高三生物二輪復(fù)習(xí)課件微專題限制酶的選擇

限制酶的選擇基因表達載體的構(gòu)建之2025年“湘道杯”大賽道縣第二中學(xué)

周蓉3.2基因工程的基本操作程序二輪復(fù)習(xí)微專題載體（質(zhì)粒）DNA分子（含目的基因）限制酶處理帶有黏性末端或平末端的切口帶有相同黏性末端或平末端的目的基因片段DNA連接酶重組DNA分子（重組質(zhì)粒）同同種知識點回顧：基因表達載體的構(gòu)建過程限制酶的選擇原則（一）1、不破壞

原則2、質(zhì)粒的酶切位點位于

之間3、不能破壞

。4、確保出現(xiàn)相同

原則目的基因啟動子和終止子標(biāo)記基因、啟動子、終止子、復(fù)制原點黏性末端僅用一種限制酶切割目的基因和載體的缺點：缺點：1、目的基因與目的基因、質(zhì)粒與質(zhì)粒自身環(huán)化2、目的基因與質(zhì)粒之間反向連接

僅用一種限制酶切割目的基因和載體的缺點：限制酶的選擇原則（二）雙酶切雙酶切法可避免自身環(huán)化和反向連接一、能找到兩種限制酶同時切割目的基因和載體PstⅠ和EcoRⅠ1.若要構(gòu)建基因表達載體，最應(yīng)選擇的限制酶是____________________。酶B和酶C2.若要構(gòu)建基因表達載體，最應(yīng)選擇的限制酶是___________________。注意1：

質(zhì)粒上兩個標(biāo)記基因，應(yīng)破壞一個并保留另一個。（雙標(biāo)記法篩選重組DNA分子）MspISmaI3.若利用酶切法獲得目的基因，最應(yīng)選擇的限制酶是____________________。注意2：一種酶的識別序列中包含另一種酶的識別序列。二、不能找到兩種限制酶同時切割目的基因和載體（一）同尾酶的利用：不同的限制酶切不同的識別序列產(chǎn)生相同的黏性末端。4.用圖中質(zhì)粒和目的基因構(gòu)建基因表達載體時，應(yīng)該選擇限制酶

切割質(zhì)粒，選擇限制酶

(只選擇一種)切割目的基因。用該方法切割目的基因、質(zhì)粒后______(填“能”或“不能”)防止目的基因的自身環(huán)化或與質(zhì)粒的反向連接。

BamHⅠSau3A不能（一）同尾酶的利用：不同的限制酶切不同的識別序列產(chǎn)生相同的黏性末端。5.要在乳酸桿菌中表達W基因，需使用圖1中的質(zhì)粒為載體。圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈。限制酶EcoRIBamHIKpnIMfeIHindⅢ識別序列及切割位點

為獲得能正確表達W基因的重組質(zhì)粒，應(yīng)選用限制酶____________切割圖1中的質(zhì)粒，選用限制酶____________切割圖2中含W基因的DNA片段。注意3：本題除了注意不同的酶切不同的識別序列產(chǎn)生相同的黏性末端，還要注意雙酶切時目的基因與質(zhì)粒的連接方向要正確。5′→3′3′5′5.要在乳酸桿菌中表達W基因，需使用圖1中的質(zhì)粒為載體。圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈。（1）目的基因與質(zhì)粒連接時的連接方向：

①以乙鏈為模板進行轉(zhuǎn)錄時，mRNA的合成方向為

（填“5′→3′”或者“3′→5′”）

②構(gòu)建表達載體時，乙鏈的

（填

5′或3′）端靠近質(zhì)粒上的啟動子

，乙鏈的

（填

5′或3′）

端靠近質(zhì)粒上的終止子

5′→3′3′5′限制酶EcoRIBamHIKpnIMfeIHindⅢ識別序列及切割位點

（2）限制酶的選擇：

①W基因的右端只有一種限制酶的酶切位點，即

，（填限制酶）且質(zhì)粒上也有該酶的酶切位點，所以目的基因和質(zhì)粒可同時選擇該種限制酶進行切割。（選出一種）②為了保證連接方向正確，此時質(zhì)粒上選擇的限制酶是

，但W基因的左端沒有相同的限制酶切位點，可選用其同尾酶

進行切割，得到相同的黏性末端。HindⅢMfeⅠEcoRⅠ5.要在乳酸桿菌中表達W基因，需使用圖1中的質(zhì)粒為載體。圖2為克隆得到的含W基因的DNA片段，W基因以乙鏈為轉(zhuǎn)錄模板鏈。限制酶EcoRIBamHIKpnIMfeIHindⅢ識別序列及切割位點

為獲得能正確表達W基因的重組質(zhì)粒，應(yīng)選用限制酶

切割圖1中的質(zhì)粒，選用限制酶

切割圖2中含W基因的DNA片段。HindⅢ和MfeⅠHindⅢ和EcoRⅠ（二）在目的基因上添加與質(zhì)粒相對應(yīng)的酶切位點二、不能找到兩種限制酶同時切割目的基因和載體（二）在目的基因上添加與質(zhì)粒相對應(yīng)的酶切位點方法：在引物5′端添加限制酶的識別序列，通過PCR技術(shù)擴增目的基因結(jié)果：在目的基因上添加了限制酶的識別序列目的基因5′3′3′5′6.在下面的目的基因上添加EcoRⅠ的識別序列5′-GAATTC3′-CTTAAGGAATTC-3′CTTAAG-5′課堂小結(jié)1、選擇雙酶切可避免自身環(huán)化和反向連接2、進行雙酶切時應(yīng)注意以下幾點：

①

質(zhì)粒上有雙標(biāo)記基因，應(yīng)破壞一個并保留另一個。（雙標(biāo)記法篩選重組DNA分子）②一種酶的識別序列中包含另一種酶的識別序列。