真核生物基因組DNA的提取和含量測(cè)定

1、專業(yè)： 藥學(xué) 姓名： 阿卜杜合力力 學(xué)號(hào)： 3100105256 日期： 2012.5.10 地點(diǎn)： 生化實(shí)驗(yàn)室 裝 訂 線實(shí)驗(yàn)報(bào)告課程名稱： 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)名稱： 真核生物基因組DNA的提取和含量測(cè)定 指導(dǎo)老師： 同組學(xué)生姓名： 廖杰 成績(jī)：_真核生物基因組DNA的提取和含量測(cè)定【實(shí)驗(yàn)原理】制備具有生物活性的大分子核酸，必需采取溫和的制備條件，避免過(guò)酸、過(guò)堿的反應(yīng)環(huán)境和劇烈的攪拌，防止核酸酶的作用，并要求在低溫下進(jìn)行操作 。一、 真核生物基因組DNA的提取本實(shí)驗(yàn)選用小鼠肝臟細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料，采用勻漿法破碎組織細(xì)胞。DNP在0.14mol/L NaCl中不溶解,而RNP可溶解。用無(wú)菌水溶解

2、沉淀，加入蛋白酶消化液（含有蛋白酶K和SDS）。溫和方法的破碎細(xì)胞而不產(chǎn)生機(jī)械剪切以致破壞DNA的完整性，可以變性Dnase，還可以去除部分的蛋白。使核蛋白體從DNA上解離。 然后加RNase以去除RNA，再用苯酚:氯仿抽提法反復(fù)抽提提取DNA苯酚:氯仿抽提法： 酚、氯仿是有機(jī)溶劑，能有效地使蛋白質(zhì)變性。純酚在與水混合時(shí)處于下層。然而有機(jī)相和水相會(huì)難于分開(kāi)。若使用酚：氯仿混合物抽提，由于氯仿的比重較大(1.47)，可在很大程度上解決這個(gè)問(wèn)題，促進(jìn)兩相的分離。異戊醇則可減少操作過(guò)程中產(chǎn)生的氣泡。變性蛋白一般集中在兩相之間的界面層，而脂類則有效地分配在有機(jī)相中，核酸則被留于上層水相。該法其具有操作

3、條件比較溫和，能迅速使蛋白質(zhì)變性并同時(shí)抑制核酸酶的活性，可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等優(yōu)點(diǎn)。 但其操作步驟較為繁瑣，去除蛋白質(zhì)需要反復(fù)進(jìn)行多次。 砷鹽、氟化物、檸檬酸、EDTA等可抑制DNase的活性；皂土等可抑制RNase的活性。收集上清液后用乙醇沉淀DNA，最后用TE緩沖液溶解DNA，并用紫外吸收法測(cè)定DNA的含量及純度。二、 紫外吸收法測(cè)定基因組DNA的含量及純度1紫外分光光度法測(cè)定核酸含量：由于DNA在260nm處有最大的吸收峰，因此，可以用260nm波長(zhǎng)進(jìn)行分光測(cè)定DNA濃度，吸光度A值為1相當(dāng)于大約50g /ml雙鏈DNA。2紫外分光光度法測(cè)定DNA純度：由于DNA在260n

4、m處有最大的吸收峰，而蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，DNA純品的算A260/ A280為1.8（1.71.9），故根據(jù)算A260/ A280的值可以估計(jì)DNA的純度。若比值較高說(shuō)明含有RNA，比值較低說(shuō)明有殘余蛋白質(zhì)存在。三，二苯胺顯色法測(cè)定DNA含量DNA在酸性條件下加熱，酸解釋出脫氧核糖。脫氧核糖在酸性環(huán)境中脫水生成-羥基-酮基戊醛，后者與二苯胺試劑一起加熱產(chǎn)生藍(lán)色反應(yīng)，在595 nm處有最大吸收。在反應(yīng)液中加入少量乙醛，可以提高反應(yīng)靈敏度。除脫氧核糖外，脫氧木糖、阿拉伯糖也有同樣反應(yīng)。其他多數(shù)糖類，包括核糖在內(nèi)，一般無(wú)此反應(yīng)?！静僮髋c步驟】一、 基因組DNA的提取1組織細(xì)胞的裂解

5、（1）切取0.2g鼠肝，冰冷生理鹽水洗3次。當(dāng)組織離開(kāi)機(jī)體，DNA酶就會(huì)表現(xiàn)出活性。在冰冷的生理鹽水中，可以降低DNA酶的活性，防止基因組DNA被降解。（2）碎鼠肝轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中，加入2mL分離緩沖液，勻漿（冰上操作）。（3）勻漿液轉(zhuǎn)入2mL離心管，4 , 5000rpm離心5min；沉淀加0.4mL無(wú)菌水，吹散后再加0.4mL的蛋白酶消化液（含100g/ml的蛋白酶K），慢慢顛倒混勻，50保溫90分鐘, 直到組織完全解體。（4）加10mg/ml的RNase 16l (終濃度200g/ml)，37保溫40min。2裂解物中蛋白質(zhì)的去除 （1）加等體積酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，慢慢顛

6、倒混勻，冰上靜置5min。待分層后, 于4，12000rpm離心15min。離心后可見(jiàn)分層，上層為水相含DNA，下層為有機(jī)溶劑層，變性蛋白質(zhì)介于兩層之間。（2）小心吸出上面的水層并轉(zhuǎn)移到新的小離心管中，根據(jù)吸出的量再加入等體積的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)，重復(fù)上述操作以去除蛋白質(zhì)，直至界面不再出現(xiàn)明顯的變性蛋白質(zhì)為止。（3）小心吸出上面的水層并轉(zhuǎn)移到另一新的小離心管中，根據(jù)吸出的量再加入等體積氯仿/異戊醇，慢慢顛倒混勻。4，12000rpm離心15min。本步驟可去除微量的酚。3DNA的沉淀 (1)上清加1/10體積的3mol/L NaAc(pH 5.2)和2倍體積的無(wú)水乙醇顛倒混合沉

7、淀DNA。室溫下靜止10分鐘，DNA沉淀形成白色絮狀物。10000rpm離心10min，棄上清。(2)DNA沉淀溶解于3ml TE 中，進(jìn)行260nm/280nm紫外檢測(cè)。二、 紫外吸收法測(cè)定基因組DNA的含量及純度1用TE緩沖液稀釋樣品（520倍），2用TE緩沖液調(diào)零點(diǎn)，樣品稀釋液轉(zhuǎn)入紫外分光光度計(jì)的石英比色杯中，分別測(cè)定其在260nm和280nm的吸光度。吸光度在0.21.2 OD范圍內(nèi)較為理想。3計(jì)算濃度： 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) =A260核酸稀釋倍數(shù) 50/10004計(jì)算A260/ A280比值，分析純度。三、 二苯胺顯色法測(cè)定DNA含量1. DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 取10支試管

8、，分成組，依次加入0.4、0.8、1.2、1.6和2.0 mL DNA標(biāo)準(zhǔn)溶液。添加蒸餾水，使每管體積為2 mL。 另取2支試管，各加2 mL蒸餾水作為對(duì)照。 然后各加入4 mL二苯胺試劑，混勻。 于100恒溫水浴中保溫20分鐘，冷卻后于595 nm處進(jìn)行比色測(cè)定。 取兩管平均值，以DNA含量為橫坐標(biāo)，光吸收值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 2. 制品的測(cè)定 取2支試管，各加2 mL待測(cè)液(內(nèi)含DNA應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線的可測(cè)范圍之內(nèi))和4 mL二苯胺試劑，搖勻。其余操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。 3. DNA含量的計(jì)算 根據(jù)測(cè)得的光吸收值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相當(dāng)該光吸收值的DNA的含量?！緦?shí)驗(yàn)結(jié)果】一、純度測(cè)定結(jié)果

9、：三、 含量的計(jì)算：標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)DNA含量（mg/L）013.3 26.64053.366.6吸光的(=595nm)00.1880.2750.3550.4380.528樣品DNA的A595=0.284從DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到樣品DNA的含量為33.81mg/mL 。【分析與討論】抽提DNA 去除蛋白質(zhì)時(shí)，怎樣使用酚與氯仿較好?A1: 酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當(dāng)?shù)鞍姿芤号c酚或氯仿混合時(shí)，蛋白質(zhì)分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態(tài)而變性。經(jīng)過(guò)離心，變 性蛋白質(zhì)的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開(kāi)。而酚與氯仿有機(jī)溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性劑的酚與氯仿，在去除蛋白質(zhì)的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約10%-15%的水溶解在酚相中，因而損 失了這部分水相中的DNA ，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會(huì)帶走DNA 。所以在抽提過(guò)程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經(jīng)酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質(zhì)，此時(shí)一起將酚帶 走。也可以在第二次抽提時(shí)，將酚與氯仿1:1混合使用。Q2：為什么用酚與氯仿抽提DNA 時(shí)，還要加少量的異戊醇?A2：在抽提DNA 時(shí)，為了混合均勻