促紅生長(zhǎng)素(EPO)PPT幻燈片.ppt

1、促紅生成素,1,目錄,1、促紅生成素的簡(jiǎn)介 2、促紅生成素的作用原理 3、EPO 的應(yīng)用 4、用量用法 5、不良反應(yīng)及禁忌 6、臨床意義 7、 重組EPO 8、重組EPO的生物學(xué)活性檢測(cè) 9、檢驗(yàn)方法 10、EPO的血清檢測(cè) 11、市場(chǎng)前景,2,促紅生成素的簡(jiǎn)介,英文名稱：erythropoietinin; ：在哺乳動(dòng)物腎臟和肝臟產(chǎn)生的一種分子質(zhì)量為46kDa的糖蛋白細(xì)胞因子 。能刺激幼稚紅細(xì)胞的增生，血紅蛋白化和紅細(xì)胞的成熟。 ：由腎臟分泌的調(diào)節(jié)紅系祖細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞因子。,定義1,定義2,3,人體內(nèi)約90%的促紅細(xì)胞生成素由腎臟產(chǎn)生, 對(duì)紅細(xì)胞的正常分裂、發(fā)育和成熟。起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用.,

2、4,促紅生成素的作用原理,EPO是促紅細(xì)胞生成素的英文簡(jiǎn)稱。人體中的促紅細(xì)胞生成素是由腎臟和肝臟分泌的一種激素樣物質(zhì)，能夠促進(jìn)紅細(xì)胞生成。服用紅細(xì)胞生成素可以使患腎病貧血的病人增加血流比溶度（即增加血液中紅細(xì)胞百分比）。人體缺氧時(shí)，此種激素生成增加，并導(dǎo)致紅細(xì)胞增生。,5,EPO 的應(yīng)用,EPO興奮劑是根據(jù)促紅細(xì)胞生成素的原理人工合成，它能促進(jìn)肌肉中氧氣運(yùn)輸，從而使肌肉更有勁、工作時(shí)間更長(zhǎng).,6,在2008年北京奧運(yùn)會(huì)中第一例的興奮劑檢查呈陽(yáng)性的西班牙自行車(chē)選手瑪麗亞莫里諾，就是被發(fā)現(xiàn)使用使用促紅細(xì)胞生成素(EPO)，國(guó)際奧委會(huì)于2008年8月11日宣布取消其參賽資格。,應(yīng)用案例,7,EPO作

3、為興奮劑的使用,8,其它應(yīng)用,：促進(jìn)新血管的形成和減少心肌 梗塞面積，控制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而保護(hù)以及組織免受缺氧、毒素及氧化應(yīng)激系統(tǒng)誘導(dǎo)損傷。 ：抑制細(xì)胞表面炎癥因子，降低正常細(xì)胞對(duì)炎癥效應(yīng)。 :作用于小腸內(nèi)膜表面EPO受體，促粘膜增生發(fā)育，繼而小腸對(duì)脂類(lèi) 及氨基酸類(lèi)物質(zhì)吸收功能。,1、對(duì)心臟的作用,2、抑制炎癥,3、抑制炎癥,9,用量用法,靜脈注射開(kāi)始應(yīng)用較低劑量50100IU/kg，每周3次，如果在4周內(nèi)，網(wǎng)狀紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血細(xì)胞比容和血紅蛋白水平未見(jiàn)明顯增加，本品的劑量可遞增,10,不良反應(yīng)及禁忌,常見(jiàn)有血壓升高、心悸。偶見(jiàn)瘙癢感、皮疹及GOT或GPT值升高、惡心、嘔吐、眩暈、頭痛、發(fā)熱、血鉀

4、升高等。 血液透析不能控制動(dòng)脈血壓升高的患者、鉛中毒及感染患者禁用，有藥物過(guò)敏者、變態(tài)反應(yīng)體質(zhì)者慎用。應(yīng)及時(shí)對(duì)用本品治療者的血壓進(jìn)行監(jiān)測(cè)，必要時(shí)給抗高血壓藥物。應(yīng)注意血管栓塞情況，有時(shí)需增加肝素的劑量。必要時(shí)補(bǔ)鐵，使患者的轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度維持在20%以上,谷丙轉(zhuǎn)氨酶,天 冬 氨 酸 轉(zhuǎn) 氨 酶,11,1腎性貧血患者EPO水平較低，在進(jìn)行治療過(guò)程中，往往通過(guò)注射EPO來(lái)提高體內(nèi)EPO水平進(jìn)行治療，從而幫助病人增加紅細(xì)胞數(shù)量，此時(shí)EPO水平有所上升。 2其他貧血如缺鐵性貧血、巨細(xì)胞性貧血患者EPO水平不降低，但也可以使用EPO治療，此時(shí)濃度也會(huì)有所升高 3. 生障礙性貧血和骨髓造血功能不全患者EPO

5、水平升高。,臨床意義,12,重組EPO 天然的 hEPO制品一般是從貧血病患者尿中提取的，所以藥源極為匱乏，不能滿足需要。因此，在20世紀(jì)80年代就開(kāi)始rhEPO的研究，從胎兒肝中克隆出 人促紅細(xì)胞生成素基因, 并研制成功 重組人EPO。 目前國(guó)內(nèi)外在獲取EPO基因后，首選中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)表達(dá)生產(chǎn)重組人EPO。,13,重組人促紅素注射液（CHO細(xì)胞）,【商品名】益比奧 【規(guī)格】1萬(wàn)國(guó)級(jí)單位/瓶 【生產(chǎn)廠家】沈陽(yáng)三生制藥 【成分】重組人促紅素。輔料：人血白蛋白、氯化鈉、一水枸櫞酸、二水枸櫞酸三鈉,14,構(gòu)建基因組噬菌體文庫(kù)克隆EPO基因,血細(xì)胞 中提取基 因組DNA,篩選完整

6、EPO 基因的插 入片段,轉(zhuǎn)入CHO 中表達(dá)。,PCR方法 從基因組模板 中擴(kuò)增EPO基 因片段為探針,BamH酶切,回收酶切片段,構(gòu)建基因組 噬菌體文庫(kù),插入噬菌體 EMBL3載體,克隆,15,重組EPO的生物學(xué)活性檢測(cè),正常功能狀況下，EPO的主要生物學(xué)性狀是增加紅細(xì)胞的產(chǎn)生，因此紅細(xì)胞數(shù)目的增多，血紅蛋白含量的增加及紅細(xì)胞壓積的改變，此三項(xiàng)指標(biāo)可以用于反映EPO的體內(nèi)生物學(xué)活性，這也是比較特異性的檢測(cè)指標(biāo)。,16,檢驗(yàn)方法,可由SD大鼠來(lái)完成。其大致做法為：一周兩次，連續(xù)3周對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下注射rHuEPO；實(shí)驗(yàn)對(duì)照組則同等劑量的生理鹽水，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋

7、白含量及血球壓積，以確定rHuEPO的體內(nèi)生物學(xué)活性。,17,檢驗(yàn)結(jié)果記錄,18,EPO的血清檢測(cè),采用酶免檢測(cè)試劑盒檢測(cè)。,19,檢測(cè)原理,采用雙抗體夾心法檢測(cè)EPO。兩種不同的抗體，分別包被微孔板和標(biāo)記HRP酶。當(dāng) 標(biāo)本中含有相應(yīng)的抗原時(shí)，會(huì)形成抗體-抗原-抗體-酶的復(fù)合物。未結(jié)合的物質(zhì)通過(guò)洗滌去除。加入顯色底物顯 色，通過(guò)測(cè)量顏色的變化來(lái)判斷標(biāo)本中抗原的濃度。,20,酶聯(lián)反應(yīng),21,檢驗(yàn)步驟,1 準(zhǔn)備 (1).測(cè)試前將試劑盒組分置于室溫(18- 25)平衡30分鐘，測(cè)試后應(yīng)立即放回2-8保存。 (2).如果EPO濃度高于160mU/ml，稀釋后檢測(cè)。,22,2、反應(yīng) (1).取出所需要的

8、板條。 (2).分別向孔中加入50l標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控血清或標(biāo)本。 (3).每孔中加入50l酶結(jié)合物。震動(dòng)10-20秒混勻。 (4).37孵育30分鐘。 (5).扣除孔中液體，并用洗液洗滌5次。 (6).在干凈的紙巾或毛巾上拍干，盡量去除殘留的水分。,23,3、顯色 (1).每孔各加入1滴顯色底物A和B，置于室溫(18-25)避光顯色15分鐘。 (2).每孔加入1滴終止液，輕輕震動(dòng)幾次混勻。 (3).在30分鐘內(nèi)，以630nm作為參考波長(zhǎng)，測(cè)量450nm處的吸光度(A450)。,24,4，計(jì)算,（1).以標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度為Y軸，濃度為X軸作圖。 （2).根據(jù)質(zhì)控血清和標(biāo)本的吸光度值，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上反算EPO的濃度。 （3).如果樣品經(jīng)過(guò)稀釋，在計(jì)算其濃度時(shí)應(yīng)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。,25,曲線圖,26,1989年安進(jìn)公司的第一個(gè)基因重組藥物Epogen獲得FDA的批準(zhǔn)，1999年銷(xiāo)售值達(dá)到17.6億美元，2000年19.6億美元，2002年22.6億美元，2003年24.4億美元，成為名副其實(shí)的“重磅炸彈”基因藥物2001年，EPO（包括Arnesp）的全球銷(xiāo)售額達(dá)21.1億美元，2002