實(shí)驗(yàn)10-糖核酸化學(xué).ppt

1、糖與核酸化學(xué),第一節(jié) 概述,糖的元素組成： 由C、 H、 O三種元素組成； 糖的化學(xué)本質(zhì)： 多羥基醛、多羥基酮或其衍生物，或水解能夠產(chǎn)生這些化合物的物質(zhì)； 核酸的元素組成：含C 、H、O、 N 和P,核酸的化學(xué)本質(zhì)：,二糖（雙糖） 蔗糖 Glc(1-2 ) Fru 乳糖 Gal (1-4)Glc 麥芽糖 Glc(1-4)Glc,多糖,由許多單糖單位構(gòu)成的高分子化合物，大多不溶于水，多屬于非還原糖；有旋光性、無變旋現(xiàn)象；無甜味；一般不能結(jié)晶。,第二節(jié) 理化性質(zhì),一 、糖的物理性質(zhì) （一）溶解度 單糖、雙糖、低聚糖、糊精都溶于水；淀粉、纖維素不溶 。 （二）旋光性（opticity）：能使平面偏振

2、光的振動(dòng)平面旋轉(zhuǎn) 。 （三）變旋現(xiàn)象（mutarotation）：其旋光度會(huì)由剛配制時(shí)的一個(gè)數(shù)值逐漸改變而達(dá)到某恒定值 。,二、 糖的化學(xué)性質(zhì) （一）單糖的化學(xué)性質(zhì)：由羰基、羥基及半縮醛基（或半縮酮基）產(chǎn)生。 1由羥基產(chǎn)生的性質(zhì)： 脫水反應(yīng)：可以用來鑒定糖和區(qū)分醛糖和酮糖。 紫環(huán)反應(yīng) ：鑒定糖類最常用的顏色反應(yīng)。戊糖和己糖與強(qiáng)酸共熱分別生成糠醛和羥甲基糠醛，可以與- 萘酚作用，形成紅紫色復(fù)合物。 酯化反應(yīng)：羥基能與酸作用生成酯。 成苷反應(yīng)：糖的半縮醛羥基與醇及酚（氫供體）的羥基反應(yīng)失水而成的物質(zhì)稱糖苷。由糖和非糖兩部分組成。,2由醛基或酮基產(chǎn)生的性質(zhì),氧化反應(yīng)：凡是能被托倫試劑和費(fèi)林試劑氧化的

3、糖叫做還原糖，不能被氧化的糖叫做非還原糖。,用溴水來區(qū)別醛糖和酮糖：,還原反應(yīng)：糖中的羰基被還原成羥基，形成相應(yīng)的多羥基醇。,成脎反應(yīng)：?jiǎn)翁欠肿优c三分子苯肼作用，生成的產(chǎn)物叫做糖脎（黃色晶體 ）；成脎反應(yīng)只在單糖分子的C-1和C-2上發(fā)生，不涉及其它碳原子；不同的脎具有特定的結(jié)晶形狀和一定的熔點(diǎn)，以此來鑒別不同的糖。,3低聚糖的化學(xué)性質(zhì),蔗糖：屬于非還原糖。既不能被托倫試劑及費(fèi)林試劑氧化，也不能與苯肼作用生成糖脎，無變旋現(xiàn)象。 麥芽糖：淀粉在-淀粉糖化酶作用下水解可得到麥芽糖 ，后者再水解得到兩分子的 D-葡萄糖。麥芽糖是還原糖，可使 Tollers及Benedict試劑試劑還原，并可與苯肼生

4、成脎，用溴水氧化麥芽糖時(shí)生成麥芽糖酸。,4多糖的化學(xué)性質(zhì),無甜味，在水中不能形成真溶液，只能形成膠體，無還原性，無變旋性，但有旋光性。 淀粉：20直鏈淀粉（溶于水）和80支鏈淀粉（不溶于水）的混合物。 水解： 淀粉 糊精 麥芽糖 葡萄糖,淀粉（starch）,直鏈淀粉： -1、4-糖苷鍵構(gòu)成的直鏈結(jié)構(gòu) ； 支鏈淀粉： 多個(gè)較短的-1、4-糖苷鍵直鏈通過-1、6-糖苷鍵結(jié)合而成的 。,糖原：人與動(dòng)物體內(nèi)貯存的一種多糖，分為肌糖原和肝糖原，水解的最終產(chǎn)物是D-葡萄糖，與碘作用呈現(xiàn)紫紅色或藍(lán)紫色。 纖維素：無色、無味、不溶于水及一般的有機(jī)溶劑，也不具有還原性；較淀粉難于水解，在酸性條件下水解纖維素可

5、得纖維四糖、三糖、二糖等，最后水解產(chǎn)物為 D-(+)-葡萄糖。 人類沒有-1,4-苷鍵的水解酶，而食草動(dòng)物體內(nèi)存在，故而人類不能消化纖維素。,纖維素（cellulose）,纖維素是線性葡聚糖，是由-D-葡萄糖借助-1、4-糖苷鍵連接而成的直鏈同聚糖 ； 是植物的結(jié)構(gòu)多糖，是支持細(xì)胞和組織的重要成分。,核酸的性質(zhì),（一）一般理化性質(zhì),1.為兩性電解質(zhì)，通常表現(xiàn)為酸性。,2.DNA為白色纖維狀固體，RNA為白色粉末，不溶于有機(jī)溶劑。,3.DNA溶液的粘度極高，而RNA溶液要小得多。,4.RNA能在室溫條件下被稀堿水解而DNA對(duì)堿穩(wěn)定。,5.利用核糖和脫氧核糖不同的顯色反應(yīng)鑒定DNA與RNA。,（二

6、）核酸的紫外吸收性質(zhì),核酸的堿基具有共扼雙鍵，因而有紫外吸收性質(zhì)，吸收峰在260nm（蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm）。,核酸的光吸收值比各核苷酸光吸收值的和少3040%，當(dāng)核酸變性或降解時(shí)光吸收值顯著增加（增色效應(yīng)），但核酸復(fù)性后，光吸收值又回復(fù)到原有水平（減色效應(yīng)）。,（三）核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性,1.堿基對(duì)間的氫鍵；2.堿基堆積力；3.環(huán)境中的正離子。,（四）核酸的的變性,：雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，形成單鏈無規(guī)線團(tuán)狀，只涉及次級(jí)鍵的破壞。,DNA變性是個(gè)突變過程，類似結(jié)晶的熔解。將紫外吸收的增加量達(dá)到最大增量一半時(shí)的溫度稱熔解溫度(melting temperature, Tm)。,T

7、m,Tm,影響Tm的因素：,（1）G-C的相對(duì)含量 （G+C）% =（Tm 69.3） 2.44,（2）介質(zhì)離子強(qiáng)度低，Tm低。,（3）高pH下堿基廣泛去質(zhì)子而喪失形成氫鍵的能力。,（4）變性劑如甲酰胺、尿素、甲醛等破壞氫鍵，妨礙堿基堆積，使Tm下降。,（五）核酸的復(fù)性（退火）,變性核酸的互補(bǔ)鏈在適當(dāng)條件下重新締合成雙螺旋的過程。,影響復(fù)性速度的因素：,（1）單鏈片段濃度,（2）單鏈片段的大小,（3）片段內(nèi)重復(fù)序列的多少,（4）溶液離子強(qiáng)度的大小,（5）溶液溫度的高低 （T 25）,第三節(jié) 提取和分離方法,單糖、低聚糖：用水、醇、稀醇粗提，回收溶劑后依次用不同極性有機(jī)溶劑萃取。 注意：取材新鮮

8、，迅速加熱干燥，冷凍保存，抑制水解酶活性。 多糖：先用甲醇或乙醇乙醚混合物脫脂，再用冷水、熱水，0.1-1mol/L NaOH或KOH, 1%HAc或苯酚提取。 注意：防降解，快速，低溫。方法不同產(chǎn)物也不同。 植物體內(nèi)苷常與其對(duì)應(yīng)的水解酶共存，所以要采用殺酶保苷的方法。,多糖分析的一般步驟,1、糖蛋白的分離純化 2、從糖蛋白中釋放聚糖 3、聚糖的分離分析 4、聚糖純度鑒定和分子量測(cè)定 5、單糖組成的測(cè)定 6、完整糖鏈的序列測(cè)定,1.季銨鹽沉淀法： 與酸性多糖形成不溶性沉淀，而使其分離。 常用季氨鹽有十六烷基三甲胺溴化物及其氫氧化物和十六烷基吡啶。 提高溶液PH值或加入硼砂緩沖液，也可沉淀分離中

9、性多糖。,2.分級(jí)沉淀或分級(jí)溶解法： 按比例由小到大的順序向多糖溶液中加入甲醇或乙醇或丙酮，收集不同濃度下析出的沉淀，反復(fù)溶解與沉淀。 該方法適合于分離溶解度相差較大的多糖。,3.離子交換色譜： 常用交換劑為陽離子或陰離子交換纖維素。 陽離子交換纖維素適用于分離酸性、中性多糖和粘多糖。,糖鏈連接順序的確定： 1.部分水解法：將糖鏈水解成較小片段（低聚糖）然后分析片段確定連接順序。 2.質(zhì)譜法 3.NMR和2D-NMR法。,糖的連接位置的測(cè)定： 1.甲基化法：將被測(cè)物全甲基化，水解苷鍵，用GC定性定量分析。 2. 1H-NMR 法：根據(jù)乙酰化后的質(zhì)子化學(xué)位移判斷糖的連接位點(diǎn)。 3. 13C-NM

10、R法：通過苷化位移（糖與苷元成苷后，苷元的-C、-C和糖的端基的化學(xué)位移值均發(fā)生了改變，稱為苷化位移），推斷糖連接位點(diǎn),例1：殼聚糖的制備,例2:香菇多糖的提取制備(了解),在組織中，多糖多與蛋白質(zhì)以共價(jià)相結(jié)合，所以在生化產(chǎn)品制備工藝中，往往第一步多用酶降解蛋白質(zhì)部分或用堿使多糖蛋白質(zhì)間的鍵裂開，以促進(jìn)多糖在提取時(shí)的溶解。 堿性提取可避免多糖中硫酸基團(tuán)水解而破壞。 現(xiàn)多采用堿性提取的同時(shí)用蛋白質(zhì)水解酶處理組織。提取液中存在的蛋白質(zhì)可用普通蛋白質(zhì)沉淀劑使之沉淀，也可用其他方法使變性沉淀，如適當(dāng)調(diào)pH和加熱等。,操作要點(diǎn) 1.預(yù)處理：取干香菇，搗碎。 2.提?。簩v碎的干香菇置于不銹鋼反應(yīng)鍋中，在

11、攪拌的條件下加67倍量水混勻，加熱至90，攪拌保溫60 min，降溫至40時(shí)轉(zhuǎn)移到40水浴保溫；并加入適量蛋白水解酶液，pH值為自然(Ph64)，攪拌反應(yīng)60 min，然后迅速升溫到90-100，滅活1min降溫后紗布過濾，收集濾液。 3.濃縮：將以上濾液置于解壓濃縮罐中，然后解壓濃縮至l/5體積時(shí)，停止?jié)饪s。 4.沉淀：將濃縮液置于搪瓷缸中在攪拌的條件下，加1倍量乙醇，然后靜置過夜。過濾得沉淀物，濾液再加3倍量乙醇，得沉淀物。,5.二次沉淀：將沉淀物置于搪瓷缸中，加約70倍量的水，攪拌均勻，在猛烈攪拌下，滴加0.2mol/l幾氫氧化十六烷基三甲基胺水溶液，逐步調(diào)PH至128時(shí)產(chǎn)生大量沉淀，離

12、心，沉淀用乙醇洗滌，收集沉淀。 6.除蛋白：沉淀用氯仿、正丁醇洗滌去蛋白，水層加3倍量乙醇沉淀，收集沉淀。 7.洗滌：沉淀依次用甲醇、乙醚洗滌，收集沉淀。 8.干燥：將沉淀置真空干燥器干燥，即為香菇多糖。,例3：總糖的測(cè)定 食品中的總糖通常是指具有還原性的糖(葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽等)和在測(cè)定條件下能水解為還原性單糖的蔗糖的總量。 總糖是食品生產(chǎn)中常規(guī)分析項(xiàng)目。它反映的是食品中可溶性單糖和低聚糖的總量，其含量高低對(duì)產(chǎn)品的色、香、味、組織形態(tài)、營養(yǎng)價(jià)值、成本等有一定影響。,總糖是麥乳精、糕點(diǎn)、果蔬罐頭、飲料等許多食品的重要質(zhì)量指標(biāo)。這里所講的總糖不包括淀粉，因?yàn)樵跍y(cè)定條件下，淀粉的水解作用很微

13、弱。 總糖的測(cè)定通常是以還原糖的測(cè)定方法為基礎(chǔ)的，常用的是直接滴定法，此外還有蒽酮比色法等。,蒽酮比色法 1原理 單糖類遇濃硫酸時(shí)，脫水生成糠醛衍生物，后者可與蒽酮縮合成藍(lán)綠色的化合物，當(dāng)糖的量在20一200mg范圍內(nèi)時(shí)其呈色強(qiáng)度與溶液中糖的含量成正比，故可比色定量。,用蒽酮法測(cè)出的碳水化合物含量，實(shí)際上是溶液中全部可溶性碳水化合物總量。用蒽酮法可以一次測(cè)出總量因此，有特殊的應(yīng)用價(jià)值。但在測(cè)定水溶性碳水化合物時(shí)，則應(yīng)注意切勿將樣品的未溶解殘?jiān)尤敕磻?yīng)液中，增加了測(cè)定誤差。此外，不同的糖類與蒽酮試劑的顯色深度不同，果糖顯色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖較淺，五碳糖顯色更淺。 糖類與蒽酮反應(yīng)生成

14、的有色物質(zhì)在可見光區(qū)的吸收峰為 620 nm ，故在此波長下進(jìn)行比色。,糖的鑒定,常用方法：色譜法、沉淀法、電泳。 一、色譜分離 ：依據(jù)被分離多糖組分間的理化性質(zhì)差異及其在固相載體和流動(dòng)相之間分布和流動(dòng)速度的差異而達(dá)到分離的目的 ；分為凝膠色譜、高效液相色譜、離子交換色譜 。,凝膠滲透色譜法（GPC）：常用于多糖分析，常用葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠,以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑，相對(duì)分子質(zhì)量不同的多糖按照其大小順序先后流出色譜柱，通過一系列不同相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)多糖的校正曲線得出相應(yīng)的相對(duì)分子質(zhì)量。 原理：一般通過空間排阻、離子交換、配位交換、分配吸附、等不同模式組合，可以有效的分離單糖、

15、寡糖、多糖和糖醇。 優(yōu)點(diǎn)：方法簡(jiǎn)單、快速 缺點(diǎn)：分辨率低、載樣量少，不適宜粘性多糖的分離,離子交換色譜法,原理：在一定pH條件下，所帶電荷不同，則可根據(jù)各多糖上電荷的差異而達(dá)分離目的。 應(yīng)用：通過載體表面帶電基團(tuán)與樣品離子和淋洗離子進(jìn)行可逆交換、離子偶極作用和離子吸附實(shí)現(xiàn)色譜分離。適合不同多糖尤其是多糖與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起的復(fù)合多糖的分離。 優(yōu)點(diǎn): 吸附容量大 ,回收率高 ,不致引起蛋白質(zhì)變性或酶的失活。,二、毛細(xì)管電泳 優(yōu)點(diǎn)：高分離能力、高靈敏度、快速簡(jiǎn)便 1、單糖電泳：需要將其轉(zhuǎn)化成帶電荷的形式進(jìn)行電泳分離。選用強(qiáng)堿性的緩沖液，使糖基上的羥基失去質(zhì)子而帶負(fù)電 ， 檢測(cè)：主要依賴于衍生物，采用

16、紫外或熒光衍生試劑。如選用硼酸鹽緩沖液，與糖基形成帶負(fù)電的絡(luò)合物可直接進(jìn)行分離，用紫外進(jìn)行檢測(cè)。,2、寡糖和多糖電泳：分離組成相同而連接點(diǎn)不同寡糖同分異構(gòu)體，常采用硼酸緩沖液。寡糖也需要衍生才能檢測(cè)。多糖一般先用酸解或酶解的方法將其轉(zhuǎn)化為寡糖后再進(jìn)行分析。,三 膜分離,以選擇透過性膜作為分離介質(zhì)，通過在膜兩側(cè)施加某種推動(dòng)力(如壓力差、化學(xué)位差、電位差等)，使原料液中組分選擇性通過膜。以壓力差為推動(dòng)力的膜分離過程包括微濾、超濾（較常用）、納濾、反滲透 。,制備天然核酸必需采用溫和的條件，防止過酸、過堿，避免劇烈攪拌，尤其重要的是防止核酸酶的作用,核酸的分離、提純和定量測(cè)定,真核DNA以核蛋白（D

17、NP）形式存在，DNP溶于水或高鹽溶液（1mol/L NaCl），但不溶于低鹽溶液（0.14mol/L NaCl 去除蛋白質(zhì)：水飽和酚，氯仿異戊醇。 DNA沉淀：0.3M NaAC-70%乙醇,（一）DNA分離純化,制備RNA時(shí)，最重要的是使RNase滅活： 所有容器都要經(jīng)過高溫處理，不能高溫高壓的用0.1焦碳酸二乙酯（DEPC）處理。 加入強(qiáng)變性劑（如胍鹽）使RNase失活； 在RNA的反應(yīng)體系內(nèi)加入RNase的抑制劑（如RNasin),（二）RNA的分離純化,2、定糖法 RNA：核糖 糠醛 綠色物質(zhì)（670-680nm） DNA：脫氧核糖+二苯胺蘭色物質(zhì)（595-620nm）,苔黑酚/地衣酚,濃HCl,濃硫酸,1、紫外吸收法 1個(gè)A50g/ml 雙鏈DNA 40g/ml RNA或單鏈DNA,（三）核酸含量的測(cè)定,3、定磷法 核酸含磷量為9.5% 1g磷相當(dāng)于10.5g核酸 4、瓊脂糖凝膠電泳 溴乙錠能插入DNA分子的堿基對(duì)間形成復(fù)合物 在紫外線照射下溴乙錠發(fā)橘紅色熒光 熒光強(qiáng)度與DNA含量成正比,純DNA 比值1.8， 1.8 Pr、苯酚污染 純RNA 比值2.0， 2.0 DNA、 Pr、苯酚污染,（四）、核酸純度的測(cè)定,OD260OD280,二、核酸的沉降特性與超速離心,不同構(gòu)象的核酸（線形、環(huán)形、超螺旋），密度和沉降速率不同，用