基因打靶技術(shù)

基因打靶技術(shù)及研究進(jìn)展

2007諾貝爾獎(jiǎng)專題

王廷璞瑞典卡羅林斯卡醫(yī)學(xué)院10月８日宣布，２００７年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予來自美國的馬里奧·卡佩奇、奧利弗·史密斯和來自英國的馬丁·伊文思因胚胎干細(xì)胞研究獲該獎(jiǎng)項(xiàng)。

這三位科學(xué)家是因?yàn)椤霸谏婕芭咛ジ杉?xì)胞和哺乳動(dòng)物DNA重組方面的一系列突破性發(fā)現(xiàn)”而獲得這一殊榮的。這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了一種通常被人們稱為“基因打靶”的強(qiáng)大技術(shù)。這一國際小組通過使用胚胎干細(xì)胞在老鼠身上實(shí)現(xiàn)了基因變化。

馬里奧·卡佩奇馬丁·埃文斯奧利弗·史密斯

建立在胚胎干細(xì)胞（embryonicstemcell，ES細(xì)胞）與同源重組技術(shù)基礎(chǔ)之上的基因打靶技術(shù)(Genetargeting)是一種定向改變生物活體遺傳信息的實(shí)驗(yàn)手段。通過對(duì)生物遺傳信息的定向修飾，并使修飾后的遺傳信息在生物活體內(nèi)遺傳，表達(dá)突變的性狀，從而研究基因的功能，闡明生物體的遺傳進(jìn)化，疾病發(fā)生的分子機(jī)制，提供相關(guān)的疾病治療藥物、評(píng)價(jià)模型及新型預(yù)防、治療疫苗等，是后基因組時(shí)代基因功能研究的重要技術(shù)手段。基因打靶：是利用同源重組技術(shù)來定點(diǎn)改變物種的基因組順序和結(jié)構(gòu)，從而在突變的個(gè)體內(nèi)來研究基因及基因組的功能?；蚯贸菏鞘够蚪M中某個(gè)/某幾個(gè)基因或基因的順式元件產(chǎn)生缺陷，從而在突變體內(nèi)喪生正常的功能，來推測這些基因或元件原來在體內(nèi)的功能?；蚯萌耄涸趥€(gè)體基因組中定點(diǎn)加入某個(gè)/某幾個(gè)基因或順式元件，使之表達(dá)或發(fā)揮作用，從而研究該基因或順式元件在體內(nèi)的功能。

基因打靶流程圖一、基因打靶研究的背景目前的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，如顯微注射、電穿孔、磷酸鈣沉淀及逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染等方法，已能有效地將外源基因?qū)氚屑?xì)胞內(nèi)。但這些導(dǎo)入的外源基因在靶細(xì)胞基因組中整合的位點(diǎn)一般是隨機(jī)的，可能導(dǎo)致下面幾種情況出現(xiàn)：①導(dǎo)入的外源基因整合入某一正?；虻闹胁浚瑢?dǎo)致該正?；虮磉_(dá)的缺如；②導(dǎo)入的外源基因整合入細(xì)胞內(nèi)正?；虻膫?cè)翼序列，影響了其周圍正?；虻幕钚?；③外源基因的導(dǎo)入有可能激活細(xì)胞內(nèi)的原癌基因；④導(dǎo)入的外源基因由于其整合位點(diǎn)的不適，而在細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)或表達(dá)難以控制。為避免上述情況的出現(xiàn)，最好的途徑就是將外源基因?qū)腩A(yù)先確定的位點(diǎn)。即對(duì)細(xì)胞內(nèi)靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)修飾——基因打靶，而研究該基因的功能或在生物發(fā)育中的作用。隨著人類及四十多種微生物基因組測序的完成，發(fā)現(xiàn)了大量未知功能的基因，應(yīng)用基因打靶技術(shù)對(duì)這些新基因進(jìn)行靶向修飾，是研究其功能最直接最有效的手段。因此，基因打靶就日益成為繼基因轉(zhuǎn)移技術(shù)后亟待發(fā)展的新技術(shù)。二、基因打靶原理生物界同源重組現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，為基因打靶奠定了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，而胚胎干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了基因打靶的廣泛應(yīng)用。同源重組(Homologousrecombination)又稱一般性重組或非特異性重組(Generalrecombination)，是指相似的DNA交換遺傳信息的過程,外源DNA段可與宿主基因組的相應(yīng)片段發(fā)生交換（即重組）。早在20世紀(jì)初，Morgan等人通過對(duì)果蠅眼色遺傳的分析揭示了同源染色體之間的DNA重組是產(chǎn)生交換的基礎(chǔ)。1985年在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了同源重組。基因打靶通常是指用含已知序列的DNA片段與受體細(xì)胞基因組中序列相同或相近的基因發(fā)生同源重組，整合至受體細(xì)胞基因組中并得以表達(dá)的一種外源DNA導(dǎo)入技術(shù)。

ES細(xì)胞是一類具有在體外培養(yǎng)條件下保持未分化狀態(tài)的增殖能力及分化為多種細(xì)胞類型的細(xì)胞。自從1981年美國的Gail和英國的Evans等分別成功地從發(fā)育中的小鼠囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（innercellmass）分離出胚胎干細(xì)胞,隨后,又從原始生殖細(xì)胞——一種最終分化為精或卵細(xì)胞的早期胚胎細(xì)胞中得到具有胚胎干細(xì)胞相似特性的細(xì)胞群，稱為胚胎種系(embryonicgerm，EG)細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞注入體內(nèi)與完整胚胎形成嵌合體后，可以發(fā)育形成包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的一系列成體組織；正是由于胚胎干細(xì)胞的特殊功能，ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已被廣泛地應(yīng)用于建立轉(zhuǎn)基因動(dòng)物之中。從80年代到90年代初，小鼠ES細(xì)胞基因打靶技術(shù)已發(fā)展到成熟階段。1984年，Bradly等成功地用顯微注射法將ES細(xì)胞移入囊胚腔，并移植回假孕母鼠，獲得生殖系嵌合體，經(jīng)過適當(dāng)?shù)慕慌?，獲得了源于ES細(xì)胞系的純系小鼠。此實(shí)驗(yàn)首次證實(shí)體外培養(yǎng)的ES細(xì)胞能在體內(nèi)分化發(fā)育成生殖系嵌合體并可獲得小鼠純合體子代。1987年，人們利用ES細(xì)胞技術(shù)建立了次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(hprt)基因敲除(Geneknockout)的動(dòng)物模型。此后，這項(xiàng)技術(shù)得到了普遍應(yīng)用和長足發(fā)展。三、打靶載體的構(gòu)建基因打靶載體包括載體骨架、靶基因同源序列和突變序列及選擇性標(biāo)記基因等非同源序列，其中同源序列是同源重組效率的關(guān)鍵因素。基因打靶載體有基因插入型載體(Gene-insertionvector)和基因置換型載體(Gene—replacementvector)。插入型載體中與靶基因同源的區(qū)段中含有特異的酶切位點(diǎn)，線性化后，同源重組導(dǎo)致基因組序列的重復(fù)，從而干擾了目標(biāo)基因的功能。置換型載體進(jìn)行線性化的酶切位點(diǎn)在引導(dǎo)序列和篩選基因外側(cè)，線性化后，同源重組使染色體DNA序列為打靶載體序列替換。大多數(shù)基因敲除突變都采用置換型載體進(jìn)行基因打靶。四、外源DNA導(dǎo)人的方式外源DNA導(dǎo)人的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒法等。目前應(yīng)用最廣的是顯微注射法。Capecchi報(bào)道，用顯微注射法導(dǎo)入可得到很高的轉(zhuǎn)染效率，占接受外源DNA細(xì)胞的10％~20％，但顯微注射每次只能注射一個(gè)細(xì)胞，而電穿孔法可同時(shí)使許多細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染。Mansour等研究發(fā)現(xiàn)電穿孔可使1％的ES細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體法利用某些病毒與組織細(xì)胞有特異的親合力，可用于時(shí)空特異性基因打靶，在人類疾病的基因治療方面具有較大的發(fā)展?jié)摿?。五、基因打靶的篩選方法（1）正負(fù)雙向選擇系統(tǒng)(positive-negative-selection,PNS)：為了更好地篩選發(fā)生同源重組的克隆，1988年Mansour等人設(shè)計(jì)了PNS,解決了定點(diǎn)整合與隨機(jī)整合的鑒別問題。同源重組時(shí)，只有載體的同源區(qū)以內(nèi)部分發(fā)生重組，同源區(qū)以外部分將被切除。隨機(jī)整合時(shí)，是在載體的兩端將整個(gè)載體連入染色體內(nèi)。置換型載體含有正負(fù)選擇基因各一，正選擇基因多為neo基因，位于同源區(qū)內(nèi)，其在隨機(jī)整合和同源重組中均可正常表達(dá)。負(fù)選擇基因在靶基因同源區(qū)之外，位于載體的3’末端，常用HSV-tk基因，在同源重組時(shí)，tk基因?qū)⒈磺谐鴣G失，相反在隨機(jī)整合時(shí)，所有的序列均保留（包括tk）。胸苷激酶蛋白（TK）可使無毒的丙氧鳥苷（GANC）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘院塑账?，而殺死?xì)胞，因而可用丙氧鳥苷篩選排除隨機(jī)整合的細(xì)胞株。故同源重組時(shí)，G418和GANC都有抗性，隨機(jī)整合時(shí)對(duì)G418有抗性，但對(duì)GANC敏感，細(xì)胞將被殺死，無整合的將被G418殺死。G418是一種氨基糖類抗生素，其結(jié)構(gòu)與新霉素、慶大霉素、卡那霉素相似，它通過影響80S核糖體功能而阻斷蛋白質(zhì)合成,對(duì)原核和真核等細(xì)胞都有毒性,包括細(xì)菌、酵母、植物和哺乳動(dòng)物細(xì)胞,也包括原生動(dòng)物和蠕蟲。是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染最常用的選擇試劑。當(dāng)neo基因被整合進(jìn)真核細(xì)胞基因組合適的地方后,則能啟動(dòng)neo基因編碼的序列轉(zhuǎn)錄為mRNA,從而獲得抗性產(chǎn)物氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶的高效表達(dá),使細(xì)胞獲得抗性而能在含有Ｇ418的選擇性培養(yǎng)基中生長。Ｇ418的這一選擇特性,已在基因轉(zhuǎn)移、基因敲除、抗性篩選以及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等方面得以廣泛應(yīng)用。用G418作正篩選，選出含有neo基因的細(xì)胞株，再用丙氧鳥苷作負(fù)篩選淘汰含有tk基因的細(xì)胞株，保留未含有tk基因的同源重組細(xì)胞株。此方法是目前應(yīng)用較廣泛的一種策略。正向篩選標(biāo)記基因Neo具有雙重作用，一方面導(dǎo)致靶基因的插入突變；同時(shí)作為重組細(xì)胞的正向篩選標(biāo)志，該基因產(chǎn)物可使細(xì)胞在含有新霉素的培養(yǎng)基中生長。除了上述方法外，還可用PCR及Southern雜交法進(jìn)一步篩選及鑒定中靶細(xì)胞。常用的選擇標(biāo)記基因正選擇標(biāo)記基因有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶（neo）、潮霉素B磷酸轉(zhuǎn)移酶（hph）、黃嘌呤/鳥嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（gpt）、次黃嘌呤磷酸轉(zhuǎn)移酶（Hprt）、胸腺嘧啶激酶（tk）及嘌呤霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（puro）。負(fù)選擇標(biāo)記基因有單純皰疹病毒胸腺嘧啶激酶（HSV-tk）、SacB、rpsl（strA）、tetAR、pheS、thyA、CacY、gata-I、ccdB等。（2）正相選擇法（positiveselectionmethod）麻省理工學(xué)院Sharp教授的研究組獨(dú)辟新徑，建立了一種新的同源重組選擇方法—正相選擇法。這種選擇法適用于在靶細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá)的基因的定點(diǎn)突變。其主要程序是：將選擇標(biāo)記基因neor的啟動(dòng)子和起始密碼剪切掉，再嵌合入打靶載體中與靶位點(diǎn)同源的序列內(nèi)，將打靶載體轉(zhuǎn)染進(jìn)靶細(xì)胞，可能出現(xiàn)下面幾種情況：①打靶載體不整合入靶細(xì)胞基因組，將隨傳代而丟失；②外源打靶序列隨機(jī)整合，由于neor基因缺失了其自身的啟動(dòng)子和起始密碼，整合位點(diǎn)周圍亦無啟動(dòng)子，使neor基因的表達(dá)受阻；③雖是隨機(jī)整合，但其整合位點(diǎn)側(cè)翼序列在其它基因的啟動(dòng)子能啟動(dòng)neor基因的表達(dá)；④外源打靶載體與靶位點(diǎn)發(fā)生了同源重組，則neor基因可借助靶基因自然存在的其和起始密碼的作用而呈現(xiàn)表達(dá)活性。因此，如用G418篩選，則抗性細(xì)胞中將只包含后兩種可能情況，根據(jù)這兩種情況下基因組DNA酶切圖譜的不一致，用Southern印跡雜交即可檢測出同源重組的克隆。利用正相選擇法，Sharp等對(duì)NIH/3T3細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的MT-1.4細(xì)胞系中的癌基因pmt成功地進(jìn)行了定點(diǎn)突變。之后不久，哥倫比亞大學(xué)的Schwartzberg等用此方法也實(shí)現(xiàn)了另一種細(xì)胞癌基因c-abl在ES細(xì)胞中的定點(diǎn)突變。最近，利用與正向選擇法相似的原理，Jasin等對(duì)小鼠T淋巴細(xì)胞系CD4位點(diǎn)亦成功地進(jìn)行了定點(diǎn)突變。六、基因打靶的策略（一）完全基因剔除(completeknotk-out)的策略在ES細(xì)胞中進(jìn)行基因打靶最常用的策略依然是使用PNS載體。借助于陽性選擇標(biāo)記基因通常被插入靶基因功能最關(guān)鍵的外顯子中，或通過同源重組刪除靶基因最重要的功能域，實(shí)行靶基因的完全剔除。陽性選擇標(biāo)記基因常采用β-半乳糖苷酶基因（lacZ），將其以正確的讀框插入靶基因的外顯子中，除了剔除靶基因外，通過分析β-半乳搪苷酶的活性可以研究靶基因表達(dá)的時(shí)空順序。

lacZ基因5’端若攜帶內(nèi)源核糖體插入位點(diǎn)(internalribosomalentrysites，IREs)，則lacZ基因的插入會(huì)不受時(shí)相的控制而得到正確的翻譯。此外，由于陰性選擇基因(多為tk基因)可能在轉(zhuǎn)染及整合過程中失活，導(dǎo)致打靶載體隨機(jī)整合的ES克隆得以生長，因而PNS載體依然得到較多隨機(jī)整合的ES克隆。為了提高中靶細(xì)胞篩選的效率，常采用啟動(dòng)子缺失的打靶載體。載體中陽性選擇標(biāo)記基因neo是不帶啟動(dòng)子的，只有發(fā)生正確的同源重組，neo基因被精確地插入靶基因啟動(dòng)子后，抗性基因才會(huì)表達(dá)，并使ES克隆在選擇性藥物培養(yǎng)基中存活下來。若在neo基因5’端連接上IREs位點(diǎn)，則可以在任意外顯子中插入而起相同的作用。（二）大規(guī)模隨機(jī)基因剔除—基因捕獲(genetrapping)用常規(guī)方法進(jìn)行基因打靶，必須針對(duì)靶位點(diǎn)在染色體組文庫中篩選相關(guān)的染色體組克隆，需耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力。利用基因捕獲可以建立一個(gè)攜帶隨機(jī)插入突變的ES細(xì)胞庫，節(jié)省大量篩選染色體組文庫以及構(gòu)建特異打靶載體的工作及費(fèi)用，更有效和更迅速地進(jìn)行小鼠染色體組的功能分析。典型的基因捕獲載體包括一個(gè)無啟動(dòng)子的報(bào)道基因，通常是neo基因。neo基因插入到ES細(xì)胞染色體組中，并利用捕獲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件實(shí)現(xiàn)表達(dá)的ES克隆可以很容易地在含G418的選擇培養(yǎng)基中篩選出來。從理論上講，在選擇培養(yǎng)基中存活的克隆應(yīng)該100％地含有中靶基因。中靶基因的信息可以通過篩選標(biāo)記基因側(cè)翼cDNA或染色體組序列分析來獲得。用基因捕獲法在單次實(shí)驗(yàn)中可以獲得數(shù)以百計(jì)的帶有單基因剔除的ES克隆。但此方法的缺點(diǎn)是只能剔除在ES細(xì)胞中表達(dá)的基因。隨著應(yīng)用哺乳動(dòng)物體細(xì)胞克隆新個(gè)體的成功實(shí)現(xiàn)。在體細(xì)胞中應(yīng)用基因捕獲剔除更多在發(fā)育晚期才表達(dá)的基因，其后通過核移植技術(shù)獲得帶有突變基因的動(dòng)物個(gè)體、這不失為一種可以彌補(bǔ)以上缺陷的辦法。此外用基因捕獲法進(jìn)行基因剔除的另一個(gè)缺點(diǎn)是無法對(duì)基因進(jìn)行精細(xì)的遺傳修飾。（三）精細(xì)突變的引入人類疾病中許多是由于基因功能喪失引起的，也有許多是由于基因過表達(dá)或功能獲得（gainoffunction）引起的。對(duì)后者就無法用基因剔除的方法獲得相應(yīng)的疾病模型。為此，研究者發(fā)明了各種可以將諸如插入終止密碼子或替換某個(gè)氨基酸之類的精細(xì)突變引入小鼠基因組中的方法。早期的研究者采用的方法主要有兩種，一是將不含選擇標(biāo)記基因的打靶載體直接經(jīng)顯微注射法引入ES細(xì)胞，然后用PCR分析鑒定同源重組克?。涣硪环N是用帶有精細(xì)突變但無選擇標(biāo)記基因的打靶載體與僅含標(biāo)記基因的載體經(jīng)電穿孔共轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞。這兩種方法在技術(shù)上有很大局限性，現(xiàn)在基本上已不再使用。目前較為常用的方法主要有“HitandRun”、“TagandExchange”以及基于重組酶系統(tǒng)的方法。（1）打了就走策略(HitandRun法)HitandRun法，也稱進(jìn)退策略。這一方法包括兩次同源重組：第一步（Hit）用插入型載體進(jìn)行同源重組，這樣會(huì)在靶位點(diǎn)插入帶有突變的基因組序列以及載體骨架，載體骨架上帶有兩個(gè)篩選標(biāo)記（如正篩選標(biāo)記基因neo和負(fù)篩選標(biāo)記基因tk）。第二步（Run）利用tk抗性篩選，富集為數(shù)不多的發(fā)生了染色體內(nèi)重組的克隆。染色體內(nèi)重組去除了含有負(fù)篩選標(biāo)記基因的載體序列，由于負(fù)篩選標(biāo)記基因的消失，細(xì)胞就恢復(fù)了對(duì)負(fù)篩選藥物的抗性，因此，回復(fù)突變體可以在負(fù)選擇培養(yǎng)基中存活下來。為了便于應(yīng)用Southern方法對(duì)中靶克隆進(jìn)行篩選，可對(duì)靶基因突變位點(diǎn)的相鄰核苷酸進(jìn)行改造，產(chǎn)生一個(gè)新的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)而不影響相鄰氨基酸的組成。有時(shí)可以通過改變堿基組成使突變基因序列和野生型基因序列間的差異達(dá)到最大，以便于用不同的PCR引物檢出突變基因和野生型基因。Hasty等用此方法在小鼠ES細(xì)胞同源異型基因簇Hox-2.6基因3’端引入了一個(gè)終止密碼子，得到了減少43個(gè)氨基酸的突變蛋白。HitandRun法的不足之處是：第一，此過程中第二步染色體內(nèi)的同源重組無法精確地控制，可能會(huì)導(dǎo)致失去攜帶突變的同源序列，而留在基因組中的仍是未修飾的內(nèi)源片段。第二，整個(gè)過程需要采用兩種培養(yǎng)基分別進(jìn)行先后兩次篩選。第三，無法同時(shí)引進(jìn)多個(gè)位點(diǎn)突變。另一類采用置換型載體進(jìn)行基因打靶、將突變經(jīng)過兩次同源重組引入靶基因的策略部分地彌補(bǔ)了這些缺陷。（2）雙置換法(DoubleReplacement)最早提出這一設(shè)想的研究者稱其為“In-Out”法。第一步用含有Hprt基因的打靶載體轉(zhuǎn)染Hprt–ES細(xì)胞，由于Hprt基因雙側(cè)是靶基因的同源序列。通過在HAT培養(yǎng)基中篩選并用PCR進(jìn)行基因組分析，篩選發(fā)生同源重組、Hprt

基因整合到基因組中的陽性克隆。第二步，用只攜帶突變同源序列的打靶載體轉(zhuǎn)染第一步獲得的Hprt+ES細(xì)胞。同源重組發(fā)生后，突變序列整合入基因組，Hprt

被置換出來。Hprt–細(xì)胞可在6-GT培養(yǎng)基上篩選并用PCR進(jìn)行分析。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于，第一步獲得的Hprt+ES細(xì)胞，除了可用于產(chǎn)生普通的基因剔除小鼠外，更可作為將不同突變引入靶基因的基礎(chǔ)。1995年，Moore等將這種方法稍加改進(jìn)，稱其為“雙置換法”（doublereplacement）。他們用這種方法將5種突變分別引入Prion蛋白基因，探討研究人類Prion蛋白相關(guān)疾病及其基因治療的可能性。（3）“標(biāo)記和置換”法(TagandExchange)“標(biāo)記和置換”的策略與雙置換法有許多共同之處。它是用兩個(gè)不同的置換型載體進(jìn)行兩次連續(xù)的基因打靶完成的。通過第一步的同源重組插入正負(fù)篩選標(biāo)記基因（如neo和tk）對(duì)靶基因進(jìn)行“標(biāo)記”。第二步打靶用在同源序列上帶有精細(xì)突變的載體來轉(zhuǎn)染第一步得到的ES克隆，帶有精細(xì)突變的同源序列將置換下被“標(biāo)記”的靶基因。Askew等用標(biāo)記和置換法成功地將ES細(xì)胞內(nèi)源的Na+-K+-ATP酶基因改變了兩個(gè)氨基酸，使其既能維持轉(zhuǎn)膜運(yùn)輸?shù)碾x子泵功能，又能抵抗強(qiáng)心類糖苷的抑制作用。（4）利用Cre-LoxP系統(tǒng)引入點(diǎn)突變近年來，導(dǎo)入精細(xì)突變最常用的方法應(yīng)首推以Cre-LoxP為基礎(chǔ)的重組系統(tǒng)。Cre-LoxP位點(diǎn)特異重組酶是由酵母或細(xì)菌所編碼、可識(shí)別特異靶位點(diǎn)并在其上催化斷裂和重接、從而產(chǎn)生精確的DNA重組的一類酶。根據(jù)序列相似性，重組酶可分為Int家族（integrasefamily）和resolvase-invertasefamily。Cre是來源于P1噬菌體cre基因所編碼的一個(gè)38ku蛋白，屬于Int家族，它可識(shí)別P1基因組上由34bp核苷酸序列構(gòu)成的稱為LoxP的特異靶位點(diǎn)，并根據(jù)Loxp的方向性，可在各種底物（超螺旋環(huán)狀型，松弛型和線型DNA分子）上介導(dǎo)三種不同的重組事件：①相位點(diǎn)之間序列的缺失；②插入序列；③兩個(gè)反向位點(diǎn)之間序列顛倒。需指出的是，Cre重組酶所催化的是一個(gè)可逆的重組事件，重組的程度與重組酶的表達(dá)水平相關(guān)。此外在位點(diǎn)特異重組反應(yīng)的任何階段上，不需要任何輔助因子參與；該特點(diǎn)使Cre/LoxP位點(diǎn)特異重組酶系統(tǒng)成為可在各類種屬上進(jìn)行意向DNA操作的有用工具。應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)將精細(xì)突變導(dǎo)入基因組的策略為：在置換型的打靶載體中，正負(fù)篩選標(biāo)記基因兩側(cè)各放置一個(gè)LoxP序列，并被置于靶基因的內(nèi)含子中。攜帶精細(xì)突變的外顯子位于載體一側(cè)的同源臂上。經(jīng)過同源重組和突變的鑒定后（如利用新產(chǎn)生的酶切位點(diǎn)來鑒定），通過轉(zhuǎn)染將Cre重組酶表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入中靶ES細(xì)胞。（四）條件性基因打靶Cre-loxP系統(tǒng)、FLP/FRT系統(tǒng)和條件性基因敲除Cre/loxP：來自P1噬菌體，Cre重組酶基因和loxP序列位于P1噬菌體基因組內(nèi)，loxP是Cre酶的識(shí)別序列。Cre（FLP）重組酶有刪除/整合、倒位、轉(zhuǎn)位等功能基本策略是通過類似于基因敲除的方法將兩個(gè)loxP位點(diǎn)同向引入到要?jiǎng)h除的基因片段兩側(cè)。FLP/FRT：來自酵母，F(xiàn)RT是FLT酶的識(shí)別序列5’ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT3’3’TATTGAAGCATATCGTATGTAATATGCTTCAATA5’CreCre反向重復(fù)序列ATAACTTCGTATATATACGAAGTTATGCATACATCreCreloxP反向重復(fù)序列5’ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT3’3’TATTGAAGCATATCGTATGAATATGCTTCAATA5’CreCre+loxP序列及其酶切示意圖“條件性”主要由控制Cre酶產(chǎn)生方法來實(shí)現(xiàn)，采用不同時(shí)空表達(dá)專一性的啟動(dòng)子來表達(dá)Cre酶，就能在小鼠發(fā)育的特定階段或特定組織達(dá)到某基因敲除的目的。條件基因敲除大大開拓了基因敲除的應(yīng)用范圍，并賦予基因敲除的新的涵義。條件性基因敲除的意義：建立條件性基因敲除需要分三步進(jìn)行：1、通過同源重組的方法在待刪除片斷的兩側(cè)引入同向的loxP位點(diǎn)（此步同ES細(xì)胞的打靶，只是載體不同），用Cre的瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染ES細(xì)胞克隆，在Cre酶下發(fā)生DNA重排。2、構(gòu)建一個(gè)在特定組織和發(fā)育階段表達(dá)Cre酶的轉(zhuǎn)基因小鼠3、將前兩步獲得的小鼠雜交，在子代小鼠轉(zhuǎn)篩選特定組織中基因敲除的小鼠。條件性基因敲除的打靶載體和技術(shù)流程示意基因敲入基因敲入：用一個(gè)設(shè)計(jì)好的基因片段來取代基因組中的特定片段和將一個(gè)設(shè)計(jì)好的基因片段插入到基因組的特定片段中，這一技術(shù)也是建立在Cre－loxP系統(tǒng)基礎(chǔ)上?；蚯萌胗袃蓷l途徑刪除選擇標(biāo)記基因：第一條途徑是引入loxP位點(diǎn)的同源重組后，引入Cre基因瞬時(shí)表達(dá)載體，在ES細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)Cre，刪除兩個(gè)loxP位點(diǎn)之間的序列，然后用該ES細(xì)胞建立相應(yīng)的小鼠品系。第二條途徑是先引入loxP位點(diǎn)的ES細(xì)胞建立一個(gè)小鼠品系，與一種Cre轉(zhuǎn)基因小鼠品系雜交，最后建立基因敲入的小鼠品系?；蚯萌氲拇虬休d體和技術(shù)流程示意條件基因打靶有如下特點(diǎn)：①通過條件性基因敲除，研究完全敲除具有致死效應(yīng)的基因的功能以及基因在特定的組織細(xì)胞或個(gè)體發(fā)育特定階段的功能。②通過條件性基因激活，實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因的可控制性表達(dá)。③通過Cre切除條件性基因修復(fù)(Creexcision-conditionalgenerepair)，進(jìn)行基因的可修復(fù)性敲除，以研究一個(gè)基因的多種功能。（五）時(shí)空特異性基因打靶完全基因剔除將靶基因自產(chǎn)生時(shí)刻起在所有的組織器官中終生滅活。許多在成體器官發(fā)育中具有重要功能的基因，如腫瘤抑制基因Brca1、Brca2、Dpc4/Smad4等，由于在胚胎早期表達(dá)，基因剔除后往往導(dǎo)致小鼠胚胎早期死亡，使得研究者無法深人探索這些基因在成體中的重要作用。因此可以在特定的時(shí)間和空間—即在特定的發(fā)育階段和特定的組織細(xì)胞中開啟或關(guān)閉特定基因的時(shí)空特異性基因打靶（spatiotemporalgenetargetingSTGT）技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。Cre/LoxP和FLP—frt系統(tǒng)的應(yīng)用使得組織特異性基因剔除變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。第1例應(yīng)用Cre/LoxP系統(tǒng)研制成功的組織特異性基因剔除小鼠是由Gu等人在1994年報(bào)道的。構(gòu)建條件剔除（conditionalknockout）小鼠的打靶載體，常將陽性選擇標(biāo)記基因置于靶基因的內(nèi)含子中，并在靶基因重要功能域兩側(cè)的內(nèi)含子中插入方向相同的LoxP序列，因?yàn)樵S多時(shí)候選擇標(biāo)記基因即便被放置在內(nèi)含子中，也會(huì)阻斷靶基因的轉(zhuǎn)錄。Meyer等人同時(shí)應(yīng)用Cre—LoxP和FLP—frt系統(tǒng)研制了系列fgf8等位基因突變小鼠。fgf8染色體組上的不同區(qū)域分別放置了成對(duì)的LoxP序列和frt序列，通過與Cre或FLP轉(zhuǎn)基因小鼠雜交可以分別獲得完全敲除小鼠和條件敲除小鼠。此外，還可通過感染表達(dá)重組酶的腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒實(shí)現(xiàn)組織特異性的重組。為了達(dá)到在時(shí)空上調(diào)節(jié)基因打靶的目的，研究者將Cre基因置于配體或藥物可誘導(dǎo)的啟動(dòng)子控制下，Kühn等人在1995年報(bào)道了Mx1—Cre轉(zhuǎn)基因鼠的研究，Mxl是一種與抗病毒感染相關(guān)的基因，它在健康的小鼠中是不表達(dá)的，但可被重組干擾素或干擾素誘導(dǎo)劑pI—PC誘導(dǎo)。另一個(gè)常用的系統(tǒng)是四環(huán)素調(diào)節(jié)系統(tǒng)。St-Onge等人證實(shí)應(yīng)用經(jīng)典的tet系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)Cre介導(dǎo)重組的誘導(dǎo)控制，但存在較高的背景Cre重組酶活性。這些研究都是試圖在轉(zhuǎn)錄水平上來控制Cre重組酶的表達(dá)從而達(dá)到在特定時(shí)段將靶基因剔除的目的。另一類研究則采用在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)重組酶活性的策略。Feil

等人將Cre基因與人雌激素受體突變的配體結(jié)合功能域融合，產(chǎn)生的Cre-ERT具有tamoxifen依賴的重組酶活性。他們將融合蛋白置于巨細(xì)胞病毒(CMV)的啟動(dòng)子下研制成功了轉(zhuǎn)基因小鼠。第1例對(duì)Cre重組酶活性真正實(shí)現(xiàn)時(shí)空上調(diào)節(jié)的研究是1998年由Schwenk等人報(bào)道的。他們應(yīng)用B細(xì)胞特異的啟動(dòng)子將Cre-ER融合蛋白的表達(dá)限制在B淋巴細(xì)胞中。B淋巴細(xì)胞中Cre介導(dǎo)的重組效率高達(dá)80％。（六）染色體組大片段的刪除和重排（1）Cre介導(dǎo)的非同源染色體間的重排

基于Cre-LoxP系統(tǒng)的位點(diǎn)特異性重組可以介導(dǎo)長距離的重組，這種重組已被應(yīng)用于果蠅和植物，在哺乳動(dòng)物中也取得成功。Li等用此方法成功地將淀粉樣前體蛋白基因（APP）200kb的片段去除。其方法為在第一次打靶的過程中同時(shí)將兩個(gè)選擇標(biāo)記基因neo、tk及3’端缺失的hprt基因和LoxP序列引入到靶位點(diǎn)的上游，通過篩選得到neo抗性的陽性克隆。篩到的克隆用于進(jìn)行第二次打靶，在靶位點(diǎn)的下游引入另一個(gè)LoxP序列和5’端缺失的hprt基因，同時(shí)引入兩個(gè)選擇標(biāo)記基因hyg和tk基因。中靶的陽性克隆在Cre重組酶的存在下發(fā)生重組將tk基因去除，將對(duì)FIAU產(chǎn)生抗性。同時(shí)，兩端部分缺失的hprt基因在染色體上重新組成有功能的hprt基因，使該克隆能在含HAT的培養(yǎng)基中存活。具體的實(shí)施過程有兩種策略：一種是通過兩次打靶分別將兩個(gè)LoxP位點(diǎn)引入靶位點(diǎn)。中靶的克隆轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre酶的質(zhì)粒，去除兩個(gè)LoxP位點(diǎn)之間的序列；另一種是第一次中靶的克隆直接轉(zhuǎn)染第二次的打靶載體和Cre酶表達(dá)質(zhì)粒，直接篩選最終中靶的克隆。兩種方法都得到了嵌合體小鼠。Justice等用此系統(tǒng)研制了攜帶毛色基因標(biāo)記的染色體組大片段缺失的突變小鼠。（2）Cre-LoxP介導(dǎo)的姐妹染色體間的重排哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有相當(dāng)數(shù)量的基因是多拷貝的，這些多拷貝的基因在染色體上排列在一起形成基因簇?；虼刂械幕蚓哂邢嗤蛳嗨频墓δ?。用基因打靶的方法研究這些基因的功能必須使這些基因同時(shí)產(chǎn)生突變。如果基因簇內(nèi)的各基因的遺傳距離較大，可以分別在每一個(gè)拷貝上引入突變，通過子代的雜交獲得每個(gè)拷貝同時(shí)帶有突變的個(gè)體。但當(dāng)基因簇內(nèi)的各基因間的距離很小時(shí)，染色體交換的頻率非常低，無法通過子代雜交獲得各拷貝同時(shí)帶有突變的個(gè)體。用Cre-LoxP系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)這一目的。具體的實(shí)施策略是將兩個(gè)LoxP序列通過同源重組分別引入到兩個(gè)基因中去，得到兩個(gè)分別帶有LoxP序列的小鼠品系。兩個(gè)品系雜交，就會(huì)得到在兩條姐妹染色體上同時(shí)帶有LoxP序列的小鼠，再和表達(dá)Cre酶的第三個(gè)小鼠品系雜交便可獲得兩個(gè)拷貝同時(shí)刪除的子代。Matsuaka等將編碼腎素基因簇內(nèi)的兩個(gè)基因ren1和ren2用此方法同時(shí)滅活獲得了成功。Cre介導(dǎo)的非同源染色體間的重排

人類的許多遺傳疾病是由于染色體的易位引起的，應(yīng)用Cre-LoxP系統(tǒng)成功地建立了相應(yīng)的動(dòng)物模型。其原理是，將LoxP序列分別引入到非同源染色體上，在Cre酶的存在下誘導(dǎo)非同源染色體之間的重組。VanDeursen等通過兩次連續(xù)的基因打靶將兩個(gè)LoxP序列分別引入到小鼠ES細(xì)胞的13號(hào)染色體的DEK和2號(hào)染色體的Can基因中，兩次中靶ES細(xì)胞轉(zhuǎn)染超螺旋結(jié)構(gòu)的編碼Cre重組酶的質(zhì)粒，得到了染色體易位的ES細(xì)胞。（七）誘導(dǎo)性基因打靶（1）誘導(dǎo)性基因打靶原理

它主要由Cre/loxP及誘導(dǎo)系統(tǒng)組成。Cre／loxP系統(tǒng)由重組酶Cre和該酶的特定作用位點(diǎn)loxP組成，其中的重組酶Cre可誘導(dǎo)LoxP所在的DNA發(fā)生缺失、插入、重復(fù)、倒位和易位等多種形式的基因突變或染色體畸變。誘導(dǎo)性基因打靶就是以該系統(tǒng)為基礎(chǔ)、利用控制Cre表達(dá)的啟動(dòng)子的活性或所表達(dá)的Cre酶活性具有可誘導(dǎo)的特點(diǎn)，通過對(duì)誘導(dǎo)劑給予時(shí)間的控制、或利用Cre基因定位表達(dá)系統(tǒng)中載體的宿主細(xì)胞特異性和將該表達(dá)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移到動(dòng)物體內(nèi)的過程在時(shí)間上的可控性、從而在loxP動(dòng)物的一定發(fā)育階段和一定組織細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)對(duì)特定基因進(jìn)行遺傳修飾之目的的基因打靶技術(shù)。（2）誘導(dǎo)性基因打靶的類型根據(jù)所用誘導(dǎo)劑的種類，誘導(dǎo)性基因打靶可分為四環(huán)素誘導(dǎo)型、干擾素誘導(dǎo)型（二者所用誘導(dǎo)劑為控制Cre基因表達(dá)的啟動(dòng)子活性的活化物)和激素誘導(dǎo)型(所用誘導(dǎo)劑為Cre酶活性的激活物)等幾種類型。以Cre／loxP系統(tǒng)介導(dǎo)的位點(diǎn)特異性重組為基礎(chǔ)的誘導(dǎo)性基因打靶術(shù)的優(yōu)勢：①誘導(dǎo)基因突變的時(shí)間可人為控制；②可避免因基因突變而致死胎的問題；③在2個(gè)loxP位點(diǎn)之間的重組率較高；④如用病毒或配體/DNA復(fù)合物等基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)來介導(dǎo)Cre的表達(dá)，則可省去建立攜帶Cre的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的過程。（八）基因敲入（GeneKnockin）通過基因打靶，用一種基因替換另一種基因以便在體內(nèi)測定它們是否具有相同功能。也可通過該技術(shù)進(jìn)行靶向基因治療。與基因敲除不同之處在于：設(shè)計(jì)載體時(shí)將靶基因第一外顯子N端缺失并將新的替換基因置于靶基因的調(diào)控序列之下。七、基因打靶的影響因素基因打靶的效率是指可檢測到的細(xì)胞中發(fā)生同源重組的細(xì)胞數(shù)與轉(zhuǎn)染的細(xì)胞總數(shù)之比，又稱同源重組效率?；虼虬行试诓煌难芯繄?bào)道中變動(dòng)范圍較大，其波動(dòng)性來自較多的影響因素。(1)打靶載體的影響打靶載體中同源序列是決定同源重組效率的關(guān)鍵因素，Thomas和Capecchi研究表明，當(dāng)載體同源序列長度從4kb增加至9kb時(shí)，基因打靶效率增加10倍，與此同時(shí)，非同源重組效率增加40倍。Zimmer等用顯微注射法將含20kb同源重組序列的載體插入小鼠基因組，破壞了Hox1.1基因，其效率是1/150。Hasty等研究發(fā)現(xiàn)，同源序列達(dá)一定長度后，繼續(xù)的增加對(duì)同源重組效率不產(chǎn)生顯著影響。(2)外源DNA導(dǎo)入方式的影響目前，外源DNA導(dǎo)入的方式主要有顯微注射法、電穿孔法、精子載體法和逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法。不同的導(dǎo)入方法對(duì)同源重組效率有明顯影響。目前應(yīng)用最廣的是顯微注射法，用顯微注射法導(dǎo)入可得到很高的轉(zhuǎn)染率，占接受外源DNA細(xì)胞的10~20%，但顯微注射每次只能注射一個(gè)細(xì)胞，而用電穿孔法可同時(shí)使許多細(xì)胞得到轉(zhuǎn)染，可使1%的ES細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。199