T-spot：結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗的臨床應(yīng)用.ppt

1、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗的臨床應(yīng)用,主要內(nèi)容,原理 結(jié)果的判斷 臨床應(yīng)用 評價,一、T-SPOT.TB的原理,結(jié)核分枝桿菌感染機(jī)體后被巨噬細(xì)胞吞噬，但不能完全將其清除，巨噬細(xì)胞凋亡后釋放出大量特異性抗原，并遞呈給特異性的CD4、CD8T細(xì)胞，使其激活并釋放大量-干擾素。 大量研究表明結(jié)核抗原特異分泌-干擾素的T 細(xì)胞可作為結(jié)核分枝桿菌感染的一種可靠標(biāo)志物。,一、T-SPOT.TB的原理,外周血T-SPOT即利用酶聯(lián)免疫斑點技術(shù)（ELISPOT）通過檢測結(jié)核分枝桿菌特異性抗原刺激后外周血單個核細(xì)胞釋放的-干擾素來檢測抗原特異性 淋巴細(xì)胞的應(yīng)答反應(yīng)，從而判斷結(jié)核感染狀態(tài)。 每一個斑點代表一個分泌細(xì)胞

2、因子的T細(xì)胞，記數(shù)斑點數(shù)量可以獲得外周血中結(jié)核致敏的T細(xì)胞數(shù)量。,一、 T-SPOT.TB的原理,結(jié)核特異性抗原早期分泌靶向抗原(ESAT-6)和培養(yǎng)濾過蛋白(CFP-10) 由結(jié)核桿菌基因組RD1區(qū)相同的操縱子編碼的蛋白，只存在于結(jié)核分枝桿菌群(包括人型、牛型和非洲型分枝桿菌)及其它幾種致病性分枝桿菌(如堪薩斯分枝桿菌，Szulgai 分枝桿菌，海分枝桿菌)中，是T 細(xì)胞的靶抗原，能誘導(dǎo)皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)并刺激外周血單核細(xì)胞產(chǎn)生-干擾素。,二、結(jié)果的判斷,試驗分四組：空白對照組、抗原組(ESAT-6和CFP-10)、陽性對照組(植物血凝素PHA)。 通常正常結(jié)果，空白對照孔沒有或有很少的斑點

3、而PHA對照孔斑點數(shù)超過20個。 空白對照孔斑點數(shù)超過10個時結(jié)果被認(rèn)為是“不確定”。 當(dāng)PHA對照孔斑點數(shù)少于20個時，檢測結(jié)果被認(rèn)為是“不確定”。 當(dāng)空白對照孔斑點數(shù)為0-5個并且（抗原A或抗原B斑點數(shù)）減去（空白對照孔斑點數(shù)）等于5-7時，此結(jié)果被認(rèn)為是“灰區(qū)”，應(yīng)當(dāng)利用所有可利用相關(guān)的的臨床信息進(jìn)行判斷。必要時可進(jìn)行復(fù)查。 T-SPOT.TB的實驗結(jié)果也有用每106 PBMCs中斑點形成細(xì)胞(SFCs)的數(shù)目來描述，即SFCs106PBMCs。,二、結(jié)果的判斷,如果抗原A和/或抗原B有應(yīng)答，檢測結(jié)果為“有反應(yīng)性”，參照以下標(biāo)準(zhǔn)： 空白對照孔斑點數(shù)為0-5個時且（抗原A或抗原B孔的斑點數(shù)

4、）-（空白對照孔斑點數(shù)）6； 空白對照孔斑點數(shù)為6-10個時且（抗原A或抗原B孔的斑點數(shù)）2（空白對照孔斑點數(shù)）； 檢測結(jié)果為“無反應(yīng)性”：不符合上述標(biāo)準(zhǔn)且PHA對照孔正常。 當(dāng)PHA對照孔結(jié)果為“不確定”且抗原A和抗原B孔結(jié)果都為“無反應(yīng)性”時，該實驗結(jié)果被認(rèn)為是“并不確定”，應(yīng)當(dāng)復(fù)查。 “有反應(yīng)性”結(jié)果表明樣本中存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞 “無反應(yīng)性”結(jié)果表明樣本中可能不存在針對結(jié)核桿菌特異的效應(yīng)T細(xì)胞,二、結(jié)果的判斷(影響因素分析),既往結(jié)核病史或影像學(xué)提示陳舊性肺結(jié)核、有結(jié)核密切接觸史或高潛伏性結(jié)核感染率可使其診斷活動性結(jié)核病的特異性降低。 只與外周血中結(jié)核特異性抗原刺激產(chǎn)生的效

5、應(yīng)T細(xì)胞有關(guān)，與感染部位無關(guān)。 與年齡、機(jī)體免疫狀態(tài)、HIV感染、營養(yǎng)不良的程度無關(guān)。 抗結(jié)核治療后效應(yīng)T細(xì)胞消失，可使斑點數(shù)減少或使結(jié)果呈陰性。 與是否排菌無關(guān)。,三、臨床應(yīng)用,活動性結(jié)核與潛伏性結(jié)核感染的鑒別 “菌陰”結(jié)核患者的輔助診斷 肺外結(jié)核的鑒別診斷 結(jié)核發(fā)病風(fēng)險的預(yù)測 免疫力低下或受抑制患者的結(jié)核病診斷 區(qū)別結(jié)核感染者與BCG接種者 抗結(jié)核療效的監(jiān)測,四、評價（優(yōu)點）,敏感性及特異性高：不受卡介苗接種及環(huán)境分枝桿菌影響，不受機(jī)體免疫狀態(tài)影響。 應(yīng)用廣泛：在活動性肺結(jié)核、肺外結(jié)核、結(jié)核性漿膜炎、潛伏性結(jié)核感染及免疫抑制的結(jié)核患者均能檢測。 診斷快速：24小時可報告結(jié)果。 可進(jìn)行療效評

6、估：治療有效則T-SPOT.TB斑點數(shù)減少甚至陰性。,四、評價（弊端）,目前尚無統(tǒng)一的界值用來鑒別潛伏結(jié)核感染及活動性肺結(jié)核。 在 5歲兒童、近期暴露于結(jié)核桿菌者、免疫功能低下者和需要二次檢測者中使用的證據(jù)不足。 對標(biāo)本要求高：室溫保存和運(yùn)輸血液樣本（18-25），不能冷凍或冷藏；血液樣本從采集到檢測不超過8小時。 結(jié)果需結(jié)合臨床和其它檢測進(jìn)行判斷，陰性結(jié)果不能排除暴露或感染結(jié)核桿菌的可能性。 不能確定病變部位。,謝謝！,國外文獻(xiàn)報道應(yīng)用ELISPOT方法檢測活動性肺結(jié)核的敏感性可達(dá)到 78% 100%, 特異性可達(dá)到80% 100%。 國內(nèi)學(xué)者研究應(yīng)用ELISPOT方法檢測活動性肺結(jié)核的敏感

7、性為83%98.8%，特異性65%100%，陰性預(yù)測值81.891.6%，陽性預(yù)測值45.367.9%。,有學(xué)者指出：,診斷活動性結(jié)核病患者外周血T-SPOT.TB斑點形成細(xì)胞中位數(shù)為442SFCs/106 PBMC 。 排除活動性結(jié)核病患者外周血T-SPOT.TB斑點形成細(xì)胞中位數(shù)為124SFCs/106 PBMC。 以72SFCs/106 PBMC為界值時,診斷活動性結(jié)核病的敏感性為71.9%,特異性76.4%,ROC曲線下面積為0.810。 以652SFCs/106PBMC為界值時,診斷活動性結(jié)核病的特異性達(dá)95%。,潛伏結(jié)核感染（LTBI）,宿主感染結(jié)核分枝桿菌后尚未發(fā)病、無活動性結(jié)核的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)改變或細(xì)菌學(xué)證據(jù)的一種特殊狀態(tài)。 潛伏性感染者如不進(jìn)行治療，約有5-10%會發(fā)展成活動性結(jié)核。 T-SPOT.TB陽性與密切接觸有更好的相關(guān)性，能更加準(zhǔn)確地診斷LTBI。,潛伏性結(jié)核感染的斑點數(shù)有可能高于活動性結(jié)核，因此TSPOT.TB難以區(qū)分活動性結(jié)核和潛伏性結(jié)核感染。其原因可能有兩點： (1)潛伏性結(jié)核感染者的免疫功能良好，少量的抗原刺激就激發(fā)出活躍的保護(hù)性免疫； (2)活動性結(jié)核患者免疫功能低下，大量的抗原刺激也不足以激起有