精品]分子熒光分析法

1、第五章分子熒光分析法、熒光自然段中存在這樣的物質(zhì)，如果吸收外界的能量，就會(huì)發(fā)出與不同波長(zhǎng)不同強(qiáng)度的光，外界的能量一旦消失，該光也會(huì)消失。 這種光叫做熒光。 從外部供給能量的方式有光照射、加熱、化學(xué)反應(yīng)、生物代謝等各種方式。 由光的激發(fā)產(chǎn)生的熒光稱為光致發(fā)光。 根據(jù)激發(fā)光的波長(zhǎng)，熒光可以分為放射性射線熒光、紫外可見熒光、紅外熒光等。 根據(jù)發(fā)出熒光的粒子，熒光分為分子熒光和原子熒光。 因物質(zhì)不同，其組成和結(jié)構(gòu)也不同，所吸收的光的波長(zhǎng)和發(fā)出的光的波長(zhǎng)也不同，利用這個(gè)特性可以進(jìn)行物質(zhì)的定性鑒別。 該物質(zhì)的濃度不同時(shí)，發(fā)光的熒光強(qiáng)度不同，可以測(cè)定物質(zhì)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定。 熒光分析法是利用物質(zhì)的熒光特

2、征和強(qiáng)度，進(jìn)行物質(zhì)定性和量化分析的方法。 熒光分析法的特點(diǎn)是靈敏度高、選擇性好、樣品用量少、操作簡(jiǎn)便。 其靈敏度通常比分光光度法高23位數(shù)。 在衛(wèi)生檢查、環(huán)境及食品分析、藥物分析、生化和臨床檢查等方面應(yīng)用廣泛。 第一節(jié)的基本原理，一、熒光的產(chǎn)生，物質(zhì)分子的能級(jí)包括一系列電子能級(jí)、振動(dòng)能級(jí)和旋轉(zhuǎn)能級(jí)。 分子吸收能量后，從基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向第一電子激發(fā)態(tài)或更高級(jí)電子激發(fā)態(tài)的不同振動(dòng)能級(jí)(該過(guò)程速度快，約10-15 s )遷移，激發(fā)單線態(tài)分子。 激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定，可以通過(guò)以下幾種方法釋放能量回到基態(tài)。 1 .振動(dòng)弛豫這一過(guò)程是指在同一電子能級(jí)內(nèi)，即分子因碰撞而熱損失一部分能量，只能從高振動(dòng)動(dòng)能級(jí)發(fā)

3、生到該電子能級(jí)的最低振動(dòng)能級(jí)。 這個(gè)能量的一部分不是作為光放射，而是作為熱放出，所以振動(dòng)緩和是無(wú)放射遷移。 2 .內(nèi)變換即激發(fā)態(tài)分子將多能量轉(zhuǎn)換為熱能，從高電子能級(jí)下降到低電子能級(jí)。 內(nèi)部變換也是無(wú)輻射轉(zhuǎn)變。 3 .熒光高的激發(fā)態(tài)分子由于無(wú)輻射躍遷下降到第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)后，仍不穩(wěn)定，在短時(shí)間停留后(約10-8 s，稱為熒光壽命)，以光輻射的形式釋放能量，返回基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)。 此時(shí)發(fā)出的光稱為熒光。 當(dāng)然，也可以不用輻射轉(zhuǎn)變就回到基態(tài)。 4、系間竄漏瓦斯氣體的一些物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子由于振動(dòng)弛豫和內(nèi)轉(zhuǎn)換下降到第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)并有可能經(jīng)由另一個(gè)無(wú)輻射遷移轉(zhuǎn)移到激發(fā)三重態(tài)，

4、該過(guò)程伴隨有大頭針?lè)较虻淖兓环Q為系間竄漏瓦斯氣體. 在大多數(shù)物質(zhì)中，系間跳躍是被禁止的。 分子中存在重原子(例如I、Br等)時(shí)，通過(guò)大頭針軌道的強(qiáng)耦合作用，可以改變電子的大頭針?lè)较?，系統(tǒng)間的竄漏瓦斯氣體變得容易。 5 .磷光經(jīng)系統(tǒng)間的broby瓦斯氣體分子由于振動(dòng)緩和而下降到激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，在有會(huì)兒滯留(10-410 s，稱為磷光壽命)，然后以光放射的形式放出能量返回到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)，此時(shí)發(fā)出的光稱為磷光(phosphorescence )。 由于激發(fā)的三重態(tài)能量低于激發(fā)的單重態(tài)最低振動(dòng)態(tài)能量，磷光放射的能量小于熒光，也就是磷光的波長(zhǎng)長(zhǎng)于熒光。 二、激發(fā)光譜和熒光色光譜；(一)

5、熒光檢測(cè)，光源發(fā)出的紫外可見光根據(jù)激發(fā)單色器分離不同波長(zhǎng)的激發(fā)光，照射樣品溶液，激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光。 來(lái)自樣本的熒光是寬帶光譜，并且必須在對(duì)單色器進(jìn)行分光之后進(jìn)入檢測(cè)器，以檢測(cè)在不同發(fā)光波長(zhǎng)的熒光強(qiáng)度f(wàn)。 由于激發(fā)光不能完全被吸收，所以可以透過(guò)溶液，為了防止透過(guò)光對(duì)熒光測(cè)量的干擾作用，大多在與激發(fā)光垂直的方向上檢測(cè)熒光(因?yàn)闊晒庀蛩蟹较蚍派?。(二)激發(fā)光譜和熒光色光譜的形成，任何熒光物質(zhì)都有激發(fā)光譜和熒光發(fā)射色光譜的兩個(gè)特征光譜。主要是熒光光譜。 1 .保持所激發(fā)光譜的熒光發(fā)射波長(zhǎng)(即，固定發(fā)射單色器)，并順序改變激發(fā)光波長(zhǎng)(即，調(diào)節(jié)激發(fā)單色器)，并且測(cè)量從具有不同波長(zhǎng)的激發(fā)光所獲得的熒光強(qiáng)

6、度f(wàn) (即，激發(fā)光波長(zhǎng)掃描)。 當(dāng)激勵(lì)光的波長(zhǎng)繪制在橫軸上，熒光強(qiáng)度f(wàn)繪制在縱軸上時(shí)，得到該熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜。 與激發(fā)光譜上熒光強(qiáng)度的最大值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)是最大激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)熒光是最敏銳的波長(zhǎng)。 物質(zhì)的激發(fā)光譜與其吸收譜相似，但縱軸不同。 2 .熒光色光譜熒光色光譜，也稱為發(fā)光色光譜。 直接改變激發(fā)光的波長(zhǎng)(即固定激發(fā)單色器)，依次改變熒光發(fā)光波長(zhǎng)，測(cè)定試料以不同波長(zhǎng)發(fā)光的熒光強(qiáng)度f(wàn)。 繪制發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，熒光強(qiáng)度f(wàn)為縱坐標(biāo)，得到熒光發(fā)光色光譜。 與熒光發(fā)光色光譜中熒光強(qiáng)度的最大值對(duì)應(yīng)的波長(zhǎng)是最大發(fā)光波長(zhǎng)。 (3)熒光色光譜和激發(fā)光譜的關(guān)系，1 .熒光色光譜形狀與激發(fā)光波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，由于熒光是分子

7、從第一電子激發(fā)狀態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回到基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)時(shí)發(fā)出的光放射，因此與分子被哪個(gè)電子激發(fā)狀態(tài)無(wú)關(guān)。 2 .熒光色光譜比通過(guò)激發(fā)光譜波長(zhǎng)較長(zhǎng)的分子吸收激發(fā)光激發(fā)為高激發(fā)狀態(tài)后，先通過(guò)無(wú)輻射遷移(振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換)失去一部分能量，達(dá)到第一電子激發(fā)狀態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，由此發(fā)出熒光。 因此，熒光發(fā)光能量比激發(fā)光能量低，熒光色光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光波長(zhǎng)長(zhǎng)。 3 .鏡像對(duì)稱相對(duì)于高度對(duì)稱的有機(jī)分子，熒光色光譜和吸收譜呈鏡像對(duì)稱的關(guān)系。 說(shuō)明1 :能級(jí)結(jié)構(gòu)相似性熒光是第一電子激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)遷移形成的，其形狀與基態(tài)振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 激發(fā)光譜是基底狀態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向第一電子激勵(lì)

8、單重態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)遷移而形成的，其形狀與第一電子激勵(lì)單重態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布有關(guān)。 激發(fā)態(tài)和基態(tài)的振動(dòng)能級(jí)分布因?yàn)橄嗨菩远R像對(duì)稱。 三、影響熒光產(chǎn)生及熒光強(qiáng)度的因素，(一)物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件，一種物質(zhì)能否產(chǎn)生熒光及熒光強(qiáng)度的高低，與其分子結(jié)構(gòu)及場(chǎng)所環(huán)境密切相關(guān)。 所有能發(fā)熒光的物質(zhì)對(duì)云同步都必須具備兩個(gè)條件：1.物質(zhì)分子需要強(qiáng)的紫外吸收(*遷移)，2 .物質(zhì)具有高熒光效率(fluorescence efficiency )。 熒光效率也稱為熒光量子產(chǎn)率，用f表示。 研究表明，增加kF、降低其他失活常數(shù)的因素均能夠增加熒光量子產(chǎn)率。 通常，kF由分子結(jié)構(gòu)(內(nèi)因)確定，其它殘奧儀由化學(xué)環(huán)境和結(jié)構(gòu)

9、確定。 (2)熒光及影響其強(qiáng)度的因素。 轉(zhuǎn)變類型：如上所述，為了產(chǎn)生熒光，紫外可見區(qū)域需要強(qiáng)吸收和高熒光效率。 有遷移的分子有很強(qiáng)的吸收。 遷移的大小。 共軛效應(yīng)：能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)大多含有芳香環(huán)或雜環(huán)，具有共軛*遷移。 其共軛度越大熒光效率也越大，最大激發(fā)發(fā)光波長(zhǎng)像苯、萘、蒽3種物質(zhì)那樣在長(zhǎng)波長(zhǎng)方向上移動(dòng)。 剛性平面結(jié)構(gòu)：熒光分子的共軛程度相同，分子的剛性和共面性越大，熒光效率越大。 有些物質(zhì)本身會(huì)發(fā)出熒光或熒光弱，與金屬絡(luò)離子形成配合物后，剛性和共面增加，可以發(fā)出熒光或增強(qiáng)熒光。 例如8 -喹啉醇是弱熒光物質(zhì)，利用與Mg2、Al3等金屬絡(luò)離子的絡(luò)合物的熒光增強(qiáng)，可以間接地測(cè)定金屬絡(luò)離子。 取

10、代化學(xué)基熒光分子上的各種取代化學(xué)基對(duì)分子的熒光色光譜和熒光強(qiáng)度有很大影響。NH2、OH、OCH3、CN、NHR、NR2等供電子取代化學(xué)基可以增加分子的電子共軛度，提高熒光效率。 另一方面，-COOH、NO2、C=O、f、Cl等吸電子置換化學(xué)基可以減弱分子電子的共軛性，減弱或熄滅熒光。 另一種置換化學(xué)基對(duì)熒光的影響不明顯，如r、SO3H、NH3等。 溫度對(duì)被測(cè)溶液的熒光強(qiáng)度有顯著影響。 溫度上升時(shí)，介質(zhì)黏性系數(shù)減少，分子運(yùn)動(dòng)加快，分子間碰撞概率增加，分子的無(wú)輻射遷移增加，熒光效率降低。 降低溫度有利于提高熒光效率和熒光強(qiáng)度。 由于熒光機(jī)器光源的光強(qiáng)度大，溫度高，容易引起溶液溫度的上升，分析中室溫

11、變化，熒光強(qiáng)度可能變化。 另外，根據(jù)熒光物質(zhì)的溶液，如果長(zhǎng)時(shí)間照射激發(fā)光，則會(huì)發(fā)生光分解，熒光強(qiáng)度有時(shí)會(huì)降低。 因此，試料不應(yīng)長(zhǎng)時(shí)間受光照射，僅在測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí)打開快門優(yōu)先，其佝僂時(shí)間必須關(guān)閉。 在高級(jí)熒光分光光度修正中，在試料室的周圍設(shè)置冷卻水茄克衫或恒溫裝置，使溶液的溫度在測(cè)定中保持一定。 溶劑：相同的熒光物質(zhì)在不同的溶劑中，其熒光色光譜的位置和熒光強(qiáng)度可能有一定的差異。 特別是在這些分子中含有極性取代化學(xué)基的熒光物質(zhì)，它們的熒光色光譜容易受到溶劑的影響。 溶劑的影響可分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)。 一般的溶劑效果是指溶劑極性的影響。 通常，隨著溶劑極性變大，*遷移所需的能量差e變小，躍

12、遷幾率增加，熒光波長(zhǎng)變長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度增大。 特殊溶劑效應(yīng)是指溶劑和熒光物質(zhì)形成化合物，溶劑改變熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)，使熒光峰值的波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度發(fā)生很大變化。 在萘胺的乙醇溶液中加入鹽酸后，隨著溶液中鹽酸濃度的增加，萘胺的NH2化學(xué)基被NH3Cl化學(xué)基取代，NH3Cl化學(xué)基對(duì)萘環(huán)特征頻率的影響小于NH2，因此溶液的熒光色光譜接近萘的熒光色光譜。 pH值：溶液的酸度(pH值)對(duì)熒光物質(zhì)的影響可以分為兩個(gè)方面： 1熒光物質(zhì)本身是弱酸性或弱堿性時(shí)，溶液的pH值發(fā)生變化，物質(zhì)分子與其絡(luò)離子的平衡也發(fā)生變化，而不同的體分別具有特定的熒光色光譜和熒光效率。 例如，在苯胺、2 .金屬絡(luò)離子和有機(jī)試劑生成的熒光絡(luò)合

13、物中，溶液的pH的變化影響絡(luò)合物的組成，影響它們的熒光特性。 例如，Ga3絡(luò)離子和鄰二羥基偶氮苯在pH34的溶液中形成1:1絡(luò)合物，可以產(chǎn)生熒光。 在pH67的溶液中，形成12個(gè)配合物，不產(chǎn)生熒光。 總之，溶液的pH值影響熒光物質(zhì)的熒光色光譜、熒光效率和熒光強(qiáng)度。 在條件實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)pH與熒光強(qiáng)度的關(guān)系，為提高分析的靈敏度和精準(zhǔn)性有必要確定最合適的pH范圍。 由于熒光熄滅熒光物質(zhì)的分子間或與其他物質(zhì)的相互作用，熒光強(qiáng)度顯著降低的現(xiàn)象稱為熒光熄滅或消光。 引起熒光的熄滅的物質(zhì)被稱為鹵素絡(luò)離子、重金屬絡(luò)離子、氧分子、硝基化合物、二偶氮化物、羧基化合物等的熒光熄滅劑。 熒光熄滅的原因有多種多樣： (1

14、)激發(fā)狀態(tài)的熒光分子與滅火劑分子碰撞，將能量轉(zhuǎn)移到滅火劑中來(lái)熄滅熒光；(2)通過(guò)熒光分子與滅火劑分子的作用，自身生成發(fā)光配合物溶液濃度越高自滅現(xiàn)象越嚴(yán)重(5)溶解于溶液中的氧分子幾乎所有熒光物質(zhì)都會(huì)引起不同程度的熒光滅燈。 熒光燈是熒光分析的不利因素。但是，如果某熒光物質(zhì)在加入某個(gè)滅火劑后，熒光強(qiáng)度的減少與滅火劑的濃度呈直線關(guān)系，則可以利用該性質(zhì)建立滅火劑的熒光分析法，稱為熒光熄滅法。 熒光熄滅法比直接熒光法敏銳、有選擇性。 例如，鋁桑色素絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度由于微量的氟絡(luò)離子的存在而引起熒光消失，可以利用該性質(zhì)測(cè)定試樣中微量的氟絡(luò)離子的含量，此時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度與氟絡(luò)離子濃度成反比。 散射光(sc

15、attering light )是一種光照射到被測(cè)溶液，其中的一部分光被吸收而發(fā)出熒光，一部分光透過(guò)溶液，一部分光因光子和溶劑分子的碰撞而使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生變化，向不同的方向散射，稱為散射光。 1 .瑞利(Reyleigh )散射光光子與物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞，使能量不發(fā)生交換，只是光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生變化，其波長(zhǎng)和激發(fā)光相同，因此將該散射光稱為瑞利散射光。 其強(qiáng)度與波長(zhǎng)的四次方成反比，即波長(zhǎng)越短，瑞利散射越強(qiáng)。 但是，瑞穗散射光的波長(zhǎng)與激發(fā)光的波長(zhǎng)相同，選擇適當(dāng)?shù)臒晒鉁y(cè)量波長(zhǎng)或選擇過(guò)濾煙嘴即可消除其影響。 2 .受激喇曼散射光子和溶劑分子非彈性碰撞，運(yùn)動(dòng)方向變化時(shí)，在云同步中，光子和溶劑分子發(fā)

16、生能量交換，使光子能量減少或增加，光的波長(zhǎng)增加或縮短，兩散射光都稱為拉曼(散射)光。 其中波長(zhǎng)長(zhǎng)的拉曼光，因?yàn)槠洳ㄩL(zhǎng)接近物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)，所以對(duì)測(cè)量的干擾作用大。 拉曼光的波長(zhǎng)根據(jù)激發(fā)光的波長(zhǎng)而變化，但熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)與激發(fā)光的波長(zhǎng)無(wú)關(guān)，因此通過(guò)選擇適當(dāng)?shù)募ぐl(fā)光的波長(zhǎng)，能夠區(qū)分兩者。散射光譜、散射光譜、第二節(jié)定性量化分析、一、熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系、分光光度法測(cè)定物質(zhì)對(duì)光的吸收程度的熒光分析法是測(cè)定物質(zhì)吸收一定頻率的光后，物質(zhì)自身發(fā)出的熒光強(qiáng)度。 溶液中的熒光物質(zhì)被入射光激發(fā)時(shí)，可以在各個(gè)方向觀察到熒光，但是激發(fā)光的一部分會(huì)透過(guò)溶液，因此在透射光方向觀察熒光是不合適的，一般在與透射光垂直的方

17、向觀察熒光。 測(cè)量熒光強(qiáng)度時(shí)，選擇兩個(gè)不同的波長(zhǎng)。 一種是物質(zhì)吸收的光，即激發(fā)光的波長(zhǎng)；另一種是被激發(fā)的物質(zhì)發(fā)出的光，即熒光的波長(zhǎng)。 溶液的熒光強(qiáng)度與該溶液對(duì)光的吸收程度及溶液中熒光物質(zhì)的熒光效率有關(guān)。 根據(jù)Beer定律，溶液的熒光強(qiáng)度與溶液的光吸收的程度和熒光效率成比例，即，在abc0.05 (即，溶液薄)的情況下，對(duì)于給定的熒光物質(zhì)測(cè)量條件是給定的，即，給定的熒光物質(zhì)的稀溶液(abc0.05 )，這是熒光分析的定量基礎(chǔ)。 二、定性分析、熒光物質(zhì)的特征光譜包含激發(fā)光譜和熒光色光譜，因此用它鑒定物質(zhì)比吸收譜更可靠。 您可以選擇這樣的格式：您可以選擇這樣的格式：您可以選擇這樣的格式。 第三節(jié)設(shè)備

18、、一、設(shè)備的結(jié)構(gòu)和原理、設(shè)備類型很多，基本結(jié)構(gòu)類似，一般包括激勵(lì)光源、單色器、樣品單元、檢測(cè)器和記錄顯示部分五個(gè)部分。 1 .光源能夠發(fā)出從紫外到可見區(qū)域的波長(zhǎng)的光，強(qiáng)度大，穩(wěn)定。 常用的是元素溴鎢絲燈，高壓水銀燈，氙燈泡。 2 .單色器2個(gè)單色器，3 .樣品池通常為灰水晶制，4 .檢測(cè)器光電子倍增管，2，儀器類型1 .光電熒光校正用過(guò)濾煙嘴為單色器(激勵(lì)過(guò)濾煙嘴和熒光濾鏡)，溴化鎢絲燈，或高壓水銀燈為檢具。 2 .熒光光譜光度校正以氙燈泡為光源，以光柵為單色器，光電子倍增管為檢測(cè)器?？梢赃B續(xù)地掃描激發(fā)光譜和熒光色光譜。 第五節(jié)熒光分析法的應(yīng)用，(1)有機(jī)物的熒光分析，由于其熒光分析的高靈敏度、高選擇性，將在醫(yī)學(xué)