【生物信息學第二版】基因表達數(shù)據(jù)分析

1、生物信息學,第五章 基因表達數(shù)據(jù)分析,蘇州大學 沈百榮 首都醫(yī)科大學 李冬果,生物信息學,第一節(jié) 引言 Introduction,基因表達組學與基因組學相比較 表達組信息是動態(tài)的； 表達組學的數(shù)據(jù)，更多的是數(shù)值分析； 轉(zhuǎn)錄組學中除了模式識別外，系統(tǒng)建模也十分重要。,真核生物基因表達的基本方式,基因表達調(diào)控示意圖,基因表達的時空性,基因表達測定方法RT-qPCR,近20年來三種不同高通量基因表達測定技術的應用趨勢,高通量基因表達測定的應用實例,1.測定組織特異性基因表達 2.基因功能分類 3.癌癥的分類和預測 4.臨床治療效果預測 5.基因與小分子藥物、疾病之間的關聯(lián) 6.干細胞的全能型、自我更

2、新和細胞命運決定研究,7.動植物的發(fā)育研究 8.環(huán)境對細胞基因表達的作用 9.環(huán)境監(jiān)測 10.物種的繁育,第二節(jié) 基因表達測定平臺與數(shù)據(jù)庫,Microarray Platform and Databases,1.cDNA 芯片 2.Affymetrix芯片 3.下一代測序技術技術如：Roche-454, Illumina MiSeq，Ion Torrent PGM,一、基因表達測定平臺介紹,二、Microarray技術與RNA-Seq技術的比較,1.RNA-Seq技術對沒有已知參考基因組信息的非模式生物，也可測定轉(zhuǎn)錄信息； 2.RNA-Seq技術可以測定轉(zhuǎn)錄邊界的精度達到一個堿基，RNA-Se

3、q可以用來研究復雜的轉(zhuǎn)錄關系； 3.RNA-Seq可以同時測定序列的變異； 4.RNA-Seq背景信號很小，測定的動態(tài)范圍很大。,RNA-Seq在基因表達的定量上準確性很高； RNA-Seq在測定技術上和生物上重復性很高； RNA-Seq的測定需要很少的RNA樣本。 在應用上RNA-Seq技術對ISOFORM的測定和等位基因的區(qū)分比芯片技術有很好的優(yōu)勢。,三、基因表達數(shù)據(jù)庫,疾病相關基因表達數(shù)據(jù)庫,第三節(jié)數(shù)據(jù)預處理與差異表達分析,Preprocessing of Microarray Data and Analysis of Differentially Expression Gene,一、基

4、因芯片數(shù)據(jù)預處理,（一）基因芯片數(shù)據(jù)的提取,cDNA微陣列芯片熒光信號,定性信息提?。篜/A/M（Present/Absent/Marginal） 定量信息提?。夯谔结樇瘏R總后的基因水平的熒光信號強度值,原位合成芯片,（二）數(shù)據(jù)對數(shù)化轉(zhuǎn)換,對芯片數(shù)據(jù)做對數(shù)化轉(zhuǎn)換后，數(shù)據(jù)可近似正態(tài)分布,（三）數(shù)據(jù)過濾,數(shù)據(jù)過濾的目的是去除表達水平是負值或很小的數(shù)據(jù)或者明顯的噪聲數(shù)據(jù)。 過閃耀現(xiàn)象 物理因素導致的信號污染 雜交效能低 點樣問題 其他,（四）補缺失值,1.數(shù)據(jù)缺失類型 非隨機缺失 基因表達豐度過高或過低。 隨機缺失 與基因表達豐度無關，數(shù)據(jù)補缺主要針對隨機缺失情況。,高表達基因的數(shù)據(jù)缺失,2.數(shù)據(jù)

5、補缺方法,（1）簡單補缺法,missing values = 0 expression missing values = 1 expression （arbitrary signal） missing values = row （gene）average missing values = column （array）average,（2）k近鄰法,選擇與具有缺失值基因的k個鄰居基因 用鄰居基因的加權平均估計缺失值 參數(shù) 鄰居個數(shù) 距離函數(shù),（3）回歸法,（五）數(shù)據(jù)標準化,1.為什么要進行數(shù)據(jù)標準化:存在不同來源的系統(tǒng)誤差 染料物理特性差異（熱光敏感性，半衰期等） 染料的結合效率 點樣針差異 數(shù)

6、據(jù)收集過程中的掃描設施 不同芯片間的差異 實驗條件差異,2.運用哪些基因進行標準化處理 芯片上大部分基因（假設芯片上大部分基因在不同條件下表達量相同） 不同條件間穩(wěn)定表達的基因（如持家基因） 控制序列（spiked control） 在不同條件下表達水平相同的合成DNA序列或外源的DNA序列。,3. cDNA芯片數(shù)據(jù)標準化處理,（1）片內(nèi)標化（within-slide normalization）方法 全局標化、熒光強度依賴的標準化、點樣針組內(nèi)標準化。,假設： R=k*G 方法: c=log2k：中值或均值,全局標化（global normalization）,熒光強度依賴的標化（intens

7、ity dependent normalization）,為什么 方法: scatter-plot smoother lowess擬合 c（A）為M 對A 的擬合函數(shù) 標化后的數(shù)據(jù),點樣針依賴的標化（within-print-tip- group normalization）,為什么 一張芯片的不同區(qū)域運用不同的點樣針點樣，從而引入點樣針帶來的系統(tǒng)誤差。 method,（2）染色互換實驗（dye-swap experiment）的標化 實驗組 對照組 芯片1 cy5（R） cy3（G） 芯片2 cy3（G） cy5（R） 前提假設：cc 方法:,線性標化法（linear scaling met

8、hods） 與芯片內(nèi)標化的尺度調(diào)整（scale adjustment）方法類似。 非線性標化法（non-linear methods） 分位數(shù)標化法（quantile normalization） 兩張芯片的表達數(shù)據(jù)的分位數(shù)標化至相同，即分布于對角線上。,（3）片間標化（multiple-slide normalization）,4. 芯片數(shù)據(jù)標準化,對每個探針對計算R R = （PM MM ）/ （PM + MM ） 比較R與定義的閾值Tau（小的正值，默認值為0.015 ） 單側的Wilcoxons Signed Rank test產(chǎn)生p值，根據(jù)p值定義定量信號值 Present call

9、 Marginal call Absent call,（1） 提取定性信號,分析步驟 獲取探針水平數(shù)據(jù)背景值效正標準化處理探針特異背景值效正探針集信號的匯總,（2）提取定量信號,1,分析方法,2,3,4,5,6,M = log2R - log2G A = （log2R + log2G）/2,7,8,9,前面提及的標準化方法僅效正了數(shù)據(jù)分布的中心，在不同的柵格間log-Ratios 的方差也不同。,二、差異表達分析基本原理與方法,（一）倍數(shù)法,實驗條件下的表達值,對照條件下的表達值,通常以2倍差異為閾值，判斷基因是否差異表達,（二）t 檢驗法,運用t 檢驗法可以判斷基因在兩不同條件下的表達差異是

10、否具有顯著性,（三）方差分析,兩種或多種條件間下基因表達量的比較，用方差分析。它將基因在樣本之間的總變異分解為組間變異和組內(nèi)變異兩部分。通過方差分析的假設檢驗判斷組間變異是否存在，如果存在則表明基因在不同條件下的表達有差異。,（四）SAM 法（significance analysis of microarrays）,1. 多重假設檢驗問題 型錯誤（假陽性） 在假設檢驗作推斷結論時，拒絕了實際上正確的檢驗假設，即將無差異表達的基因判斷為差異表達。 型錯誤（假陰性） 不拒絕實際上不正確的，即將有差異表達的基因判斷為無差異表達。,在進行差異基因挑選時，整個差異基因篩選過程需要做成千上萬次假設檢驗，

11、導致假陽性率的累積增大。對于這種多重假設檢驗帶來的放大的假陽性率，需要進行糾正。常用的糾正策略有Bonferroni效正，控制FDR（false discovery rate）值等。,2. 分析步驟 計算統(tǒng)計量 擾動實驗條件，計算擾動后的基因表達的相對差異統(tǒng)計量 計算擾動后的平均相對差異統(tǒng)計量,確定差異表達基因閾值 以最小的正值和最大的負值作為統(tǒng)計閾 值，運用該閾值，統(tǒng)計在值中超 過該閾值的假陽性基因個數(shù)，估計假陽性發(fā)現(xiàn)率FDR值。 調(diào)整FDR值的大小得到差異表達基因。,（五）信息熵,運用信息熵進行差異基因挑選時，不需要用到樣本的類別信息，所以運用信息熵找到的差異基因是指在所有條件下表達波動比

12、較大的基因。,三、差異表達分析應用,以一套阿爾海茨默病相關的基因表達譜數(shù)據(jù)（GSE5281）為例，詳細介紹如何利用BRB-ArrayTools軟件進行數(shù)據(jù)預處理，并對處理過的標準化的基因芯片數(shù)據(jù)利用SAM軟件進行差異表達分析的過程。,GSE5281數(shù)據(jù)是利用Affymetrix公司的寡核苷酸芯片HG-U133 Plus 2.0 Array檢測阿爾海茨默病病人和正常老年人大腦中六個不同區(qū)域的基因表達情況，本例僅選擇其中一個區(qū)域內(nèi)側顳回（middle temporal gyrus,MTG）的數(shù)據(jù)進行說明 。,第一步：導入芯片數(shù)據(jù),使用“import data”下的“General Format I

13、mporter”導入基因芯片數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)間用Tab鍵分隔（或使用Excell文件），也可使用“Data Import Wizard”進行導入 。,導入芯片數(shù)據(jù),第二步：選擇文件類型,每張芯片用單獨的文件存儲,多個文件保存在一個文件夾 “Array are saved in separate files stored in one folder” 若多張芯片數(shù)據(jù)組織成一個矩陣形式,存儲在一個文件中 “Array are saved in horizontally aligned file”,選擇記憶芯片數(shù)據(jù)文件類型,第三步：選擇芯片數(shù)據(jù)文件所存儲的路徑,注意路徑中不能包含中文,第四步：選擇基因芯片

14、平臺,第五步：選擇文件格式,第六步：數(shù)據(jù)的過濾和標準化,第七步：基因注釋,由于基因芯片檢測的是探針的表達情況，而探針和基因之間往往不是一一對應，所以，在數(shù)據(jù)導入后軟件會詢問是否需要進行基因注釋，及是否需要將探針轉(zhuǎn)換成相應的基因名(gene symbol)或Entrez ID,第八步：運行SAM,FDR=0.01, delta=0.68,選出2209個在阿爾海茨默病病人和正常人腦組織中表達發(fā)生顯著性改變的基因。,SAM的參數(shù)設定,第九步：SAM Plot,SAM Plot,第四節(jié) 聚類分析與分類分析,Clustering Analysis and Classification,一、聚類目的,基于

15、物體的相似性將物體分成不同的組,二、基因表達譜數(shù)據(jù)的聚類,對基因進行聚類 識別功能相關的基因 識別基因共表達模式 對樣本進行聚類 質(zhì)量控制 檢查樣本是否按已知類別分組 發(fā)現(xiàn)亞型,樣本,基因,三、距離（相似性）尺度函數(shù),幾何距離 線性相關系數(shù) 非線性相關系數(shù) 互信息,四、聚類算法,層次聚類算法將研究對象按照它們的相似性關系用樹形圖進行呈現(xiàn)，進行層次聚類時不需要預先設定類別個數(shù)，樹狀的聚類結構可以展示嵌套式的類別關系。,（一）層次聚類,在對含非單獨對象的類進行合并或分裂時，常用的類間度量方法。,類間相似性度量方法,2000年Alizadeh等運用基因芯片數(shù)據(jù)，基于層次聚類算法證實了DLBCL腫瘤病

16、人在mRNA層面確實存在兩種亞型,（二）k 均值聚類,基本思想,（三）自組織映射聚類,基本思想 在不斷的學習過程中，輸出層的神經(jīng)元根據(jù)輸入樣本的特點進行權重調(diào)整，最后拓樸結構發(fā)生了改變。,（四）雙向聚類,雙向聚類就是識別基因表達譜矩陣中同質(zhì)的子矩陣，運用特定的基因子類識別樣本子類。,雙向聚類識別同質(zhì)的子結構,五、分類分析,（一）線性判別分類器,（二）k 近鄰分類法,（三）PAM方法 （prediction analysis for microarray）,基本思想 每類樣本的質(zhì)心向所有樣本的質(zhì)心進行收縮，即收縮每個基因的類均值，收縮的數(shù)量由值決定。當收縮過程發(fā)生時，某些基因在不同類中將會有相同

17、的類均值，這些基因就不具有類間的區(qū)別效能。,基因1,基因2,分析步驟,計算統(tǒng)計量 對公式經(jīng)過變換得到,收縮各類的均值,判斷新樣本類別,（四）決策樹,基本思想 決策樹又稱多級分類器，它可以把一個復雜的多類別分類問題轉(zhuǎn)化為若干個簡單的分類問題來解決。 決策樹的結構：一個樹狀的結構，內(nèi)部節(jié)點上選用一個屬性進行分割，每個分叉都是分割的一個部分，葉子節(jié)點表示一個分布。,決策樹應用于腫瘤基因表達譜的分類分析,分析步驟：提取分類規(guī)則，進行分類預測 在構造決策樹的過程中最重要的一點是在每一個分割節(jié)點確定用哪個屬性來分類（或分裂） 這就涉及到關于使用什么準則來衡量使用A屬性比使用B屬性更合理,衡量準則 信息增益

18、information gain 基尼指數(shù)Gini index,決策樹的修剪 消除決策樹的過適應問題 消除訓練集中的異常和噪聲,（五）分類效能評價,1.構建訓練集和檢驗集 n倍交叉驗證（n-fold cross validation） Bagging（bootstrap aggregating） 無放回隨機抽樣 留一法交叉驗證 （leave-one-out cross validation，LOOCV）,2.分類效能 靈敏度（sensitivity，recall） 特異性（specificity） 陽性預測率（positive predictive value，precision） 陰性預測率（negat