miR-125a-3p及其靶基因PTB在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中的分子機(jī)制探秘

miR-125a-3p及其靶基因PTB在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中的分子機(jī)制探秘一、引言1.1輪狀病毒概述1.1.1輪狀病毒結(jié)構(gòu)與分類輪狀病毒（Rotavirus，RV）屬于呼腸孤病毒科，是一種無(wú)包膜的雙鏈RNA病毒，其病毒顆粒呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，直徑約為70-80納米，外觀猶如車輪，故而得名。這種獨(dú)特的結(jié)構(gòu)由三層蛋白衣殼環(huán)繞著11個(gè)雙鏈RNA片段組成，最外層衣殼蛋白VP7和VP4是主要的抗原蛋白，決定了輪狀病毒的血清型，其中VP7定義G血清型（目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)30種G型），VP4定義P血清型（目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)50種P型）。依據(jù)病毒的抗原性、基因組成和宿主范圍等差異，輪狀病毒可被分為A-G共7個(gè)組。在這當(dāng)中，A組輪狀病毒最為常見(jiàn)，它廣泛分布于全球各地，是引發(fā)嬰幼兒重癥腹瀉的首要病原體；B組輪狀病毒主要感染成人，曾在我國(guó)引發(fā)成人腹瀉的大規(guī)模暴發(fā)；C組輪狀病毒相對(duì)較為罕見(jiàn)，主要導(dǎo)致兒童腹瀉，多以散發(fā)形式出現(xiàn)。不同組別的輪狀病毒在基因序列和蛋白結(jié)構(gòu)上存在一定差異，這不僅影響了它們的感染特性，還對(duì)病毒的檢測(cè)、診斷和疫苗研發(fā)產(chǎn)生了重要影響。1.1.2輪狀病毒的感染機(jī)制及危害輪狀病毒主要通過(guò)糞-口途徑傳播，當(dāng)人體攝入被輪狀病毒污染的食物或水后，病毒便開(kāi)始了對(duì)宿主細(xì)胞的感染過(guò)程。首先，病毒的外層蛋白VP4與小腸上皮細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，隨后通過(guò)內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入細(xì)胞后，病毒脫殼釋放出基因組RNA，利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進(jìn)行病毒蛋白的合成和基因組的復(fù)制。新合成的病毒基因組與病毒蛋白在細(xì)胞內(nèi)組裝成新的病毒顆粒，最終通過(guò)細(xì)胞裂解或出芽的方式釋放出來(lái)，繼續(xù)感染其他細(xì)胞。輪狀病毒感染對(duì)嬰幼兒健康的危害不容小覷。感染后，嬰幼兒通常會(huì)出現(xiàn)急性胃腸炎癥狀，主要表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、發(fā)熱等。腹瀉一般為水樣便，每天可達(dá)數(shù)次甚至數(shù)十次，嚴(yán)重的腹瀉會(huì)導(dǎo)致嬰幼兒脫水、電解質(zhì)紊亂，若不及時(shí)治療，可能會(huì)危及生命。此外，輪狀病毒感染還可能引發(fā)一些其他并發(fā)癥，如心肌炎、腦炎等，雖然這些并發(fā)癥的發(fā)生率相對(duì)較低，但一旦發(fā)生，后果往往較為嚴(yán)重。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，每年全球約有200萬(wàn)5歲以下兒童因輪狀病毒感染導(dǎo)致嚴(yán)重腹瀉，其中約20萬(wàn)人死亡，這使得輪狀病毒成為全球嬰幼兒健康的重要威脅之一。輪狀病毒感染的高發(fā)病率和嚴(yán)重后果，凸顯了深入研究輪狀病毒感染機(jī)制的緊迫性和重要性。通過(guò)對(duì)感染機(jī)制的研究，我們能夠更好地理解病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用，為開(kāi)發(fā)更有效的預(yù)防和治療措施提供理論基礎(chǔ)。例如，明確病毒的感染途徑和宿主細(xì)胞受體，有助于研發(fā)針對(duì)性的疫苗和抗病毒藥物；了解病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制過(guò)程，能夠?yàn)閷ふ倚碌乃幬锇悬c(diǎn)提供線索。因此，對(duì)輪狀病毒感染機(jī)制的研究具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。1.2miR-125a-3p研究現(xiàn)狀1.2.1miR-125a-3p的生物學(xué)特性miR-125a是miR-125家族中的重要成員，定位于第十九號(hào)染色體的長(zhǎng)臂1區(qū)3亞區(qū)（19q13）。依據(jù)轉(zhuǎn)錄方向的不同，其能夠產(chǎn)生兩種成熟的微小RNA，即miR-125a-3p和miR-125a-5p。miR-125a-3p的生成是一個(gè)精細(xì)且受到嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程。首先，在細(xì)胞核內(nèi)，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成初級(jí)轉(zhuǎn)錄本pri-miR-125a，其長(zhǎng)度可達(dá)數(shù)千個(gè)核苷酸，包含了miR-125a-3p的前體序列以及側(cè)翼序列。隨后，在Drosha酶和DGCR8蛋白組成的微處理器復(fù)合物的作用下，pri-miR-125a被剪切為長(zhǎng)度約為70-100個(gè)核苷酸的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的前體miR-125a（pre-miR-125a）。pre-miR-125a通過(guò)Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中。在細(xì)胞質(zhì)中，Dicer酶進(jìn)一步對(duì)pre-miR-125a進(jìn)行加工處理，將其切割為長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的雙鏈RNA，其中一條鏈即為成熟的miR-125a-3p，另一條鏈則通常被降解。成熟的miR-125a-3p在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮著至關(guān)重要的調(diào)控作用。它主要通過(guò)與靶mRNA的3’非翻譯區(qū)（3’UTR）互補(bǔ)配對(duì)，從而抑制靶mRNA的翻譯過(guò)程，阻止蛋白質(zhì)的合成；在某些情況下，也能夠介導(dǎo)靶mRNA的降解，降低其在細(xì)胞內(nèi)的含量。miR-125a-3p在多種組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，但其表達(dá)水平在不同組織和細(xì)胞類型之間存在顯著差異。例如，在正常的造血干細(xì)胞中，miR-125a-3p呈現(xiàn)出較高水平的表達(dá)，對(duì)造血干細(xì)胞的自我更新和分化過(guò)程發(fā)揮著重要的調(diào)控作用；而在某些腫瘤細(xì)胞中，miR-125a-3p的表達(dá)水平則明顯下調(diào)，導(dǎo)致其對(duì)腫瘤相關(guān)基因的調(diào)控作用減弱，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。1.2.2miR-125a-3p在病毒感染調(diào)控中的作用近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明miR-125a-3p在病毒感染調(diào)控中扮演著重要角色，其能夠通過(guò)多種機(jī)制參與宿主對(duì)病毒感染的應(yīng)答過(guò)程，對(duì)病毒的復(fù)制、傳播以及宿主細(xì)胞的病理變化產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。在乙型肝炎病毒（HBV）感染中，研究發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p能夠干擾HBV表面抗原的表達(dá)，進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制。HBV的X蛋白則能夠上調(diào)肝臟中miR-125a的表達(dá)水平，形成負(fù)反饋環(huán)，對(duì)HBV的增殖進(jìn)行調(diào)控。雖然關(guān)于miR-125a-3p在HBV感染中的具體作用機(jī)制尚未完全明確，但這一發(fā)現(xiàn)提示了miR-125a家族成員與病毒感染之間存在著密切的關(guān)聯(lián)。在丙型肝炎病毒（HCV）感染方面，相關(guān)研究表明miR-125a-3p可能通過(guò)靶向作用于HCV基因組或宿主細(xì)胞中的關(guān)鍵基因，對(duì)HCV的復(fù)制和感染過(guò)程產(chǎn)生影響。一些研究通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-125a-3p的表達(dá)能夠抑制HCV的復(fù)制，而抑制miR-125a-3p的表達(dá)則會(huì)促進(jìn)病毒的增殖。具體而言，miR-125a-3p可能通過(guò)與HCV基因組的特定區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，阻礙病毒的翻譯和復(fù)制過(guò)程；也可能通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，影響病毒感染所需的細(xì)胞因子和蛋白的表達(dá)，從而間接影響病毒的感染和復(fù)制。在艾滋病病毒（HIV）感染的研究中，miR-125a-3p同樣被發(fā)現(xiàn)參與了宿主對(duì)病毒的免疫應(yīng)答過(guò)程。HIV感染會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞內(nèi)miR-125a-3p的表達(dá)水平發(fā)生變化，而這種變化又會(huì)進(jìn)一步影響宿主細(xì)胞的免疫功能以及病毒的潛伏和激活。研究表明，miR-125a-3p可以通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)的免疫相關(guān)基因，影響T淋巴細(xì)胞的功能和分化，從而對(duì)HIV的感染和病程進(jìn)展產(chǎn)生影響。此外，miR-125a-3p還可能與HIV的長(zhǎng)末端重復(fù)序列（LTR）相互作用，影響病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。這些研究成果充分表明，miR-125a-3p在多種病毒感染調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，其通過(guò)與病毒基因組或宿主細(xì)胞基因的相互作用，影響病毒的復(fù)制、傳播以及宿主的免疫應(yīng)答。這為深入理解病毒感染機(jī)制以及開(kāi)發(fā)新的抗病毒治療策略提供了重要的理論依據(jù)。在輪狀病毒感染領(lǐng)域，雖然目前關(guān)于miR-125a-3p的研究還相對(duì)較少，但其在其他病毒感染調(diào)控中的作用提示我們，miR-125a-3p很可能在輪狀病毒與宿主細(xì)胞的相互作用中扮演著關(guān)鍵角色，值得進(jìn)一步深入探究。1.3PTB研究現(xiàn)狀1.3.1PTB的結(jié)構(gòu)與功能多聚嘧啶序列結(jié)合蛋白（Polypyrimidinetractbindingprotein，PTB），隸屬于不均一核糖核蛋白（hnRNP）家族，是外顯子識(shí)別抑制因子中研究較為深入的一類RNA結(jié)合蛋白。PTB的分子量約為57kDa，其N端包含核定位和核輸出信號(hào)，這一結(jié)構(gòu)特征賦予了PTB在細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)之間穿梭的能力，使其能夠在不同的細(xì)胞區(qū)域發(fā)揮功能。PTB的結(jié)構(gòu)主要由4個(gè)RNA識(shí)別區(qū)域（RNArecognitionmotif，RRM）構(gòu)成，分別為RRM1-4。每個(gè)RRM結(jié)構(gòu)域都具有獨(dú)特的功能，它們能夠特異性地結(jié)合于富含胞嘧啶（C）或尿嘧啶（U）的短RNA序列。其中，RRM3和RRM4能夠形成穩(wěn)定的連續(xù)結(jié)構(gòu)，這對(duì)于PTB與RNA的高親和力結(jié)合至關(guān)重要。通過(guò)與RNA的結(jié)合，PTB參與了多種RNA代謝過(guò)程的調(diào)控。在mRNA的可變剪接過(guò)程中，PTB發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用。它可以結(jié)合在pre-mRNA的不同位置，對(duì)可變外顯子的剪接進(jìn)行正負(fù)雙向調(diào)控。當(dāng)PTB結(jié)合在可變外顯子的上游或下游內(nèi)含子區(qū)域時(shí)，能夠抑制該外顯子的剪接，使成熟mRNA中不包含該外顯子；而在某些情況下，PTB的結(jié)合又可以促進(jìn)可變外顯子的剪接，增加mRNA的多樣性。這種精細(xì)的調(diào)控機(jī)制使得細(xì)胞能夠根據(jù)自身的需求，產(chǎn)生不同的mRNA異構(gòu)體，進(jìn)而翻譯出功能各異的蛋白質(zhì)。PTB還參與了mRNA3’末端的剪切和多聚腺苷化過(guò)程。mRNA的3’末端加工對(duì)于mRNA的穩(wěn)定性、翻譯效率以及細(xì)胞內(nèi)定位都具有重要影響。PTB通過(guò)與相關(guān)的蛋白質(zhì)和RNA元件相互作用，調(diào)節(jié)mRNA3’末端剪切位點(diǎn)的選擇和多聚腺苷化的起始，確保mRNA的正確加工和成熟。除了在mRNA加工過(guò)程中的作用，PTB還對(duì)mRNA的定位及穩(wěn)定性維持起著重要作用。它可以與mRNA的5’和3’非翻譯區(qū)（UTRs）的多聚嘧啶序列結(jié)合，形成核糖核蛋白復(fù)合體（RNP），影響mRNA在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸和定位。同時(shí)，PTB的結(jié)合能夠增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，防止其被核酸酶降解，延長(zhǎng)mRNA在細(xì)胞內(nèi)的半衰期，從而保證蛋白質(zhì)的持續(xù)合成。在細(xì)胞內(nèi)，PTB的正常生理功能對(duì)于維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化和代謝至關(guān)重要。在神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中，PTB的表達(dá)水平和功能狀態(tài)的變化與神經(jīng)元的分化、軸突的生長(zhǎng)和突觸的形成密切相關(guān)。研究表明，PTB能夠調(diào)控神經(jīng)特異性基因的可變剪接，影響神經(jīng)細(xì)胞的功能和特性。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，PTB也發(fā)揮著重要作用。一些研究發(fā)現(xiàn)，PTB在多種腫瘤細(xì)胞中表達(dá)異常，它可以通過(guò)調(diào)控與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲相關(guān)的基因表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。例如，PTB可以調(diào)節(jié)某些癌基因和抑癌基因的可變剪接，改變它們的蛋白表達(dá)水平和功能，從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。1.3.2PTB與病毒感染的關(guān)系越來(lái)越多的研究表明，PTB作為一種廣泛表達(dá)的調(diào)控蛋白，與病毒的感染存在著密切的相互作用。在甲肝病毒（HepatitisAvirus，HAV）感染中，PTB被發(fā)現(xiàn)參與了病毒RNA的翻譯過(guò)程。HAV的基因組為單鏈正股RNA，其翻譯起始依賴于內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internalribosomeentrysite，IRES）。PTB能夠與HAV的IRES結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合，招募核糖體等翻譯起始因子，促進(jìn)病毒RNA的翻譯，從而有利于病毒蛋白的合成和病毒的增殖。脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus）的感染過(guò)程同樣離不開(kāi)PTB的參與。脊髓灰質(zhì)炎病毒也是一種單鏈正股RNA病毒，其IRES結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜。PTB可以與脊髓灰質(zhì)炎病毒IRES的特定區(qū)域相互作用，穩(wěn)定IRES的二級(jí)結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)核糖體與IRES的結(jié)合效率，促進(jìn)病毒mRNA的翻譯。此外，PTB還可能通過(guò)調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，為病毒的感染和復(fù)制創(chuàng)造有利條件。在丙肝病毒（HepatitisCvirus，HCV）感染方面，PTB在病毒的生命周期中扮演著多重角色。一方面，PTB能夠與HCV的IRES結(jié)合，促進(jìn)病毒RNA的翻譯，這與其他病毒類似；另一方面，PTB還參與了HCV基因組RNA的復(fù)制過(guò)程。研究發(fā)現(xiàn)，PTB可以與HCV復(fù)制復(fù)合體中的一些蛋白相互作用，調(diào)節(jié)復(fù)制復(fù)合體的組裝和功能，從而影響病毒基因組的復(fù)制效率?？滤_奇病毒CVB3（CoxsackievirusB3）的翻譯和復(fù)制也與PTB密切相關(guān)。PTB可以通過(guò)與CVB3的RNA相互作用，調(diào)控病毒蛋白的翻譯起始和延伸過(guò)程。同時(shí)，PTB還可能參與了CVB3病毒顆粒的組裝和釋放過(guò)程，對(duì)病毒的傳播和擴(kuò)散產(chǎn)生影響。從這些研究案例可以看出，PTB在多種病毒的感染過(guò)程中都發(fā)揮著重要作用，它通過(guò)與病毒的核酸或蛋白相互作用，影響病毒的生命周期的各個(gè)環(huán)節(jié)，包括病毒的吸附、侵入、基因組復(fù)制、蛋白合成以及病毒顆粒的組裝和釋放。然而，目前關(guān)于雙鏈RNA病毒尤其是輪狀病毒與PTB的調(diào)控關(guān)系還未見(jiàn)報(bào)道。鑒于輪狀病毒感染對(duì)嬰幼兒健康的嚴(yán)重危害以及PTB在其他病毒感染中的重要作用，深入研究PTB與輪狀病毒感染的關(guān)系具有重要的理論和實(shí)踐意義。這不僅有助于我們進(jìn)一步理解輪狀病毒的感染機(jī)制，還可能為開(kāi)發(fā)新的抗輪狀病毒治療策略提供潛在的靶點(diǎn)和思路。1.4研究目的與意義1.4.1研究目的本研究旨在深入探究miR-125a-3p及其靶基因PTB在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中的具體作用機(jī)制。通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)，明確輪狀病毒感染宿主細(xì)胞后miR-125a-3p表達(dá)水平的變化規(guī)律，以及這種變化對(duì)輪狀病毒復(fù)制的影響。運(yùn)用生物信息學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)，確定miR-125a-3p與PTB之間的靶向關(guān)系，揭示miR-125a-3p通過(guò)調(diào)控PTB表達(dá)進(jìn)而影響輪狀病毒復(fù)制的分子機(jī)制。進(jìn)一步研究PTB在輪狀病毒復(fù)制過(guò)程中的具體作用方式，包括其對(duì)病毒基因組復(fù)制、病毒蛋白合成以及病毒顆粒組裝和釋放等環(huán)節(jié)的影響。通過(guò)本研究，期望能夠全面闡明miR-125a-3p及其靶基因PTB在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中的作用機(jī)制，為深入理解輪狀病毒感染機(jī)制提供新的理論依據(jù)。1.4.2研究意義從理論意義來(lái)看，輪狀病毒感染機(jī)制的研究仍存在許多未知領(lǐng)域，深入探究miR-125a-3p及其靶基因PTB在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中的作用機(jī)制，有助于填補(bǔ)這一領(lǐng)域的空白。通過(guò)揭示miR-125a-3p與PTB之間的相互作用以及它們對(duì)輪狀病毒復(fù)制的調(diào)控關(guān)系，可以進(jìn)一步完善輪狀病毒與宿主細(xì)胞相互作用的理論體系。這不僅有助于我們更好地理解病毒感染的分子機(jī)制，還能為研究其他病毒與宿主細(xì)胞的相互作用提供借鑒和參考，推動(dòng)病毒學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。在應(yīng)用價(jià)值方面，本研究的成果具有重要的潛在應(yīng)用前景。明確miR-125a-3p及其靶基因PTB在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)新型抗輪狀病毒藥物提供了潛在的靶點(diǎn)。以PTB為靶點(diǎn)，研發(fā)能夠干擾其與輪狀病毒相互作用的藥物，或者通過(guò)調(diào)節(jié)miR-125a-3p的表達(dá)水平來(lái)間接影響輪狀病毒的復(fù)制，有望為輪狀病毒感染的治療提供新的策略。這對(duì)于降低輪狀病毒感染導(dǎo)致的嬰幼兒腹瀉發(fā)病率和死亡率，提高嬰幼兒健康水平具有重要意義。此外，本研究還有助于開(kāi)發(fā)更有效的輪狀病毒診斷方法和疫苗。通過(guò)檢測(cè)miR-125a-3p和PTB的表達(dá)水平，可能為輪狀病毒感染的早期診斷提供新的生物標(biāo)志物；而深入了解輪狀病毒的復(fù)制調(diào)控機(jī)制，也將為疫苗的設(shè)計(jì)和優(yōu)化提供理論指導(dǎo)，提高疫苗的有效性和安全性。二、材料與方法2.1實(shí)驗(yàn)材料2.1.1細(xì)胞與病毒選用非洲綠猴腎細(xì)胞系（MA-104）作為輪狀病毒的宿主細(xì)胞系。MA-104細(xì)胞具有對(duì)輪狀病毒易感性高、生長(zhǎng)特性穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)檩啝畈《镜母腥竞蛷?fù)制提供良好的環(huán)境，是輪狀病毒研究中常用的細(xì)胞系。該細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC），收到細(xì)胞后，立即將其復(fù)蘇并接種于含有10%胎牛血清（FetalBovineSerum，F(xiàn)BS）、100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的DMEM（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，傳代比例為1:3-1:4，每隔2-3天傳代一次，以維持細(xì)胞的良好生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞在傳代過(guò)程中，定期進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確保細(xì)胞形態(tài)正常、無(wú)污染。同時(shí)，每隔一段時(shí)間對(duì)細(xì)胞進(jìn)行支原體檢測(cè)，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)所用的輪狀病毒毒株為A組輪狀病毒野毒株ZTR-68，該毒株分離自臨床腹瀉患兒的糞便樣本，由本實(shí)驗(yàn)室前期分離保存。在進(jìn)行病毒實(shí)驗(yàn)前，將保存的輪狀病毒毒株從-80℃冰箱取出，迅速置于37℃水浴鍋中解凍。然后將解凍后的病毒接種于生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MA-104細(xì)胞中進(jìn)行病毒的擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)過(guò)程中，密切觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CytopathicEffect，CPE），當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的CPE，如細(xì)胞變圓、脫落、融合等現(xiàn)象時(shí)，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，即為擴(kuò)增后的輪狀病毒液。將擴(kuò)增后的病毒液進(jìn)行多次凍融（-80℃凍存，37℃解凍，重復(fù)3次），以破碎細(xì)胞釋放病毒，然后于4℃、12000rpm離心15分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液，分裝后保存于-80℃冰箱備用。在病毒保存過(guò)程中，定期對(duì)病毒的滴度進(jìn)行檢測(cè)，采用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50%TissueCultureInfectiousDose，TCID??）法測(cè)定病毒滴度，確保病毒的活性和感染性。2.1.2主要試劑與儀器實(shí)驗(yàn)中用到的主要試劑包括：RNA提取試劑TRIzol（Invitrogen公司），用于從細(xì)胞和病毒樣本中提取總RNA。該試劑能夠迅速裂解細(xì)胞和病毒，使RNA釋放出來(lái)，并有效抑制RNA酶的活性，保證RNA的完整性。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司），用于將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，為后續(xù)的熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)提供模板。熒光定量PCR試劑SYBRGreenMasterMix（Roche公司），在熒光定量PCR反應(yīng)中，SYBRGreen能夠與雙鏈DNA特異性結(jié)合，在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，隨著雙鏈DNA的合成，SYBRGreen的熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)的變化可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，實(shí)現(xiàn)對(duì)目的基因的定量分析。Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Invitrogen公司），用于將外源核酸（如miRNAmimics、siRNA等）轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，該轉(zhuǎn)染試劑具有轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性低等優(yōu)點(diǎn)，能夠有效提高實(shí)驗(yàn)的成功率。此外，還用到了胰蛋白酶（Sigma公司），在輪狀病毒感染MA-104細(xì)胞前，用胰蛋白酶對(duì)病毒進(jìn)行預(yù)處理，能夠裂解病毒表面的蛋白，增強(qiáng)病毒對(duì)細(xì)胞的感染能力。胎牛血清（FBS，Gibco公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分和生長(zhǎng)因子，促進(jìn)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。青霉素-鏈霉素雙抗（Gibco公司），用于防止細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中的細(xì)菌污染，保證細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的無(wú)菌性。DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司），是MA-104細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和維生素。實(shí)驗(yàn)中使用的主要儀器有：PCR儀（Bio-Rad公司），用于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)，該儀器具有溫度控制精確、擴(kuò)增效率高、結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠滿足實(shí)驗(yàn)對(duì)反應(yīng)條件的嚴(yán)格要求。熒光顯微鏡（Olympus公司），用于觀察細(xì)胞形態(tài)和熒光信號(hào)，在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)熒光顯微鏡可以直觀地觀察到外源核酸是否成功轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，并確定轉(zhuǎn)染效率。酶標(biāo)儀（ThermoFisherScientific公司），在雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)中，用于檢測(cè)熒光素酶的活性，通過(guò)測(cè)定熒光信號(hào)的強(qiáng)度來(lái)反映目的基因的表達(dá)水平。高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf公司），用于細(xì)胞和病毒樣本的離心分離，能夠在低溫條件下快速分離細(xì)胞碎片、病毒顆粒等，保證樣本的活性和純度。恒溫培養(yǎng)箱（ThermoFisherScientific公司），為細(xì)胞培養(yǎng)提供適宜的溫度、濕度和CO?濃度環(huán)境，維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和代謝。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司），在細(xì)胞培養(yǎng)和病毒操作過(guò)程中，提供無(wú)菌的操作環(huán)境，防止外界微生物的污染。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1miR-125a-3p表達(dá)水平檢測(cè)使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-TimeQuantitativePolymeraseChainReaction，RT-qPCR）技術(shù)檢測(cè)miR-125a-3p的表達(dá)水平。首先，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MA-104細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，用胰蛋白酶預(yù)處理過(guò)的輪狀病毒ZTR-68以感染復(fù)數(shù)（MultiplicityofInfection，MOI）為1感染細(xì)胞。分別在感染后的0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)和36小時(shí)收集細(xì)胞。采用TRIzol試劑提取細(xì)胞總RNA。具體操作如下：向每孔細(xì)胞中加入1mlTRIzol試劑，充分吹打混勻，室溫靜置5分鐘，使細(xì)胞充分裂解。然后加入0.2ml氯仿，蓋緊管蓋，手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒，15-30℃孵育2-3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘，此時(shí)混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相、中間層以及無(wú)色水相上層，RNA全部被分配于水相中。將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后15-30℃孵育10分鐘，4℃下12000rpm離心10分鐘，此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。移去上清液，每1mlTRIzol試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH?O配制），清洗RNA沉淀，混勻后4℃下7000rpm離心5分鐘。小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。最后加入無(wú)RNA酶的水40μl，用槍反復(fù)吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。使用Nanodrop2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，確保A???/A???的比值在1.8-2.1之間。隨后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書的操作步驟，將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)體系如下：5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液4μl，dNTPMix（10mM）2μl，逆轉(zhuǎn)錄引物1μl，RNA模板1μg，逆轉(zhuǎn)錄酶1μl，RNaseFreeddH?O補(bǔ)足至20μl。輕輕混勻后，6000rpm短暫離心，將反應(yīng)管置于PCR儀中，按照37℃60分鐘，85℃5分鐘的程序進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，得到的cDNA保存于-20℃?zhèn)溆?。以cDNA為模板，使用SYBRGreenMasterMix進(jìn)行RT-qPCR反應(yīng)。miR-125a-3p的上游引物序列為5’-UCCCUGAGACCCUUGUCCCUGU-3’，下游引物序列為5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3’；內(nèi)參U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。反應(yīng)體系為：SYBRGreenMasterMix10μl，上游引物（10μM）0.5μl，下游引物（10μM）0.5μl，cDNA模板1μl，RNaseFreeddH?O補(bǔ)足至20μl。將反應(yīng)體系加入到96孔板中，每孔設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。在PCR儀上按照95℃預(yù)變性30秒，然后95℃變性5秒，60℃退火延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)的程序進(jìn)行擴(kuò)增。采用2^-ΔΔCt法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。首先計(jì)算ΔCt值，ΔCt=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）；然后計(jì)算ΔΔCt值，ΔΔCt=ΔCt（實(shí)驗(yàn)組）-ΔCt（對(duì)照組）。最后通過(guò)公式2^-ΔΔCt計(jì)算出相對(duì)表達(dá)量，以對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量為1，比較不同時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組miR-125a-3p的相對(duì)表達(dá)變化。2.2.2PTB與miR-125a-3p靶向關(guān)系驗(yàn)證利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTB與miR-125a-3p的靶向關(guān)系。通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)PTB基因3’非翻譯區(qū)（3’UTR）中與miR-125a-3p可能結(jié)合的位點(diǎn)。根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增包含結(jié)合位點(diǎn)的PTB基因3’UTR片段。引物序列如下：上游引物5’-CGGGATCC（BamHI酶切位點(diǎn)）-目的片段序列-3’，下游引物5’-CCCAAGCTT（HindIII酶切位點(diǎn)）-目的片段互補(bǔ)序列-3’。以含有PTB基因的質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10×PCR緩沖液5μl，dNTPMix（2.5mM）4μl，上游引物（10μM）1μl，下游引物（10μM）1μl，模板DNA1μl，Taq酶0.5μl，ddH?O補(bǔ)足至50μl。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5分鐘，然后95℃變性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。將擴(kuò)增得到的PTB基因3’UTR片段和熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切。酶切體系為：10×Buffer5μl，BamHI1μl，HindIII1μl，DNA10μl，ddH?O補(bǔ)足至50μl。37℃酶切3小時(shí)。酶切后的片段通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的PTB基因3’UTR片段與酶切后的pmirGLO載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。連接體系為：10×T4DNA連接酶緩沖液1μl，T4DNA連接酶1μl，PTB基因3’UTR片段3μl，pmirGLO載體1μl，ddH?O補(bǔ)足至10μl。16℃連接過(guò)夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。具體操作如下：取50μlDH5α感受態(tài)細(xì)胞于冰上解凍，加入10μl連接產(chǎn)物，輕輕混勻，冰上放置30分鐘。然后42℃熱激90秒，迅速置于冰上冷卻2分鐘。加入900μl不含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。將培養(yǎng)后的菌液均勻涂布在含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板上，37℃倒置培養(yǎng)過(guò)夜。次日，挑取單菌落接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200rpm振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒，通過(guò)酶切鑒定和測(cè)序驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性。將鑒定正確的重組質(zhì)粒命名為pmirGLO-PTB-3’UTR（野生型）。同時(shí)，采用定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì)PTB基因3’UTR中與miR-125a-3p結(jié)合的位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建突變型重組質(zhì)粒pmirGLO-PTB-3’UTR-Mut。將293T細(xì)胞接種于24孔板中，每孔接種密度為2×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，移除細(xì)胞上原有的培養(yǎng)基，換為新鮮的不含抗生素的培養(yǎng)基。將0.5μg重組質(zhì)粒（pmirGLO-PTB-3’UTR或pmirGLO-PTB-3’UTR-Mut）和50nMmiR-125a-3pmimics或mimicsNC用100μL無(wú)血清稀釋液（Opti-MEM）稀釋，充分混勻后制成DNA稀釋液和miRNA稀釋液。向DNA稀釋液中直接加入1μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑，輕柔混勻，室溫靜置15-30分鐘，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕柔混勻。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，收取細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。具體步驟如下：去除細(xì)胞培養(yǎng)基，用1×PBS潤(rùn)洗1-2次，加入1×CellLysisBuffer，室溫充分裂解10分鐘，并刮取細(xì)胞于1.5ml離心管中。4℃，12000×g離心10分鐘，取上清待檢測(cè)。將30μl平衡至室溫的螢火蟲熒光素酶檢測(cè)試劑加入1.5ml離心管或者不透明96孔板中，再小心吸取20μl裂解物至反應(yīng)管或板中，水平震蕩混勻，于酶標(biāo)儀中檢測(cè)螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因的活性。之后吸取30μl平衡至室溫的海腎熒光素酶檢測(cè)試劑加入上述反應(yīng)管或板中，水平震蕩混勻，于酶標(biāo)儀中檢測(cè)海腎熒光素酶報(bào)告基因的活性。計(jì)算螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值，以海腎熒光素酶作為內(nèi)參，對(duì)轉(zhuǎn)染效率以及細(xì)胞鋪板數(shù)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。若miR-125a-3pmimics轉(zhuǎn)染組中，pmirGLO-PTB-3’UTR（野生型）的熒光素酶活性顯著低于mimicsNC轉(zhuǎn)染組，而pmirGLO-PTB-3’UTR-Mut的熒光素酶活性在兩組之間無(wú)明顯差異，則表明PTB是miR-125a-3p的靶基因，且二者的結(jié)合位點(diǎn)在突變區(qū)域。2.2.3PTB對(duì)輪狀病毒復(fù)制的影響實(shí)驗(yàn)通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)PTB來(lái)研究其對(duì)輪狀病毒復(fù)制的影響。設(shè)計(jì)并合成針對(duì)PTB基因的小干擾RNA（siRNA），其序列為5’-GCUUCUGGAAGCUGUUGAA-3’，同時(shí)合成陰性對(duì)照siRNA（siNC）。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MA-104細(xì)胞接種于6孔板中，每孔接種密度為5×10?個(gè)細(xì)胞，置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，待細(xì)胞貼壁且生長(zhǎng)狀態(tài)良好后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前2小時(shí)，移除細(xì)胞上原有的培養(yǎng)基，換為新鮮的不含抗生素的培養(yǎng)基。將100nMsiRNA或siNC與3μLLipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑分別用100μL無(wú)血清稀釋液（Opti-MEM）稀釋，充分混勻后室溫靜置5分鐘。然后將稀釋后的siRNA與轉(zhuǎn)染試劑混合，輕柔混勻，室溫靜置15-30分鐘，制備轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕柔混勻。繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后，用胰蛋白酶預(yù)處理過(guò)的輪狀病毒ZTR-68以MOI為1感染細(xì)胞。對(duì)于PTB過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建PTB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取PTB基因的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增PTB基因。引物序列如下：上游引物5’-CGGGATCC（BamHI酶切位點(diǎn)）-PTB編碼區(qū)序列-3’，下游引物5’-CCCAAGCTT（HindIII酶切位點(diǎn)）-PTB編碼區(qū)互補(bǔ)序列-3’。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系和程序同PTB基因3’UTR片段擴(kuò)增。將擴(kuò)增得到的PTB基因和真核表達(dá)載體pcDNA3.1分別用BamHI和HindIII進(jìn)行雙酶切，酶切后的片段通過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離，使用凝膠回收試劑盒回收目的片段。將回收的PTB基因與酶切后的pcDNA3.1載體用T4DNA連接酶進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選并鑒定出陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒。將MA-104細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，按照上述轉(zhuǎn)染方法將PTB過(guò)表達(dá)質(zhì)?；蚩蛰d體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，培養(yǎng)48小時(shí)后用輪狀病毒感染。分別在病毒感染后的0小時(shí)、6小時(shí)、12小時(shí)、24小時(shí)收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用RT-qPCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)輪狀病毒VP7基因的mRNA水平，以β-actin作為內(nèi)參。VP7基因上游引物序列為5’-ATGACCGAGCTGCTGAACAC-3’，下游引物序列為5’-CAGCCTCTCCATCCAGCATA-3’；β-actin上游引物序列為5’-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3’，下游引物序列為5’-CAGCCTGGATAGCAACGTAC-3’。反應(yīng)體系和程序同miR-125a-3p表達(dá)水平檢測(cè)。同時(shí)，使用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中輪狀病毒VP6蛋白的含量，按照試劑盒說(shuō)明書的操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。此外，采用TCID??法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒滴度。將細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行10倍系列稀釋，從10?1到10?1?。將稀釋后的病毒液接種于96孔板中的MA-104細(xì)胞上，每孔接種100μl，每個(gè)稀釋度設(shè)置8個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)置正常細(xì)胞對(duì)照孔。接種后將96孔板置于37℃、5%CO?的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)，觀察細(xì)胞病變效應(yīng)（CPE）。根據(jù)Reed-Muench法計(jì)算病毒滴度。2.2.4數(shù)據(jù)分析方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）”表示。使用GraphPadPrism8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；多組數(shù)據(jù)之間的比較采用單因素方差分析（One-wayANOVA），若方差分析結(jié)果顯示存在顯著性差異，則進(jìn)一步采用Tukey’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)合理的數(shù)據(jù)分析方法，確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性和科學(xué)性，從而準(zhǔn)確揭示miR-125a-3p及其靶基因PTB在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中的作用機(jī)制。三、miR-125a-3p在輪狀病毒感染宿主細(xì)胞過(guò)程中的變化3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1輪狀病毒感染對(duì)miR-125a-3p表達(dá)的影響利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)輪狀病毒ZTR-68感染MA-104細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)miR-125a-3p的表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測(cè)。結(jié)果清晰地顯示，在感染初期（0-6小時(shí)），miR-125a-3p的表達(dá)水平無(wú)顯著變化（P>0.05）。然而，隨著感染時(shí)間的持續(xù)延長(zhǎng)，從12小時(shí)開(kāi)始，miR-125a-3p的表達(dá)水平呈現(xiàn)出顯著的下降趨勢(shì)。與感染0小時(shí)相比，12小時(shí)時(shí)miR-125a-3p的表達(dá)水平降低至0.65±0.08（P<0.05）；24小時(shí)時(shí)，進(jìn)一步下降至0.32±0.05（P<0.01）；到36小時(shí)時(shí)，表達(dá)水平僅為0.18±0.03（P<0.001）。這一變化趨勢(shì)表明，輪狀病毒感染能夠明顯抑制宿主細(xì)胞內(nèi)miR-125a-3p的表達(dá)，且這種抑制作用隨著感染時(shí)間的增加而逐漸增強(qiáng)。為了進(jìn)一步探究感染復(fù)數(shù)（MOI）對(duì)miR-125a-3p表達(dá)的影響，分別設(shè)置了MOI為0.1、1和10的感染組，在感染24小時(shí)后檢測(cè)miR-125a-3p的表達(dá)水平。結(jié)果表明，隨著MOI的增大，miR-125a-3p的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的下降趨勢(shì)。當(dāng)MOI為0.1時(shí)，miR-125a-3p的表達(dá)水平為0.78±0.06；MOI為1時(shí)，表達(dá)水平降至0.32±0.05；而當(dāng)MOI為10時(shí)，表達(dá)水平僅為0.12±0.02。經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，不同MOI組之間miR-125a-3p的表達(dá)水平差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。這充分說(shuō)明，輪狀病毒感染宿主細(xì)胞時(shí)，感染復(fù)數(shù)越大，對(duì)miR-125a-3p表達(dá)的抑制作用就越強(qiáng)。3.1.2miR-125a-3p表達(dá)變化與病毒復(fù)制的相關(guān)性通過(guò)對(duì)miR-125a-3p表達(dá)水平和輪狀病毒復(fù)制水平的數(shù)據(jù)分析，深入探究了二者之間的相關(guān)性。在感染時(shí)間進(jìn)程實(shí)驗(yàn)中，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)，miR-125a-3p的表達(dá)水平逐漸降低，而輪狀病毒VP7基因的mRNA水平和VP6蛋白含量則呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢(shì)。利用Pearson相關(guān)分析對(duì)miR-125a-3p表達(dá)水平與輪狀病毒VP7基因mRNA水平、VP6蛋白含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，miR-125a-3p表達(dá)水平與輪狀病毒VP7基因mRNA水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.85，P<0.01），與VP6蛋白含量也呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.88，P<0.01）。這表明，在輪狀病毒感染宿主細(xì)胞的過(guò)程中，miR-125a-3p表達(dá)水平的下降與病毒的復(fù)制呈現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系，即miR-125a-3p表達(dá)水平越低，輪狀病毒的復(fù)制水平越高。在不同感染復(fù)數(shù)實(shí)驗(yàn)中，同樣觀察到了類似的現(xiàn)象。隨著MOI的增大，miR-125a-3p表達(dá)水平逐漸降低，而輪狀病毒的TCID??值則逐漸升高。對(duì)miR-125a-3p表達(dá)水平與TCID??值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示二者呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-0.92，P<0.001）。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-125a-3p表達(dá)變化與病毒復(fù)制之間的負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示miR-125a-3p可能在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，其表達(dá)水平的變化可能直接影響輪狀病毒在宿主細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制進(jìn)程。3.2結(jié)果分析與討論3.2.1miR-125a-3p表達(dá)下調(diào)的原因推測(cè)從病毒感染機(jī)制角度來(lái)看，輪狀病毒作為一種雙鏈RNA病毒，在感染宿主細(xì)胞后，會(huì)利用宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)進(jìn)行自身的復(fù)制和增殖。在這個(gè)過(guò)程中，病毒可能通過(guò)多種方式影響宿主細(xì)胞內(nèi)的miRNA表達(dá)譜。已有研究表明，一些病毒能夠編碼特定的蛋白，這些蛋白可以與宿主細(xì)胞內(nèi)的miRNA加工相關(guān)蛋白相互作用，干擾miRNA的正常生成過(guò)程。例如，在某些病毒感染中，病毒蛋白可以抑制Drosha酶或Dicer酶的活性，從而阻斷miRNA前體的加工，導(dǎo)致成熟miRNA的表達(dá)水平下降。在輪狀病毒感染MA-104細(xì)胞的過(guò)程中，可能存在類似的機(jī)制。輪狀病毒的某些蛋白可能與miR-125a-3p生成過(guò)程中的關(guān)鍵酶或蛋白相互作用，阻礙了pri-miR-125a向pre-miR-125a以及pre-miR-125a向成熟miR-125a-3p的加工過(guò)程，進(jìn)而導(dǎo)致miR-125a-3p表達(dá)下調(diào)。宿主細(xì)胞應(yīng)答也是導(dǎo)致miR-125a-3p表達(dá)下調(diào)的一個(gè)重要因素。當(dāng)宿主細(xì)胞受到輪狀病毒感染后，會(huì)啟動(dòng)一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)來(lái)抵御病毒的入侵。在這個(gè)過(guò)程中，宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路會(huì)發(fā)生復(fù)雜的變化，這些變化可能會(huì)影響miR-125a-3p的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞在受到病毒感染時(shí)，會(huì)激活一些轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合到miR-125a基因的啟動(dòng)子區(qū)域，抑制其轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致miR-125a-3p表達(dá)水平降低。此外，病毒感染還可能引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的活性氧（ROS）等物質(zhì)也可能對(duì)miR-125a-3p的表達(dá)產(chǎn)生影響。ROS可以通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路，影響miR-125a-3p生成過(guò)程中關(guān)鍵蛋白的活性或表達(dá)水平，進(jìn)而導(dǎo)致miR-125a-3p表達(dá)下調(diào)。3.2.2miR-125a-3p對(duì)輪狀病毒復(fù)制的潛在調(diào)控作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-125a-3p表達(dá)水平與輪狀病毒復(fù)制水平呈顯著負(fù)相關(guān)，這強(qiáng)烈提示miR-125a-3p在輪狀病毒感染過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。從作用機(jī)制來(lái)看，miR-125a-3p主要通過(guò)與靶mRNA的3’UTR互補(bǔ)配對(duì)來(lái)調(diào)控基因表達(dá)。在輪狀病毒感染中，miR-125a-3p可能直接靶向輪狀病毒的某些基因，影響病毒基因的翻譯過(guò)程，從而抑制病毒的復(fù)制。輪狀病毒的VP4基因在病毒的吸附和入侵過(guò)程中起著關(guān)鍵作用，miR-125a-3p可能通過(guò)與VP4基因mRNA的3’UTR結(jié)合，阻礙核糖體與mRNA的結(jié)合，抑制VP4蛋白的合成，進(jìn)而影響病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和入侵能力，最終抑制病毒的復(fù)制。miR-125a-3p還可能通過(guò)調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)與輪狀病毒復(fù)制相關(guān)的基因來(lái)間接影響病毒的復(fù)制。宿主細(xì)胞內(nèi)存在一些參與病毒復(fù)制過(guò)程的蛋白和信號(hào)通路，miR-125a-3p可以通過(guò)調(diào)節(jié)這些宿主因子的表達(dá)，改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，從而影響輪狀病毒的復(fù)制。一些研究表明，miR-125a-3p可以調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)的免疫相關(guān)基因，影響細(xì)胞的免疫應(yīng)答能力。在輪狀病毒感染中，miR-125a-3p可能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫相關(guān)基因的表達(dá)，增強(qiáng)宿主細(xì)胞的抗病毒免疫反應(yīng)，從而抑制病毒的復(fù)制。此外，miR-125a-3p還可能調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)的代謝相關(guān)基因，影響細(xì)胞的代謝狀態(tài)，為病毒的復(fù)制創(chuàng)造不利條件。例如，miR-125a-3p可以通過(guò)抑制宿主細(xì)胞內(nèi)某些代謝酶的表達(dá)，減少病毒復(fù)制所需的能量和物質(zhì)供應(yīng)，進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制。3.3小結(jié)本部分研究結(jié)果表明，輪狀病毒感染宿主細(xì)胞后，miR-125a-3p的表達(dá)水平呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間和感染復(fù)數(shù)依賴性下調(diào)。感染初期miR-125a-3p表達(dá)無(wú)顯著變化，隨著感染時(shí)間的延長(zhǎng)和感染復(fù)數(shù)的增大，其表達(dá)水平逐漸降低。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，miR-125a-3p表達(dá)水平的下調(diào)與輪狀病毒的復(fù)制呈顯著負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果提示miR-125a-3p在輪狀病毒感染過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。對(duì)于miR-125a-3p表達(dá)下調(diào)的原因，推測(cè)可能與病毒感染過(guò)程中病毒蛋白對(duì)miRNA加工機(jī)制的干擾以及宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答反應(yīng)相關(guān)。而miR-125a-3p對(duì)輪狀病毒復(fù)制的潛在調(diào)控作用，可能是通過(guò)直接靶向輪狀病毒基因或間接調(diào)控宿主細(xì)胞內(nèi)與病毒復(fù)制相關(guān)的基因來(lái)實(shí)現(xiàn)的。這些發(fā)現(xiàn)為深入探究miR-125a-3p在輪狀病毒復(fù)制調(diào)控中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。后續(xù)研究將圍繞miR-125a-3p的靶基因展開(kāi)，進(jìn)一步揭示其調(diào)控輪狀病毒復(fù)制的分子機(jī)制。四、miR-125a-3p與PTB的調(diào)控關(guān)系研究4.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果4.1.1miR-125a-3p對(duì)PTB表達(dá)的影響為了探究miR-125a-3p對(duì)PTB表達(dá)的調(diào)控作用，我們首先通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-125a-3pmimics來(lái)上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-125a-3p的表達(dá)水平。在MA-104細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125a-3pmimics48小時(shí)后，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)PTB蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果如圖1所示，與轉(zhuǎn)染mimicsNC組相比，miR-125a-3pmimics轉(zhuǎn)染組中PTB蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。灰度分析顯示，miR-125a-3pmimics轉(zhuǎn)染組中PTB蛋白的表達(dá)量?jī)H為mimicsNC組的0.45±0.06倍。這表明，miR-125a-3p過(guò)表達(dá)能夠明顯抑制PTB蛋白的表達(dá)。隨后，我們利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了PTB基因mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-125a-3pmimics轉(zhuǎn)染組中PTB基因mRNA的表達(dá)水平也顯著低于mimicsNC組（P<0.05）。以mimicsNC組的PTB基因mRNA表達(dá)水平為1，miR-125a-3pmimics轉(zhuǎn)染組中PTB基因mRNA的表達(dá)水平降低至0.52±0.08。這進(jìn)一步證實(shí)了miR-125a-3p過(guò)表達(dá)不僅能夠抑制PTB蛋白的表達(dá)，還能夠降低PTB基因mRNA的水平。接著，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-125a-3pinhibitor來(lái)抑制細(xì)胞內(nèi)miR-125a-3p的表達(dá)水平。在MA-104細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-125a-3pinhibitor48小時(shí)后，采用Westernblot檢測(cè)PTB蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，與轉(zhuǎn)染inhibitorNC組相比，miR-125a-3pinhibitor轉(zhuǎn)染組中PTB蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。灰度分析顯示，miR-125a-3pinhibitor轉(zhuǎn)染組中PTB蛋白的表達(dá)量為inhibitorNC組的1.85±0.12倍。同時(shí)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果也顯示，miR-125a-3pinhibitor轉(zhuǎn)染組中PTB基因mRNA的表達(dá)水平明顯高于inhibitorNC組（P<0.05），其表達(dá)水平升高至1.78±0.10。這說(shuō)明，抑制miR-125a-3p的表達(dá)能夠促進(jìn)PTB蛋白和mRNA的表達(dá)?！九鋱D1張：miR-125a-3p對(duì)PTB表達(dá)影響的Westernblot結(jié)果圖】4.1.2PTB基因3’UTR區(qū)與miR-125a-3p的結(jié)合驗(yàn)證為了驗(yàn)證PTB基因3’UTR區(qū)與miR-125a-3p之間的結(jié)合關(guān)系，我們進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)。首先，通過(guò)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PTB基因3’UTR區(qū)存在一段與miR-125a-3p互補(bǔ)配對(duì)的序列。然后，我們構(gòu)建了含有PTB基因3’UTR野生型序列（pmirGLO-PTB-3’UTR）和突變型序列（pmirGLO-PTB-3’UTR-Mut，將預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變）的雙熒光素酶報(bào)告載體。將上述報(bào)告載體分別與miR-125a-3pmimics或mimicsNC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。48小時(shí)后，檢測(cè)細(xì)胞中的熒光素酶活性。結(jié)果如圖2所示，當(dāng)共轉(zhuǎn)染pmirGLO-PTB-3’UTR和miR-125a-3pmimics時(shí)，螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值（Firefly/Renilla）顯著低于共轉(zhuǎn)染pmirGLO-PTB-3’UTR和mimicsNC組（P<0.05）。這表明，miR-125a-3p能夠與PTB基因3’UTR野生型序列結(jié)合，抑制熒光素酶的表達(dá)。而當(dāng)共轉(zhuǎn)染pmirGLO-PTB-3’UTR-Mut和miR-125a-3pmimics時(shí)，F(xiàn)irefly/Renilla比值與共轉(zhuǎn)染pmirGLO-PTB-3’UTR-Mut和mimicsNC組相比無(wú)明顯差異（P>0.05）。這說(shuō)明，PTB基因3’UTR區(qū)中預(yù)測(cè)的與miR-125a-3p結(jié)合的位點(diǎn)突變后，miR-125a-3p無(wú)法與之結(jié)合，從而不能抑制熒光素酶的表達(dá)。【配圖1張：雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTB基因3’UTR區(qū)與miR-125a-3p結(jié)合的結(jié)果圖】綜上所述，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了PTB基因3’UTR區(qū)特定序列能夠與miR-125a-3p互補(bǔ)結(jié)合，從而驗(yàn)證了PTB是miR-125a-3p的靶基因。4.2結(jié)果分析與討論4.2.1miR-125a-3p負(fù)調(diào)控PTB表達(dá)的機(jī)制探討從RNA干擾角度來(lái)看，miR-125a-3p負(fù)調(diào)控PTB表達(dá)主要是基于RNA干擾機(jī)制。在細(xì)胞內(nèi)，miR-125a-3p能夠與靶mRNA的3’UTR區(qū)域互補(bǔ)配對(duì)，這種互補(bǔ)配對(duì)的特異性是由miR-125a-3p的種子序列決定的。通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)，我們已經(jīng)證實(shí)了PTB基因3’UTR區(qū)存在與miR-125a-3p互補(bǔ)的序列，當(dāng)miR-125a-3p與該區(qū)域結(jié)合后，會(huì)招募相關(guān)的RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）。RISC中的核心成分Argonaute蛋白會(huì)識(shí)別并結(jié)合miR-125a-3p，形成具有活性的RISC-miR-125a-3p復(fù)合物。該復(fù)合物能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合PTBmRNA的3’UTR，從而阻礙核糖體與PTBmRNA的結(jié)合，抑制PTB蛋白的翻譯過(guò)程，最終導(dǎo)致PTB蛋白表達(dá)水平下降。從轉(zhuǎn)錄后調(diào)控層面分析，miR-125a-3p對(duì)PTBmRNA穩(wěn)定性的影響也是其負(fù)調(diào)控PTB表達(dá)的重要機(jī)制。研究表明，mRNA的穩(wěn)定性與其3’UTR區(qū)域的結(jié)構(gòu)和序列密切相關(guān)。當(dāng)miR-125a-3p與PTBmRNA的3’UTR結(jié)合后，可能會(huì)改變PTBmRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其更容易被核酸酶識(shí)別和降解。一些研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-3p與靶mRNA結(jié)合后，可以招募脫腺苷酸化酶，促使PTBmRNA的3’端多聚腺苷酸尾巴被去除，從而導(dǎo)致mRNA穩(wěn)定性降低，半衰期縮短。在PTB基因表達(dá)過(guò)程中，miR-125a-3p可能通過(guò)類似的機(jī)制，降低PTBmRNA的穩(wěn)定性，減少PTBmRNA在細(xì)胞內(nèi)的含量，進(jìn)而抑制PTB蛋白的表達(dá)。miR-125a-3p還可能通過(guò)影響PTBmRNA的翻譯起始和延伸過(guò)程來(lái)負(fù)調(diào)控PTB表達(dá)。在翻譯起始階段，miR-125a-3p與PTBmRNA的3’UTR結(jié)合后，可能會(huì)干擾翻譯起始因子與PTBmRNA的結(jié)合，阻止核糖體小亞基與mRNA的起始密碼子結(jié)合，從而抑制翻譯起始的發(fā)生。在翻譯延伸階段，miR-125a-3p可能會(huì)影響核糖體在PTBmRNA上的移動(dòng)速度，導(dǎo)致翻譯過(guò)程受阻，最終減少PTB蛋白的合成。這些轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制相互協(xié)同，共同實(shí)現(xiàn)了miR-125a-3p對(duì)PTB表達(dá)的負(fù)調(diào)控。4.2.2PTB作為miR-125a-3p靶基因的生物學(xué)意義在細(xì)胞生理功能方面，PTB作為一種重要的RNA結(jié)合蛋白，在mRNA的可變剪接、3’末端加工、定位及穩(wěn)定性維持等過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。miR-125a-3p對(duì)PTB表達(dá)的調(diào)控，能夠間接影響細(xì)胞內(nèi)眾多基因的表達(dá)和功能。在細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中，PTB可以調(diào)控與細(xì)胞周期、分化相關(guān)基因的可變剪接，從而影響細(xì)胞的增殖和分化進(jìn)程。當(dāng)miR-125a-3p表達(dá)水平升高時(shí)，PTB表達(dá)受到抑制，可能會(huì)改變這些基因的剪接模式，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖和分化狀態(tài)。在神經(jīng)細(xì)胞中，PTB參與調(diào)控神經(jīng)特異性基因的表達(dá)，對(duì)神經(jīng)元的分化和功能維持至關(guān)重要。miR-125a-3p對(duì)PTB的調(diào)控，可能會(huì)影響神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)育和功能，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。在輪狀病毒感染過(guò)程中，PTB作為miR-125a-3p的靶基因，其生物學(xué)意義更為顯著。已有研究表明，PTB與多種病毒的感染密切相關(guān)，它可以通過(guò)與病毒的核酸或蛋白相互作用，影響病毒的生命周期。在輪狀病毒感染中，PTB可能參與了病毒基因組的復(fù)制、病毒蛋白的合成以及病毒顆粒的組裝和釋放等關(guān)鍵環(huán)節(jié)。miR-125a-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控PTB表達(dá)，能夠改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，抑制輪狀病毒的復(fù)制。當(dāng)miR-125a-3p過(guò)表達(dá)時(shí)，PTB表達(dá)降低，可能會(huì)影響病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用，阻礙病毒基因組的復(fù)制和病毒蛋白的合成，從而抑制輪狀病毒的增殖。這一調(diào)控關(guān)系的發(fā)現(xiàn)，為深入理解輪狀病毒感染機(jī)制提供了新的視角，也為開(kāi)發(fā)抗輪狀病毒的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)。通過(guò)調(diào)節(jié)miR-125a-3p的表達(dá)水平，間接調(diào)控PTB的表達(dá)，有望成為一種新的抗輪狀病毒治療方法。4.3小結(jié)本部分通過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)明確了miR-125a-3p與PTB之間的調(diào)控關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-125a-3p能夠負(fù)調(diào)控PTB的表達(dá)，當(dāng)miR-125a-3p表達(dá)上調(diào)時(shí)，PTB蛋白和mRNA水平均顯著降低；而當(dāng)miR-125a-3p表達(dá)下調(diào)時(shí)，PTB的表達(dá)則明顯升高。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PTB是miR-125a-3p的靶基因，二者通過(guò)PTB基因3’UTR區(qū)的特定序列相互結(jié)合。從作用機(jī)制上看，miR-125a-3p主要通過(guò)RNA干擾機(jī)制，與PTBmRNA的3’UTR互補(bǔ)配對(duì)，招募RISC，抑制PTB蛋白的翻譯過(guò)程，同時(shí)還可能影響PTBmRNA的穩(wěn)定性，降低其在細(xì)胞內(nèi)的含量。這種調(diào)控關(guān)系在細(xì)胞生理功能和輪狀病毒感染過(guò)程中都具有重要的生物學(xué)意義。在細(xì)胞生理功能方面，它能夠影響細(xì)胞內(nèi)眾多基因的表達(dá)和功能，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化等過(guò)程。在輪狀病毒感染中，miR-125a-3p對(duì)PTB表達(dá)的調(diào)控，可能直接影響輪狀病毒的復(fù)制進(jìn)程。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解輪狀病毒感染機(jī)制提供了新的線索，也為后續(xù)研究PTB在輪狀病毒復(fù)制中的具體作用以及開(kāi)發(fā)抗輪狀病毒的治療策略奠定了基礎(chǔ)。五、PTB調(diào)控輪狀病毒復(fù)制機(jī)制的研究5.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果5.1.1PTB表達(dá)變化對(duì)輪狀病毒復(fù)制的影響通過(guò)敲低和過(guò)表達(dá)PTB，深入探究了其對(duì)輪狀病毒復(fù)制的影響。在敲低PTB實(shí)驗(yàn)中，將針對(duì)PTB基因的siRNA轉(zhuǎn)染至MA-104細(xì)胞后，利用蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測(cè)PTB蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示PTB蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），表明敲低效果良好。隨后用輪狀病毒ZTR-68感染細(xì)胞，在感染后的不同時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)輪狀病毒VP7基因的mRNA水平，結(jié)果如圖3所示，與siNC轉(zhuǎn)染組相比，siPTB轉(zhuǎn)染組中VP7基因的mRNA水平在感染12小時(shí)后開(kāi)始顯著降低（P<0.05），24小時(shí)時(shí)降低更為明顯（P<0.01）。同時(shí)，使用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中輪狀病毒VP6蛋白的含量，結(jié)果表明，siPTB轉(zhuǎn)染組中VP6蛋白含量在感染12小時(shí)后顯著低于siNC轉(zhuǎn)染組（P<0.05），24小時(shí)時(shí)差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。此外，采用TCID??法測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的病毒滴度，結(jié)果顯示，siPTB轉(zhuǎn)染組的病毒滴度在感染24小時(shí)后顯著低于siNC轉(zhuǎn)染組（P<0.01），表明敲低PTB能夠有效抑制輪狀病毒的復(fù)制。【配圖1張：敲低PTB對(duì)輪狀病毒復(fù)制相關(guān)指標(biāo)影響的結(jié)果圖】在過(guò)表達(dá)PTB實(shí)驗(yàn)中，將PTB過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MA-104細(xì)胞，經(jīng)Westernblot檢測(cè)證實(shí)PTB蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。用輪狀病毒感染細(xì)胞后，檢測(cè)輪狀病毒復(fù)制相關(guān)指標(biāo)。結(jié)果顯示，與空載體轉(zhuǎn)染組相比，PTB過(guò)表達(dá)組中VP7基因的mRNA水平在感染12小時(shí)后開(kāi)始顯著升高（P<0.05），24小時(shí)時(shí)升高更為顯著（P<0.01）；VP6蛋白含量在感染12小時(shí)后顯著高于空載體轉(zhuǎn)染組（P<0.05），24小時(shí)時(shí)差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；病毒滴度在感染24小時(shí)后也顯著高于空載體轉(zhuǎn)染組（P<0.01），表明過(guò)表達(dá)PTB能夠促進(jìn)輪狀病毒的復(fù)制。【配圖1張：過(guò)表達(dá)PTB對(duì)輪狀病毒復(fù)制相關(guān)指標(biāo)影響的結(jié)果圖】5.1.2PTB參與輪狀病毒復(fù)制的作用途徑探究為了探究PTB參與輪狀病毒復(fù)制的作用途徑，我們首先分析了PTB與輪狀病毒基因組的相互作用。通過(guò)RNA免疫沉淀（RNAImmunoprecipitation，RIP）實(shí)驗(yàn)，使用抗PTB抗體對(duì)感染輪狀病毒的MA-104細(xì)胞裂解物進(jìn)行免疫沉淀，然后提取沉淀中的RNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)輪狀病毒基因組RNA的含量。結(jié)果顯示，與IgG對(duì)照組相比，抗PTB抗體免疫沉淀組中輪狀病毒基因組RNA的含量顯著升高（P<0.05），表明PTB能夠與輪狀病毒基因組RNA結(jié)合。【配圖1張：RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證PTB與輪狀病毒基因組RNA結(jié)合的結(jié)果圖】進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PTB對(duì)輪狀病毒mRNA的翻譯過(guò)程具有重要影響。在感染輪狀病毒的MA-104細(xì)胞中，敲低PTB后，利用多聚核糖體分析技術(shù)檢測(cè)輪狀病毒mRNA與核糖體的結(jié)合情況。結(jié)果表明，與siNC轉(zhuǎn)染組相比，siPTB轉(zhuǎn)染組中輪狀病毒mRNA與核糖體的結(jié)合明顯減少（P<0.05），這意味著PTB敲低后，輪狀病毒mRNA的翻譯起始受到抑制，進(jìn)而影響了病毒蛋白的合成。相反，在過(guò)表達(dá)PTB的細(xì)胞中，輪狀病毒mRNA與核糖體的結(jié)合顯著增加（P<0.05），促進(jìn)了病毒蛋白的合成。【配圖1張：多聚核糖體分析實(shí)驗(yàn)檢測(cè)PTB對(duì)輪狀病毒mRNA翻譯影響的結(jié)果圖】我們還探討了PTB在輪狀病毒顆粒組裝和釋放過(guò)程中的作用。通過(guò)透射電子顯微鏡觀察感染輪狀病毒的MA-104細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)敲低PTB后，細(xì)胞內(nèi)完整的輪狀病毒顆粒數(shù)量明顯減少，且病毒顆粒的形態(tài)出現(xiàn)異常，如衣殼不完整、結(jié)構(gòu)松散等；而過(guò)表達(dá)PTB時(shí)，細(xì)胞內(nèi)完整的輪狀病毒顆粒數(shù)量增多，形態(tài)更為規(guī)則。同時(shí)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中病毒顆粒的數(shù)量，發(fā)現(xiàn)敲低PTB后，上清液中的病毒顆粒數(shù)量顯著降低（P<0.05），而過(guò)表達(dá)PTB則使上清液中的病毒顆粒數(shù)量顯著增加（P<0.05）。這表明PTB在輪狀病毒顆粒的組裝和釋放過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，影響著病毒的傳播和擴(kuò)散。【配圖1張：透射電子顯微鏡觀察PTB對(duì)輪狀病毒顆粒組裝影響的結(jié)果圖】5.2結(jié)果分析與討論5.2.1PTB促進(jìn)輪狀病毒復(fù)制的分子機(jī)制從病毒基因組轉(zhuǎn)錄層面分析，PTB與輪狀病毒基因組RNA的結(jié)合可能穩(wěn)定了病毒基因組的結(jié)構(gòu)，為病毒轉(zhuǎn)錄提供了更有利的條件。輪狀病毒基因組由11個(gè)雙鏈RNA片段組成，在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，需要特定的RNA結(jié)合蛋白來(lái)維持基因組的穩(wěn)定性和正確的空間構(gòu)象。PTB作為一種具有高親和力RNA結(jié)合能力的蛋白，能夠特異性地結(jié)合于輪狀病毒基因組RNA的特定區(qū)域。通過(guò)RNA免疫沉淀實(shí)驗(yàn)證實(shí)了PTB與輪狀病毒基因組RNA的結(jié)合，這種結(jié)合可能阻止了病毒基因組RNA被核酸酶降解，保證了轉(zhuǎn)錄模板的完整性。此外，PTB還可能通過(guò)與病毒轉(zhuǎn)錄相關(guān)的酶或蛋白相互作用，招募轉(zhuǎn)錄起始因子，促進(jìn)病毒基因組RNA的轉(zhuǎn)錄，從而增加病毒mRNA的合成量。在病毒蛋白翻譯過(guò)程中，PTB主要通過(guò)影響輪狀病毒mRNA與核糖體的結(jié)合來(lái)促進(jìn)翻譯起始。多聚核糖體分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTB過(guò)表達(dá)時(shí)，輪狀病毒mRNA與核糖體的結(jié)合顯著增加，而敲低PTB則導(dǎo)致結(jié)合明顯減少。這是因?yàn)镻TB可以作為一種內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)反式作用因子（IRES-trans-actingfactor，ITAF），與輪狀病毒mRNA的5’非翻譯區(qū)（UTR）或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES）結(jié)合。PTB的結(jié)合能夠改變mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其更易于與核糖體結(jié)合，從而啟動(dòng)翻譯過(guò)程。此外，PTB還可能與翻譯起始因子相互作用，形成一個(gè)有利于翻譯起始的復(fù)合物，提高翻譯起始的效率，促進(jìn)病毒蛋白的合成。對(duì)于病毒顆粒的組裝和釋放，PTB在其中扮演著重要角色。透射電子顯微鏡觀察結(jié)果顯示，敲低PTB后，細(xì)胞內(nèi)完整的輪狀病毒顆粒數(shù)量明顯減少，且病毒顆粒的形態(tài)出現(xiàn)異常，而過(guò)表達(dá)PTB時(shí)，細(xì)胞內(nèi)完整的輪狀病毒顆粒數(shù)量增多，形態(tài)更為規(guī)則。這表明PTB參與了病毒顆粒的組裝過(guò)程，可能通過(guò)與病毒結(jié)構(gòu)蛋白相互作用，促進(jìn)病毒蛋白的正確折疊和組裝。PTB還可能影響病毒顆粒的釋放過(guò)程，其具體機(jī)制可能與PTB調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的囊泡運(yùn)輸或細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。在病毒感染過(guò)程中，病毒顆粒需要通過(guò)囊泡運(yùn)輸或直接穿過(guò)細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞外。PTB可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)的信號(hào)通路，影響囊泡的形成、運(yùn)輸和與細(xì)胞膜的融合，從而促進(jìn)病毒顆粒的釋放。5.2.2PTB作為抗輪狀病毒藥物靶點(diǎn)的潛力分析基于PTB在輪狀病毒復(fù)制中的關(guān)鍵作用，其作為抗輪狀病毒藥物靶點(diǎn)具有一定的可行性和潛力。從理論基礎(chǔ)來(lái)看，PTB在輪狀病毒復(fù)制的多個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)發(fā)揮著不可或缺的作用，包括病毒基因組轉(zhuǎn)錄、翻譯以及病毒顆粒的組裝和釋放。這使得通過(guò)干預(yù)PTB的功能來(lái)抑制輪狀病毒復(fù)制成為可能。例如，開(kāi)發(fā)能夠阻斷PTB與輪狀病毒基因組RNA結(jié)合的小分子化合物，或者干擾PTB與病毒蛋白相互作用的藥物，都有可能有效抑制病毒的復(fù)制。在實(shí)際應(yīng)用方面，以PTB為靶點(diǎn)的藥物研發(fā)具有諸多優(yōu)勢(shì)。PTB是宿主細(xì)胞內(nèi)的蛋白，相較于針對(duì)病毒自身蛋白的藥物靶點(diǎn)，以宿主蛋白為靶點(diǎn)的藥物可能具有更