免疫組化結(jié)果分析和判斷PPT課件.ppt

1、第七章免疫組織化結(jié)果的分析和判斷(要求：理解、記住、使用)，第一節(jié)免疫組織化結(jié)果的判斷原則總結(jié)免疫組織化結(jié)果的判斷原則，有以下幾點(diǎn)。 沒有對(duì)照染色的免疫組織化染色的結(jié)果不可信。 抗原的表達(dá)必須在特定部位。 LCA必須位于細(xì)胞膜上CK必須位于細(xì)胞漿內(nèi)PCNA和p53蛋白質(zhì)必須位于核內(nèi)EMA必須位于細(xì)胞膜上。 不是有抗原的部位的陽性著色，都不被視為陽性。 陰性結(jié)果不能視為抗原不表達(dá)。 因?yàn)闄z測(cè)方法的靈敏度有高低，染色方法的靈敏度不足，有時(shí)會(huì)引起陰性反應(yīng)，所以判斷上需要注意。 盡量避免出血、壞死及切片刀痕和界面周邊細(xì)胞的陽性表達(dá)，特別是酶免疫標(biāo)記。 這種陽性著色的多系內(nèi)源性干擾或者是人為的原因。 喀

2、嚓喀嚓喀嚓喀嚓喀嚓喀嚓6、第2節(jié)對(duì)照染色設(shè)計(jì)，(1)對(duì)照染色的目的是排除假陰性和假陽性。 假陰性的原因主要有三個(gè)：組織處理不適當(dāng)，抗原丟失過多，或隱藏的抗體失活，有效值過低，或稀釋度不適當(dāng)(主要指一次抗體，即特異性抗體)。 染色工序的遺漏和錯(cuò)誤、顯色劑的選擇、緩沖液的pH值和離子強(qiáng)度的不當(dāng)?shù)取?假陽性是由各種因素引起的非特異性著色引起的，原因主要有：自發(fā)熒光和內(nèi)源性酶等干擾抗體試劑不純(特別是一次抗體)污染、切片干燥、顯影劑操作錯(cuò)誤等操作錯(cuò)誤Fc受體的干擾等。 (二)對(duì)照種類及其選擇目的的對(duì)照染色大致分為陽性組織對(duì)照、陰性組織、陰性試劑對(duì)照和自我對(duì)照四種：陽性組織對(duì)照是指與目標(biāo)抗原同源性不同的

3、源組織切片或細(xì)胞涂片與檢查對(duì)象切片同時(shí)進(jìn)行同樣處理和免疫染色的組織對(duì)照。 正確的結(jié)果必須是陽性的。 為了證實(shí)所用免疫組織化染色過程的有效性，排除了假陰性的可能性。 陰性組織對(duì)照是確認(rèn)不含有目標(biāo)抗原的同步處理和使用免疫標(biāo)記染色的組織對(duì)照。 正確的結(jié)果必須是陰性，目的是排除假陽性。 陰性試劑對(duì)照是指用于免疫組化染色的試劑，特別是為了實(shí)證特異性抗體試劑的有效性和可靠性而設(shè)立的同步免疫染色對(duì)照，代替包括空白對(duì)照的吸收試驗(yàn)或抑制試驗(yàn)等。 目的：除假陽性外，證實(shí)所用免疫組織化試劑及其技術(shù)方法的有效性和待檢查切片免疫標(biāo)記陽性結(jié)果的可靠性。 空白對(duì)照是用緩沖液(PBS、TBS等)置換第一抗體(主要根據(jù)需要還可

4、以進(jìn)行第二抗體和交聯(lián)抗體的空白置換)，其他各階段不變的試劑對(duì)照染色，結(jié)果為陰性。 置換對(duì)照是用所用的方法用第一抗體相同動(dòng)物的正常血清或與本實(shí)驗(yàn)無關(guān)的抗體(目標(biāo)生物不足)置換第一抗體，對(duì)其他程序不變的試劑進(jìn)行對(duì)照染色，結(jié)果為陰性。 吸收試驗(yàn)是用事先通過的抗原吸收的第一抗體上清代替第一抗體，對(duì)照其他程序不變的免疫染色試劑。 結(jié)果，陰性或陽性的著色明顯減弱。 抑制試驗(yàn)是以未標(biāo)記抗體和未標(biāo)記抗體(可以是一次抗體、二次抗體或橋抗體)的混合物為試劑，按照其他順序?qū)φ詹蛔兊拿庖呓M織化染色試劑，結(jié)果，陽性著色成比例減弱(等量或1:9 )。 這個(gè)試劑對(duì)比來說多用于直接法。 此類陰性試劑對(duì)照的選擇原則空白對(duì)照不能

5、省略，其他對(duì)照應(yīng)在事前實(shí)驗(yàn)中盡量多做，特別是應(yīng)用新的抗體試劑對(duì)照應(yīng)與實(shí)驗(yàn)片同步染色對(duì)照的結(jié)果應(yīng)附加要求。 自我對(duì)照是指同一標(biāo)記切片上自我組織成分的陰性背景對(duì)照。也就是說，與目標(biāo)抗原陽性反應(yīng)細(xì)胞或成分相鄰的陰性背景結(jié)構(gòu)的發(fā)色應(yīng)該是陰性或著色淺，需要與陽性著色成分鮮明地進(jìn)行對(duì)比。 目的排除內(nèi)源性干擾假陽性和抗原分散移位的錯(cuò)誤結(jié)果。 第三節(jié)非特異染色、非特異染色是免疫組化染色過程中發(fā)生的非目標(biāo)抗原的呈色結(jié)果，假陽性，也稱為背景著色，極大地干擾了免疫組化染色結(jié)果的正確判斷，應(yīng)盡量避免或減輕。 其原因涉及免疫組化染色過程的各個(gè)環(huán)節(jié)，來源于內(nèi)源性干擾(自發(fā)熒光、內(nèi)源性酶、內(nèi)源性生物素等)試劑污染修正方法因

6、原因而異，但根據(jù)事先的實(shí)驗(yàn)，可以采用符合目的的修正對(duì)策，即對(duì)癥療法(因?yàn)闆]有說明具體的修正方法，所以學(xué)生們可以自己閱讀講義p123-126 )。 第四節(jié)陽性標(biāo)記的形態(tài)特征和判斷，免疫組織化標(biāo)記具有一定的形態(tài)特征，熟練掌握有助于正確判斷免疫組織化標(biāo)記結(jié)果。 特征包括定性、定位和定量三個(gè)方面。 免疫發(fā)色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞密度是定性定量指標(biāo)，在實(shí)際工作中用強(qiáng)度和密度結(jié)合的方法綜合計(jì)量，與抗原含量相關(guān)的陽性細(xì)胞著色形態(tài)和組織分布特征主要是定位指標(biāo)，與功能相關(guān)。 一、陽性標(biāo)記免疫特征：弱()、中()、強(qiáng)()、三級(jí)。 免疫熒光法(以FITC為例)表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光、明亮綠色晃眼的熒光的免疫酶標(biāo)記(

7、HRP- DAB/H2O2)，表現(xiàn)為淡黃色微粒、黃褐色微粒、黃褐色粗粒子，后者耀眼。 在一般攝影中，原則上多取強(qiáng)陽性區(qū)域。 二、陽性標(biāo)記細(xì)胞學(xué)特征(以HRP-DAB/H2O2為例)分為細(xì)胞膜型細(xì)胞核型細(xì)胞質(zhì)(漿)型微絨毛型和復(fù)合型(同時(shí)具有細(xì)胞膜-細(xì)胞質(zhì)，同時(shí)具有細(xì)胞核-細(xì)胞質(zhì)或微絨毛-細(xì)胞質(zhì))等5種陽性細(xì)胞型。 雖然這與抗原存在的部位有關(guān)，但必須注意排除組織固定不良引起的抗原擴(kuò)散的幻想，特別是復(fù)合型圖像。三、陽性標(biāo)記組織學(xué)特征(以HRP-DAB/H2O2為例)免疫組織化染色陽性細(xì)胞在組織中的分布序列形式有以下7種：定位型； 彌漫型切片型網(wǎng)眼型腺管型腔緣型和菊?qǐng)F(tuán)型等。 這主要取決于抗原抗體復(fù)合

8、體在細(xì)胞內(nèi)的分布和陽性細(xì)胞在組織內(nèi)的集團(tuán)分布特征。 四、陽性標(biāo)記強(qiáng)度的特征根據(jù)細(xì)胞陽性著色的程度(抗原含量)，弱陽性() 22222222222222222中陽性() 22222222222222222強(qiáng)陽性() 2222222222222222226陽性細(xì)胞的數(shù)量，弱陽性(陽性細(xì)胞總數(shù)為25% 強(qiáng)陽性(指陽性細(xì)胞總數(shù)在50%以上)。 目前，積分綜合計(jì)量被大量采用。 計(jì)算公式為() %x1 ( )%x2 ( )%x3； 合計(jì)值1.5為() 隨機(jī)觀察至少5-10個(gè)HPF。 第五節(jié)染色失敗的可能原因，免疫組織化染色的基本要求是：實(shí)驗(yàn)切片陽性抗原的定位正確，顏色鮮明，背景著色不淺，或者兩者的比例要大于1 (陽性/背景)；對(duì)照染色的結(jié)果要附加要求。 否則，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是錯(cuò)誤的、假陽性的、假陰性的。 假陽性是指實(shí)驗(yàn)切片為陽性，陰性組織對(duì)照或陰性試劑對(duì)照也為陽性的結(jié)果，假陽性。 其原因與內(nèi)源性干擾、試劑雜質(zhì)、交叉反應(yīng)等有關(guān)。 所謂假陰性，是實(shí)驗(yàn)切片為陰性，陽性組織對(duì)照和陰性試劑對(duì)照也是陰性的結(jié)果，稱為假陰性。 其原因與組織處理不當(dāng)、組織細(xì)胞抗原丟失、試劑錯(cuò)誤(如錯(cuò)過、錯(cuò)過、故障、變質(zhì)等)、操作錯(cuò)誤等有關(guān)。對(duì)照結(jié)果判斷：染色失敗原因：均為陰性弱陽性(陰性對(duì)照除外)的背景染色過深陽性對(duì)照好，樣品弱陽性對(duì)照沒有背景，樣品背景深，判斷原則：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)抗體選擇抗原定位性抗原分布不均勻