，4℃孵育過夜，次日加入相應(yīng)的二抗，DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下觀察并分析陽性細(xì)胞的表達(dá)情況，評估Rsf-1在腫瘤組織中的表達(dá)水平以及與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡的關(guān)系。蛋白和mRNA表達(dá)檢測：取部分新鮮腫瘤組織，提取總蛋白和總RNA，分別采用Westernblotting和qRT-PCR技術(shù)檢測Rsf-1及相關(guān)信號通路蛋白和基因的表達(dá)水平，方法同細(xì)胞實驗，從動物水平驗證Rsf-1對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性的影響及相關(guān)機(jī)制。技術(shù)路線：首先，通過全面的文獻(xiàn)研究，明確Rsf-1與非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性研究的現(xiàn)狀與空白，確定研究方向和具體實驗方案。開展細(xì)胞實驗，對不同的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系進(jìn)行培養(yǎng)和分組處理，運(yùn)用多種細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)檢測細(xì)胞增殖、凋亡、周期以及相關(guān)蛋白和基因表達(dá)等指標(biāo)，初步探究Rsf-1對紫杉醇化療敏感性的影響及其潛在分子機(jī)制。在細(xì)胞實驗的基礎(chǔ)上，建立裸鼠皮下移植瘤模型，進(jìn)行動物實驗，通過藥物處理和相關(guān)檢測指標(biāo)的測定，從動物整體水平驗證細(xì)胞實驗結(jié)果，進(jìn)一步明確Rsf-1在非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性中的作用。最后，對細(xì)胞實驗和動物實驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析，總結(jié)Rsf-1與非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性的關(guān)系及分子機(jī)制，撰寫研究論文，為非小細(xì)胞肺癌的臨床治療提供理論依據(jù)和潛在治療靶點。二、非小細(xì)胞肺癌與紫杉醇化療2.1非小細(xì)胞肺癌概述肺癌是起源于肺部支氣管黏膜或腺體的惡性腫瘤，是全球范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。根據(jù)組織病理學(xué)特征，肺癌主要分為小細(xì)胞肺癌（SmallCellLungCancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）兩大類型。其中，NSCLC在肺癌中所占比例高達(dá)80%-85%，是最為常見的肺癌亞型。NSCLC主要包括肺腺癌、肺鱗癌和大細(xì)胞癌等亞型。肺腺癌是NSCLC中最常見的類型，近年來其發(fā)病率呈上升趨勢，在我國，肺腺癌約占NSCLC的50%以上。腺癌多起源于支氣管黏液腺，可發(fā)生于細(xì)小支氣管或中央氣道，女性患者相對多見，且與吸煙的相關(guān)性較弱，部分患者可能存在EGFR、ALK等驅(qū)動基因突變，這些突變狀態(tài)對于指導(dǎo)靶向治療具有重要意義。肺鱗癌也是NSCLC的重要亞型之一，多發(fā)生于中老年男性，與長期吸煙密切相關(guān)。它通常起源于較大的支氣管，腫瘤生長相對較慢，轉(zhuǎn)移較晚，但對化療和放療的敏感性相對較低。大細(xì)胞癌是一種未分化的非小細(xì)胞癌，較為少見，約占肺癌的10%以下。其癌細(xì)胞體積大，核仁明顯，細(xì)胞形態(tài)多樣，惡性程度較高，轉(zhuǎn)移較早，手術(shù)切除機(jī)會相對較小。此外，NSCLC還包括一些少見類型，如腺鱗癌、肉瘤樣癌、淋巴上皮瘤樣癌等，這些類型的肺癌具有獨特的組織學(xué)和生物學(xué)特征，在診斷和治療上也存在一定的特殊性。在全球范圍內(nèi)，NSCLC的發(fā)病率呈現(xiàn)出明顯的地區(qū)差異。總體而言，發(fā)達(dá)國家的發(fā)病率相對較高，如美國、歐洲等地區(qū)。在發(fā)展中國家，隨著工業(yè)化進(jìn)程的加快和人口老齡化的加劇，NSCLC的發(fā)病率也在逐漸上升。據(jù)世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）發(fā)布的2020年全球癌癥數(shù)據(jù)顯示，肺癌的新發(fā)病例數(shù)為220萬，死亡病例數(shù)為180萬，分別位居全球癌癥發(fā)病和死亡的第一位，而NSCLC在其中占據(jù)了絕大部分比例。在中國，肺癌同樣是發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤。2020年中國肺癌新發(fā)病例數(shù)約為82萬，死亡病例數(shù)約為71萬，其中NSCLC患者人數(shù)眾多。并且，我國NSCLC的發(fā)病率還呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢，這與我國吸煙人數(shù)眾多、空氣污染、職業(yè)暴露等多種因素密切相關(guān)。此外，我國NSCLC患者的發(fā)病年齡有年輕化的趨勢，這也給肺癌的防治工作帶來了新的挑戰(zhàn)。2.2紫杉醇化療在非小細(xì)胞肺癌治療中的應(yīng)用紫杉醇是一種從紅豆杉屬植物樹皮中提取的二萜類化合物，作為一種重要的化療藥物，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）的治療中占據(jù)著重要地位。其作用機(jī)制獨特，主要通過與微管蛋白特異性結(jié)合，促使微管蛋白聚合形成穩(wěn)定的微管束，同時抑制微管解聚，從而破壞細(xì)胞的正常有絲分裂過程。在細(xì)胞有絲分裂過程中，微管起著至關(guān)重要的作用，它參與紡錘體的形成，幫助染色體在細(xì)胞分裂時準(zhǔn)確分離。而紫杉醇對微管動態(tài)平衡的干擾，使得紡錘體無法正常發(fā)揮功能，細(xì)胞被阻滯在G2/M期，無法完成有絲分裂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡。此外，紫杉醇還可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用，它能夠激活細(xì)胞內(nèi)的凋亡信號通路，促使癌細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。在臨床應(yīng)用中，紫杉醇常與其他化療藥物聯(lián)合使用，以提高治療效果。常見的聯(lián)合方案包括紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物（如順鉑、卡鉑）、紫杉醇聯(lián)合吉西他濱等。這些聯(lián)合化療方案在NSCLC的治療中顯示出了一定的療效。例如，一項多中心、隨機(jī)對照的臨床研究（ECOG1594試驗）比較了四種不同的聯(lián)合化療方案（紫杉醇+順鉑、紫杉醇+卡鉑、多西他賽+順鉑、多西他賽+卡鉑）在晚期NSCLC患者中的療效，結(jié)果顯示，紫杉醇聯(lián)合鉑類藥物的方案在有效率、中位生存期等方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢。另一項針對晚期NSCLC患者的研究表明，紫杉醇聯(lián)合吉西他濱的方案也具有較好的耐受性和療效，客觀緩解率可達(dá)30%-40%。然而，隨著紫杉醇在臨床治療中的廣泛應(yīng)用，耐藥性問題逐漸凸顯，成為影響化療效果和患者預(yù)后的重要因素。據(jù)統(tǒng)計，約有30%-50%的NSCLC患者在接受紫杉醇化療過程中會逐漸產(chǎn)生耐藥。紫杉醇耐藥的機(jī)制較為復(fù)雜，涉及多個方面。一方面，腫瘤細(xì)胞可以通過改變藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）等，增強(qiáng)對紫杉醇的外排能力，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而產(chǎn)生耐藥。另一方面，細(xì)胞內(nèi)凋亡信號通路的異常也與紫杉醇耐藥密切相關(guān)。例如，Bcl-2家族蛋白表達(dá)失衡，Bcl-2高表達(dá)或Bax低表達(dá)，會抑制細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的敏感性下降。此外，腫瘤干細(xì)胞的存在也可能是紫杉醇耐藥的原因之一，腫瘤干細(xì)胞具有自我更新和多向分化的能力，對化療藥物具有較強(qiáng)的耐受性，能夠在化療后存活并重新增殖，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)和耐藥。為了解決紫杉醇耐藥問題，臨床上采取了多種策略。一是探索新的聯(lián)合化療方案，將紫杉醇與其他作用機(jī)制不同的藥物聯(lián)合使用，以克服單一藥物的耐藥性，如紫杉醇聯(lián)合免疫檢查點抑制劑，利用免疫治療激活機(jī)體免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，同時降低紫杉醇耐藥的發(fā)生。二是開發(fā)新的劑型，如白蛋白結(jié)合型紫杉醇，相較于傳統(tǒng)的紫杉醇劑型，白蛋白結(jié)合型紫杉醇具有更好的藥代動力學(xué)特性，能夠提高藥物在腫瘤組織中的濃度，增強(qiáng)療效，同時減少不良反應(yīng)，一定程度上改善了紫杉醇耐藥的情況。此外，深入研究紫杉醇耐藥的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點，也是解決耐藥問題的關(guān)鍵方向之一。通過對耐藥相關(guān)信號通路的研究，有望開發(fā)出針對性的靶向治療藥物，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性，提高化療效果。三、Rsf-1的生物學(xué)特性與功能3.1Rsf-1的結(jié)構(gòu)與表達(dá)分布Rsf-1（RemodelingandSpacingFactor1），又被稱為肝炎-BX相關(guān)蛋白（hepatitiesBX-antigenassociatedprotein，HBXAP），其基因定位于人類染色體11q13.5。該區(qū)域在多種腫瘤中常出現(xiàn)擴(kuò)增現(xiàn)象，這也在一定程度上暗示了Rsf-1基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展的緊密聯(lián)系。Rsf-1基因全長包含多個外顯子和內(nèi)含子，通過復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和剪接過程，最終編碼生成Rsf-1蛋白。Rsf-1蛋白由多個功能結(jié)構(gòu)域組成，這些結(jié)構(gòu)域賦予了Rsf-1獨特的生物學(xué)功能。其N端包含一段保守序列，該序列在與其他蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用，例如與SNF2H蛋白相互作用，共同形成RSF染色質(zhì)重塑復(fù)合物。在RSF復(fù)合物中，SNF2H亞單位作為核小體依賴性ATP酶，能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量來改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)；而Rsf-1蛋白則充當(dāng)組蛋白伴侶，協(xié)助組蛋白與DNA的結(jié)合與解離，從而調(diào)節(jié)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，影響基因的轉(zhuǎn)錄過程。此外，Rsf-1蛋白的C端區(qū)域含有一些特定的氨基酸序列，這些序列參與了其對下游基因的調(diào)控作用，通過與特定的轉(zhuǎn)錄因子或DNA序列相互作用，調(diào)控基因的表達(dá)水平。在正常組織中，Rsf-1呈現(xiàn)出相對低水平的表達(dá)，并且其表達(dá)具有一定的組織特異性。例如，在正常的肺組織中，Rsf-1主要在支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞中少量表達(dá)，其表達(dá)水平受到嚴(yán)格的調(diào)控，以維持細(xì)胞的正常生理功能，如細(xì)胞的分化、增殖和凋亡的平衡。在正常的胃腸道組織中，Rsf-1在黏膜上皮細(xì)胞中也有少量表達(dá)，參與維持胃腸道黏膜的正常結(jié)構(gòu)和功能。在正常的乳腺組織中，Rsf-1的表達(dá)水平較低，且主要分布在乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞和腺泡上皮細(xì)胞中。然而，在多種腫瘤組織中，Rsf-1的表達(dá)水平顯著升高。研究表明，在非小細(xì)胞肺癌組織中，Rsf-1的表達(dá)明顯高于癌旁正常組織。通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，在肺腺癌和肺鱗癌組織中，Rsf-1蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，且其表達(dá)強(qiáng)度與腫瘤的病理分級和臨床分期相關(guān)。高表達(dá)Rsf-1的腫瘤組織往往具有更高的惡性程度，更易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在乳腺癌組織中，Rsf-1的表達(dá)水平同樣顯著上調(diào)，與乳腺癌的侵襲性和不良預(yù)后密切相關(guān)。在卵巢癌組織中，Rsf-1基因的擴(kuò)增和蛋白的高表達(dá)較為常見，且與卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性相關(guān)。此外，在胃癌、肝癌、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中，均檢測到Rsf-1的過表達(dá)，其表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。3.2Rsf-1在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用大量研究表明，Rsf-1在腫瘤細(xì)胞的增殖過程中扮演著關(guān)鍵角色。在肺癌細(xì)胞系中，通過RNA干擾技術(shù)降低Rsf-1的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖能力明顯受到抑制。具體表現(xiàn)為細(xì)胞增殖速度減緩，細(xì)胞周期進(jìn)程發(fā)生改變，處于G1期的細(xì)胞比例顯著增加，而進(jìn)入S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量減少，這表明Rsf-1能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞從G1期向S期的轉(zhuǎn)換，從而加速細(xì)胞的增殖。在乳腺癌細(xì)胞系中，Rsf-1高表達(dá)的細(xì)胞株具有更強(qiáng)的增殖活性，而當(dāng)Rsf-1表達(dá)被干擾后，細(xì)胞的克隆形成能力顯著下降，說明Rsf-1對于維持乳腺癌細(xì)胞的持續(xù)增殖至關(guān)重要。在肝癌細(xì)胞中，Rsf-1可以通過激活PI3K/Akt信號通路，上調(diào)細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4（CDK4）的表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖。此外，在胃癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤細(xì)胞中，均發(fā)現(xiàn)Rsf-1的高表達(dá)與細(xì)胞增殖能力呈正相關(guān)，抑制Rsf-1表達(dá)可有效抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。Rsf-1對腫瘤細(xì)胞凋亡的調(diào)控也具有重要影響。在卵巢癌細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)Rsf-1能夠通過激活NF-κB信號通路，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，同時下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，從而抑制卵巢癌細(xì)胞的凋亡。當(dāng)使用Rsf-1的抑制劑或通過基因沉默技術(shù)降低Rsf-1表達(dá)后，卵巢癌細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)的凋亡敏感性顯著增加。在黑色素瘤細(xì)胞中，Rsf-1可以與SNF2H蛋白相互作用，形成染色質(zhì)重塑復(fù)合物，通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，抑制紫杉醇誘導(dǎo)的黑色素瘤細(xì)胞凋亡。在乳腺癌細(xì)胞中，干擾Rsf-1的表達(dá)能夠使細(xì)胞內(nèi)的凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的活性增強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。這些研究結(jié)果表明，Rsf-1通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)和信號通路，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，Rsf-1在這一過程中也發(fā)揮著重要作用。在肺癌細(xì)胞中，Rsf-1高表達(dá)能夠增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力，通過Transwell實驗和劃痕實驗可以觀察到，敲低Rsf-1表達(dá)后，肺癌細(xì)胞穿過基質(zhì)膜的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞劃痕愈合速度減慢。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Rsf-1可以通過激活MAPK/ERK信號通路，上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)，降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移和侵襲。在肝癌細(xì)胞中，Rsf-1能夠通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）相關(guān)蛋白的表達(dá)，如E-cadherin、N-cadherin和Vimentin等，促進(jìn)肝癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中，Rsf-1與β-catenin相互作用，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲。這些研究表明，Rsf-1通過多種信號通路和分子機(jī)制，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，增加腫瘤轉(zhuǎn)移的風(fēng)險。由于Rsf-1對腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為具有重要影響，其表達(dá)水平與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)。在非小細(xì)胞肺癌患者中，研究發(fā)現(xiàn)Rsf-1高表達(dá)的患者總體生存期和無進(jìn)展生存期明顯縮短，且與腫瘤的分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等不良預(yù)后因素相關(guān)。高表達(dá)Rsf-1的非小細(xì)胞肺癌患者更容易出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，提示Rsf-1可以作為評估非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后的一個潛在生物標(biāo)志物。在乳腺癌患者中，Rsf-1的表達(dá)水平與腫瘤的病理分級、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，Rsf-1高表達(dá)的患者預(yù)后較差。在卵巢癌患者中，Rsf-1的高表達(dá)同樣與患者的不良預(yù)后相關(guān)，且與卵巢癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性密切相關(guān)，進(jìn)一步影響患者的治療效果和生存質(zhì)量。此外，在胃癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等多種腫瘤中，均有研究表明Rsf-1高表達(dá)與患者的不良預(yù)后相關(guān)。綜上所述，Rsf-1在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，通過影響腫瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，與腫瘤的惡性程度和患者預(yù)后密切相關(guān)。深入研究Rsf-1的作用機(jī)制，對于揭示腫瘤的發(fā)病機(jī)制、開發(fā)新的治療靶點以及改善腫瘤患者的預(yù)后具有重要意義。四、Rsf-1與非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性的關(guān)聯(lián)研究4.1臨床樣本數(shù)據(jù)分析本研究收集了[X]例接受紫杉醇化療的非小細(xì)胞肺癌患者的臨床樣本，包括腫瘤組織和癌旁正常組織。通過免疫組織化學(xué)染色（IHC）、蛋白質(zhì)免疫印跡法（Westernblot）和實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）等技術(shù)，檢測了Rsf-1在腫瘤組織和癌旁正常組織中的表達(dá)水平，并分析了其與患者紫杉醇化療敏感性和生存期的關(guān)系。在免疫組織化學(xué)染色實驗中，我們利用特異性抗體檢測Rsf-1蛋白在組織切片中的定位和表達(dá)強(qiáng)度。結(jié)果顯示，在腫瘤組織中，Rsf-1蛋白主要定位于細(xì)胞核，部分也可見于細(xì)胞質(zhì)，呈現(xiàn)出棕黃色或棕褐色的陽性染色。而在癌旁正常組織中，Rsf-1蛋白的陽性染色強(qiáng)度明顯較弱，多數(shù)細(xì)胞僅呈現(xiàn)出微弱的淡黃色或幾乎無染色。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例，我們采用半定量評分系統(tǒng)對Rsf-1的表達(dá)進(jìn)行評估。結(jié)果表明，[X]例非小細(xì)胞肺癌組織中，Rsf-1高表達(dá)的樣本有[X1]例，占比[X1/X×100%]；低表達(dá)的樣本有[X2]例，占比[X2/X×100%]。而在癌旁正常組織中，Rsf-1高表達(dá)的樣本僅有[X3]例，占比[X3/X×100%]，低表達(dá)樣本為[X4]例，占比[X4/X×100%]，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步運(yùn)用蛋白質(zhì)免疫印跡法，對腫瘤組織和癌旁正常組織中的Rsf-1蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析。提取組織總蛋白后，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）將蛋白分離，再轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，與特異性的Rsf-1抗體孵育，經(jīng)化學(xué)發(fā)光底物顯色后，利用凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值。以β-actin作為內(nèi)參，計算Rsf-1蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，腫瘤組織中Rsf-1蛋白的相對表達(dá)量為[X5±X6]，顯著高于癌旁正常組織的[X7±X8]（P<0.05），這與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果一致，進(jìn)一步證實了Rsf-1在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)。同時，我們采用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，檢測了Rsf-1在mRNA水平的表達(dá)情況。提取組織總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，以cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCt法計算Rsf-1mRNA的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示，腫瘤組織中Rsf-1mRNA的相對表達(dá)量為[X9±X10]，明顯高于癌旁正常組織的[X11±X12]（P<0.05），表明Rsf-1在非小細(xì)胞肺癌組織中的高表達(dá)不僅體現(xiàn)在蛋白水平，在mRNA水平也同樣顯著。在分析Rsf-1表達(dá)與紫杉醇化療敏感性的關(guān)系時，我們依據(jù)實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（RECIST）對患者的化療療效進(jìn)行評估，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進(jìn)展（PD）。將CR和PR定義為化療敏感，SD和PD定義為化療耐藥。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在Rsf-1高表達(dá)的患者中，化療敏感的患者有[X13]例，占比[X13/X1×100%]；化療耐藥的患者有[X14]例，占比[X14/X1×100%]。而在Rsf-1低表達(dá)的患者中，化療敏感的患者有[X15]例，占比[X15/X2×100%]；化療耐藥的患者有[X16]例，占比[X16/X2×100%]。經(jīng)卡方檢驗，Rsf-1表達(dá)水平與紫杉醇化療敏感性之間存在顯著相關(guān)性（P<0.05），Rsf-1高表達(dá)患者的化療耐藥率明顯高于低表達(dá)患者，提示Rsf-1高表達(dá)可能與非小細(xì)胞肺癌患者對紫杉醇化療耐藥相關(guān)。此外，我們還對患者的生存期進(jìn)行了隨訪和分析。通過Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，Rsf-1高表達(dá)患者的中位生存期為[X17]個月，明顯短于Rsf-1低表達(dá)患者的中位生存期[X18]個月（P<0.05）。多因素Cox回歸分析進(jìn)一步表明，Rsf-1表達(dá)水平是影響非小細(xì)胞肺癌患者生存期的獨立危險因素（HR=[X19]，95%CI：[X20-X21]，P<0.05），即Rsf-1高表達(dá)的患者預(yù)后較差，生存期較短。綜上所述，通過對臨床樣本的分析，我們發(fā)現(xiàn)Rsf-1在非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，且其表達(dá)水平與患者的紫杉醇化療敏感性和生存期密切相關(guān)。Rsf-1高表達(dá)可能是預(yù)測非小細(xì)胞肺癌患者對紫杉醇化療耐藥及預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物，為臨床治療方案的選擇和預(yù)后評估提供了重要的參考依據(jù)。4.2細(xì)胞實驗驗證4.2.1細(xì)胞系選擇與培養(yǎng)為深入探究Rsf-1對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性的影響，本研究選用了兩種具有代表性的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系，分別為NCI-H1299和NCI-H460。NCI-H1299細(xì)胞系來源于人類非小細(xì)胞肺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶，其具有TP53基因的純合部分缺失，不表達(dá)抑癌p53蛋白，這使得該細(xì)胞系具有較強(qiáng)的增殖能力和獨特的生物學(xué)特性，在肺癌研究中被廣泛應(yīng)用。NCI-H460細(xì)胞系則是從一位大細(xì)胞肺癌患者的胸水中建立的，其表達(dá)的p53mRNA水平與正常肺細(xì)胞相當(dāng)，細(xì)胞角蛋白和波形蛋白纖維染色陽性，神經(jīng)絲三聯(lián)體蛋白陰性，在研究肺癌的發(fā)病機(jī)制和治療靶點等方面具有重要價值。將上述兩種細(xì)胞系從液氮中取出，迅速置于37℃水浴鍋中解凍，待細(xì)胞完全解凍后，轉(zhuǎn)移至含有10mL完全培養(yǎng)基的離心管中。完全培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基，添加了10%的胎牛血清（FBS），為細(xì)胞提供豐富的營養(yǎng)物質(zhì)和生長因子，促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖；同時添加1%的青霉素-鏈霉素雙抗（P/S），有效防止細(xì)胞培養(yǎng)過程中細(xì)菌的污染，維持細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無菌狀態(tài)。以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心5分鐘，棄去上清液，加入適量的完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至T25培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察細(xì)胞的生長狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%-90%時，進(jìn)行傳代操作。傳代時，棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次，去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入1-2mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，當(dāng)細(xì)胞大部分變圓并脫落時，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞完全脫落，加入5mL以上含10%血清的完全培養(yǎng)基終止消化。輕輕吹打細(xì)胞，使其均勻分散，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中，以1000rpm的轉(zhuǎn)速離心8-10分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，按適當(dāng)比例將細(xì)胞懸液分到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。通過以上嚴(yán)格的細(xì)胞培養(yǎng)和傳代操作，確保細(xì)胞始終處于良好的生長狀態(tài)，為后續(xù)實驗提供穩(wěn)定可靠的細(xì)胞來源。4.2.2Rsf-1基因敲除或過表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)構(gòu)建Rsf-1基因敲除的NCI-H1299和NCI-H460細(xì)胞模型。首先，借助專業(yè)的在線設(shè)計工具，如CRISPRDesign、Benchling等，針對Rsf-1基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行sgRNA（singleguideRNA）的設(shè)計。在設(shè)計過程中，嚴(yán)格篩選特異性高的sgRNA序列，其長度一般設(shè)定為20bp，以確保能夠準(zhǔn)確靶向Rsf-1基因，同時盡可能降低脫靶效應(yīng)。設(shè)計完成后，通過化學(xué)合成的方法制備sgRNA。對于Cas9蛋白，選擇來源于化膿鏈球菌的SpCas9，它具有高效的DNA切割活性。將合成的sgRNA與Cas9蛋白按照一定比例混合，形成RNP（ribonucleoprotein）復(fù)合物。利用電轉(zhuǎn)染的方式將RNP復(fù)合物導(dǎo)入對數(shù)生長期的NCI-H1299和NCI-H460細(xì)胞中。電轉(zhuǎn)染時，將細(xì)胞重懸于電轉(zhuǎn)緩沖液中，與RNP復(fù)合物充分混合后，轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)杯中，設(shè)置合適的電轉(zhuǎn)參數(shù)，如電壓、脈沖時間等，使RNP復(fù)合物能夠高效地進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。電轉(zhuǎn)完成后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。為篩選出Rsf-1基因敲除的陽性克隆，采用有限稀釋法將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種于96孔板中，使每孔細(xì)胞數(shù)控制在1-2個。待細(xì)胞生長形成單克隆后，提取細(xì)胞基因組DNA，以其為模板，使用特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物設(shè)計根據(jù)Rsf-1基因敲除位點兩側(cè)的序列，確保能夠擴(kuò)增出包含敲除位點的DNA片段。對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序分析，與野生型Rsf-1基因序列進(jìn)行比對，鑒定出Rsf-1基因發(fā)生敲除的細(xì)胞克隆。構(gòu)建Rsf-1過表達(dá)細(xì)胞模型時，首先從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取Rsf-1基因的cDNA序列，通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得目的基因片段。將擴(kuò)增得到的Rsf-1基因片段與真核表達(dá)載體pCDNA3.1進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-Rsf-1。連接反應(yīng)采用T4DNA連接酶，在合適的反應(yīng)條件下進(jìn)行，使目的基因片段與載體能夠準(zhǔn)確連接。將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，通過氨芐青霉素抗性篩選陽性克隆。提取陽性克隆中的重組質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定和測序驗證，確保重組質(zhì)粒的正確性。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將驗證正確的重組表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-Rsf-1轉(zhuǎn)染至NCI-H1299和NCI-H460細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染時，按照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的說明書，將重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體混合，形成脂質(zhì)體-質(zhì)粒復(fù)合物，然后將其加入到含有細(xì)胞的完全培養(yǎng)基中，孵育一定時間，使復(fù)合物能夠進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。轉(zhuǎn)染48-72小時后，通過Westernblotting技術(shù)檢測Rsf-1蛋白的表達(dá)水平，篩選出Rsf-1過表達(dá)效果顯著的細(xì)胞株。通過以上方法成功構(gòu)建了Rsf-1基因敲除和過表達(dá)的細(xì)胞模型，為后續(xù)研究Rsf-1對非小細(xì)胞肺癌紫杉醇化療敏感性的影響奠定了基礎(chǔ)。4.2.3紫杉醇處理及細(xì)胞功能檢測將構(gòu)建好的Rsf-1基因敲除、過表達(dá)以及野生型的NCI-H1299和NCI-H460細(xì)胞，以每孔5×103個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，每孔加入200μL完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO?的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁并進(jìn)入對數(shù)生長期。培養(yǎng)24小時后，棄去原培養(yǎng)基，實驗組每孔加入含有不同濃度紫杉醇（0.1μM、1μM、10μM）的完全培養(yǎng)基200μL，對照組則加入不含紫杉醇的完全培養(yǎng)基200μL。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，以確保實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。將96孔板繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別在24小時、48小時和72小時后進(jìn)行細(xì)胞增殖能力檢測。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力。在相應(yīng)時間點，每孔加入10μLCCK-8試劑，輕輕混勻，避免產(chǎn)生氣泡。將96孔板繼續(xù)孵育1-4小時，使CCK-8試劑與細(xì)胞充分反應(yīng)。然后，用酶標(biāo)儀在450nm波長處測定各孔的吸光度（OD值）。根據(jù)OD值計算細(xì)胞增殖抑制率，計算公式為：細(xì)胞增殖抑制率（%）=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%。通過比較不同組細(xì)胞的增殖抑制率，分析Rsf-1對紫杉醇抑制細(xì)胞增殖作用的影響。在細(xì)胞凋亡檢測實驗中，將上述處理后的細(xì)胞培養(yǎng)48小時后，收集細(xì)胞。用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞2次，去除細(xì)胞表面殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。加入500μLBindingBuffer重懸細(xì)胞，使細(xì)胞均勻分散。依次加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，輕輕混勻，避光孵育15-30分鐘。孵育完成后，在1小時內(nèi)利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。