《植物細胞工程制藥》PPT課件.ppt

1、第五章 植物細胞工程制藥,本章重點：植物細胞培養(yǎng)的基本概念； 植物細胞的生理特征； 植物細胞培養(yǎng)的基本技術。,第一節(jié) 基本概念,植物細胞工程涉及很多基本理論和實際操作技術，如組織和細胞培養(yǎng)技術，它是細胞遺傳操作及細胞保藏的基礎。 1.植物細胞的全能性：植物的每個細胞都包含著該物種的全部遺傳信息，從而具備發(fā)育成完整植株的遺傳能力。 在適宜條件下，任何一個細胞都可以發(fā)育成一個新個體。植物細胞全能性是植物組織培養(yǎng)的理論基礎。,易混淆的概念 植物的分化：指在個體發(fā)育中，相同細胞后代在形態(tài)、結構、生理功能上產(chǎn)生穩(wěn)定性差異的過程。（細胞分裂是細胞分化的基礎，生物體的生長發(fā)育是細胞分裂和細胞分化共同作用的結

2、果。） 脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，稱為植物細胞的脫分化，或者叫做去分化。 再分化:脫分化產(chǎn)生的愈傷組織繼續(xù)進行培養(yǎng)，又可以重新分化成根和芽等器官，這個過程叫做再分化。,植物組織培養(yǎng)過程總結,離體的植物器官、 組織或細胞（外植體）,愈傷組織,根、芽,植物體,脫分化,再分化,愈傷組織：在人工培養(yǎng)基上由外植體長出來的一團無序生長的薄壁細胞（細胞排列疏松、無規(guī)則）。,補充：愈傷組織的形成,植物組織或器官的無菌培養(yǎng) 定義：指在無菌或人工控制條件下（培養(yǎng)基、光照、溫度），研究植物的細胞、組織和器官以及控制其生長發(fā)育的技術。 主要技術有：（1）幼苗及較大植株的培養(yǎng)； （2）

3、從植物體的各種組織、器官等外植體，經(jīng)脫分化而形成的細胞聚集體的培養(yǎng)； （3）保持良好分散性的單細胞和較小細胞團的液體培養(yǎng)； （4）植物離體器官的培養(yǎng)； （5）未成熟或成熟的胚胎的離體培養(yǎng)。,植物組織培養(yǎng)過程,切取外植體：從活植物體上切下進行培養(yǎng)的那部分組織或器官 1）外植體滅菌消毒（根尖、莖、芽、嫩葉、 種子、花粉等） 2）用消毒過的器械將外植體置于培養(yǎng)皿上 3）切取所需的外植體 4）將外植體接種于培養(yǎng)容器的培養(yǎng)基上 整個試驗在超凈工作臺上進行，保持無菌！ 外植體經(jīng)過一段時間在培養(yǎng)基上生長后，會形成愈傷組織,次級代謝 產(chǎn)物 定義：指生物體生長到一定階段才產(chǎn)生的化學結構十分復雜、對該生物體無明顯

4、生理功能，或并非是生物體生長和繁殖所必需的物質(zhì)，如抗生素、毒素、激素、色素等。 特征：（1）有明顯的分類學區(qū)域界限； （2）其生物合成需在一定的條件下才能發(fā)生； （3）缺乏明確的生理功能； （4）是生命活動的多余成分。,了解內(nèi)容 分生組織培養(yǎng)：指在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)莖端分生組織細胞。 外植體:指用于植物組織的培養(yǎng)的器官或組織的切段。 突變體：經(jīng)過證實已發(fā)生遺傳變異或新的培養(yǎng)物至少是通過一種誘變處理而發(fā)生變異所得的新細胞。,思考題,一、名詞解釋 植物細胞的全能性 次級代謝 外植體 突變體 愈傷組織 二、問答 1.什么叫植物組織和器官培養(yǎng)？主要包括哪些技術？ 2.什么叫次級代謝產(chǎn)物？具有哪些特征？,

5、第三節(jié) 植物細胞的形態(tài)及生理特征,一、植物細胞的形態(tài),二、植物細胞的結構特征,動物細胞,植物細胞,細胞膜 細胞核 線粒體 內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 高爾基體 核糖體,中心體,細胞壁,葉綠體,液 泡,植物細胞與動物細胞比較,植物細胞由細胞壁和原生質(zhì)體兩個部分組成。原生質(zhì)體包括細胞質(zhì)、細胞核和液泡。原始質(zhì)體包括細胞質(zhì)和細胞核。 與動物細胞和微生物細胞相比，植物細胞有三個特點：具有細胞壁、液泡和質(zhì)體。,二、植物細胞的主要生理活性物質(zhì)及其他化學組分,細胞中 除含有有生命的原生質(zhì)體外，還有許多非生命的物質(zhì)，均為x細胞代謝過程中的產(chǎn)物，一類是生理活性物質(zhì)，對細胞內(nèi)生化代謝和生理活動起著調(diào)節(jié)作用，含量少，但非常重要，另一類是

6、后含物，是貯藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)，分布于液泡內(nèi)。 1.生理活性物質(zhì)：對細胞內(nèi)的生化反應和生理活動起調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)的總稱。包括酶、維生素、植物激素和抗生素。 2.后含物：是貯藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)。包括生物堿、糖苷類、揮發(fā)油、有機酸。,三、植物培養(yǎng)細胞的生理特征,一、主要特征： 1.細胞個體大（較微生物細胞大得多）抗剪切力差； 2.生長速度慢易被微生物污染，培養(yǎng)時需添加抗生素； 3.細胞易聚集成團，難進行懸浮培養(yǎng)； 4.培養(yǎng)時需供氧，但培養(yǎng)液黏度大，不受強力通風攪拌； 5.具有群體效應及解除抑制性； 6.細胞培養(yǎng)物滯留與細胞內(nèi)，產(chǎn)量低； 7.細胞具有結構和功能全能性，即細胞可以分化為完整的植株。,二、植物

7、細胞不同生長階段的特征（了解） 1.延遲期：細胞分裂的初始期和最大生長期之間。2.加速期：細胞最大生長期和最大細胞濃度，最佳DNA和蛋白質(zhì)積累率。 3.對數(shù)期：介于最大生長率和蛋白質(zhì)合成完全停止期之間。 4.穩(wěn)定期：細胞數(shù)穩(wěn)定。 了解各個時期的特征,思考題,一、填空 1.與動物細胞和微生物細胞相比，植物細胞有三個特點：具有、和。 2.植物細胞中含有兩類代謝產(chǎn)物，一類是，對細胞內(nèi)生化反應和生理活動起調(diào)節(jié)作用；另一類是，起貯藏物質(zhì)或廢棄物質(zhì)的作用。 二、問答 簡述植物細胞的生理特征,第四節(jié) 植物細胞培養(yǎng)的基本技術,可分為4個階段：從普通的生長環(huán)境中分離植物組織利用無菌技術對所需的植物材料進行無菌處

8、理（以獲得清潔的材料）在嚴格控制的物理和化學環(huán)境中對植物材料進行培養(yǎng)和維持將植物組織還原成可以種植的植株,一、植物材料的準備 植物組織的選擇取決于工作目標，幾乎植物的任何部分都能誘導而產(chǎn)生愈傷組織。 1.從年輕的植株上取得外植體（避免患病或太老的組織） 2.種子也是比較合適的材料之一（種子比柔嫩的植物種子更易于滅菌）,滅菌（填空或選擇） 常用的滅菌劑有：次氯酸鈣、次氯酸鈉、氯化汞 滅菌步驟（了解) 植物材料清洗干凈70%酒精浸泡30-60min取出浸入滅菌劑溶液中，15min無菌水清洗3遍（除去消毒劑）-在無菌室或是超凈臺上進行，以保證在消毒滅菌后不再被污染,二、培養(yǎng)基及其組成,培養(yǎng)基實際上是

9、植物離體器官、組織或細胞等的“無菌土壤”，其特點是營養(yǎng)成分的可調(diào)控性。 培養(yǎng)基的種類很多，但通常都含有無機鹽、碳源、有機氮源、植物生長素、維生素等化學成分。應用最廣泛的是MS培養(yǎng)基。,1.無機鹽：大量元素（N、P、K、Ca、Mg、S、Cl、 Na）+微量元素（Fe、Mn、Zn、Cu、Mo、B） 2.碳源：經(jīng)常使用糖類、肌醇作為碳源，有時也用甘 油代替。 3.植物生長調(diào)節(jié)因子：指植物代謝過程中自身形成的 植物生長調(diào)節(jié)劑，在極低濃度時即可調(diào)節(jié)植物的生長 和發(fā)育過程，并能從合成部位轉運到作用部位而發(fā)揮 作用。 主要有：植物生長素、細胞激動素、赤霉素等,4.有機氮源：多位蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物（如谷氨酰胺）或

10、各種氨基酸。 5.維生素：植物自身合成的量不能滿足植物細胞的需要，必須加入B族維生素和一定量的生物素和肌醇。,三、培養(yǎng)方法 植物細胞的培養(yǎng)方法有很多，但固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)相互配合仍是細胞培養(yǎng)的常規(guī)操作。 固體培養(yǎng)：在培養(yǎng)基中加入一定量的凝固劑（如瓊脂），經(jīng)加熱溶解后，分別裝入培養(yǎng)用的容器中，冷卻后凝結成固體培養(yǎng)基。,固體培養(yǎng) 優(yōu)點：簡便易行、培養(yǎng)所占空間小 缺點(1)培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的濃度差導致愈傷組織生長不平衡； （2）氣體交換不暢，阻礙了組織呼吸作用的正常進行，堆積有害物質(zhì)； （3）細胞群體不均勻； （4)培養(yǎng)時需測定一些生理生化指標，此時需轉入液體中，會改變組織的形態(tài)和生理狀態(tài)。 固體培

11、養(yǎng)最常用的固化劑是：瓊脂，最適濃度為0.6%-1.0%,一般培養(yǎng)溫度為：（251） 需光照，以每天16h為宜。,植物細胞的大規(guī)模培養(yǎng)主要分為： 1.成批培養(yǎng)：將培養(yǎng)基一次性加入反應器中，接種，培養(yǎng)一定時間后收獲細胞的操作方式。 最適于植物細胞培養(yǎng)的生物反應器是：氣升式反應器。 為避免次級代謝產(chǎn)物的大量積累，人們設計了兩步培養(yǎng)法，即使用兩個生物反應器。 第一個用于細胞生物量的積累 第二個用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。 日本科學家用此法成功開發(fā)了第一個植物細胞工程商品紫草寧,2.半連續(xù)培養(yǎng) 每隔一天或兩天收獲一部分培養(yǎng)物（最多可達50%），然后補充等量新鮮培養(yǎng)基。 總體積不變。 3.連續(xù)培養(yǎng) 在投料和接

12、種培養(yǎng)一段時間后，以一定速度連續(xù)采集細胞和培養(yǎng)液，并以同樣速度供給新鮮培養(yǎng)基以使細胞生長環(huán)境長期維持恒定的方法。 該法要維持系統(tǒng)的無菌狀態(tài)，技術條件比較苛刻。,4.固定化培養(yǎng)（了解） 采用的固定化反應器有網(wǎng)狀多孔板、尼龍網(wǎng)套和中孔纖維膜等多種類型。 優(yōu)點（1)細胞位置固定，易于獲得高密度細胞群體； （2）易于維持細胞間物理化學梯度； （3）有利于細胞組織化； （4）易于控制培養(yǎng)條件及獲得較高含量的次級代謝產(chǎn)物。,思考題,一、選擇 1.植物組織培養(yǎng)過程中，獲得外植體后，通常首先要進行滅菌，特別使用于草本植物和柔軟組織的滅菌劑是 A.次氯酸鈣 B.次氯酸鈉 C.氯化汞 D.無水乙醇 2.植物細胞的

13、培養(yǎng)基中常需要加入無機鹽，下列 屬于大量元素。 A.N、S、P、Mg、Cu B.N、S、K、Zn、Cl C.N、S、Na、Mg、Fe D.N、S、P、Ca、Na 3、植物細胞培養(yǎng)基中常需要加入維生素。 A.A族 B.B族 C.C族 D.D族,4.植物細胞培養(yǎng)中有些研究必須在固體培養(yǎng)基上進行，最常用的固化劑是 A.明膠 B.淀粉 C.瓊脂 D.硅膠 5.最適合植物細胞培養(yǎng)的生物反應器是 A.機械攪拌式 B.氣升式 C.轉鼓式 D.鼓泡塔式 6.植物細胞培養(yǎng)應用最廣泛的培養(yǎng)基是 A.MEM培養(yǎng)基 B.DMEN培養(yǎng)基 C.BME培養(yǎng)基 D.MS培養(yǎng)基 二、填空 1.植物細胞培養(yǎng)的最適溫度是，光照以每

14、天為宜。 2.日本科學家成功開發(fā)的第一個植物細胞工程商品是 。 三、名詞解釋 成批培養(yǎng) 連續(xù)培養(yǎng),第五節(jié) 影響植物次級代謝產(chǎn)物積累的因素,在植物組織培養(yǎng)過程中，影響植物次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)生和累計的因素有： （1）生物條件：如外植體、季節(jié)、休眠等 （2) 物理條件：如溫度、光、通氣等 （3）化學條件：如無機鹽、碳源、維生素等 （4）工業(yè)培養(yǎng)條件：如培養(yǎng)罐類型、通氣等,一、外植體的選擇（了解） 不同外植體的懸浮細胞，其最大次級代謝的積累時間各異。 二、培養(yǎng)條件的影響 1.培養(yǎng)環(huán)境的內(nèi)在因素 （1）接種和誘導:次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)率與外植體大小、細胞密度及營養(yǎng)成分密切相關。 （2）培養(yǎng)基的組成物質(zhì)基礎 P：

15、缺乏磷或較低的含磷量都會導致生物量下降或次級代謝產(chǎn)物積累。 N：兩種主要氮源，即NO3和NH4 細胞的生產(chǎn)能力通常取決于NO3和NH4之比。 Cu：必要元素,（3）碳源 使用最多的碳源是糖類，其影響主要取決于使用的糖類的種類和濃度及其次級代謝產(chǎn)物的生物合成過程。 （4）植物生長調(diào)節(jié)因子 在植物細胞培養(yǎng)中起關鍵性作用。但無規(guī)律可循，必須通過反復實驗才能確定合適的數(shù)量和種類。 （5)O2和PH 02：維持細胞正常呼吸作用。 可通過攪拌和通氣進行調(diào)節(jié) PH:植物細胞生長最適PH為56之間。,（6）滲出物 取決于營養(yǎng)條件、發(fā)育階段。 2.兩步培養(yǎng)法 培養(yǎng)基的組成是對細胞生長與次級代謝產(chǎn)物的形成最直接、

16、也是最重要的影響因素。結果顯示，生長培養(yǎng)基用于次級代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)是非常成功的。但要同時滿足最佳生長和最佳次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量則較困難。故提出了兩步培養(yǎng)法。,第一步使用適合細胞生長的培養(yǎng)基目的：為實現(xiàn)細胞的高生產(chǎn)率。 第二步使用適合次級代謝產(chǎn)物合成的培養(yǎng)基。具有低含量的硝酸鹽和磷酸鹽，并含有較低的糖分和碳源。,3.培養(yǎng)環(huán)境的外部因素 （1）溫度：最佳溫度為2028 （2）攪拌頻率：產(chǎn)率與發(fā)酵罐的攪拌速度有關。 （3）培養(yǎng)容器的影響：次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生與所用培養(yǎng)容器的大小和攪拌裝置的不同而不同。 （4）光的影響：一個重要因素 有關因素：光照時間的長短、光質(zhì)、光的強度,思考題,一、名詞解釋 兩步培養(yǎng) 二

17、、填空 1.植物細胞培養(yǎng)中使用最多的碳源是。 2.植物細胞生長最適溫度為。最適PH為。 3.光照是植物培養(yǎng)的一個重要影響因素，、對次級代謝產(chǎn)物的累計都有一定的影響。,第六節(jié) 植物細胞生物反應器,主要有五種類型 1.機械攪拌式生物反應器：對攪拌器加以改進。 優(yōu)點：反應器內(nèi)的溫度、pH、溶氧及營養(yǎng)物質(zhì)濃度較其他反應器更易控制。 2.鼓泡塔式生物反應器:通過位于底部的噴嘴及多孔板而實現(xiàn)氣體分散。 優(yōu)點：沒有運動部件，操作不易染菌，在無機械輸入情況下，提供較高的熱量和質(zhì)量傳遞，適于對剪切力敏感的細胞的培養(yǎng)，放大相對容易 缺點：流體流動形式難以確定，混合不勻，缺乏相關數(shù)據(jù)。,3.氣升式生物反應器 優(yōu)點：結構簡單，沒有泄露點和死角，可以在低剪切力下達到較好的混合和較高的氧傳遞效果，不易污染，操作費用很低。 缺點：高密度培養(yǎng)時混合不夠均勻。 4.轉鼓式生物反應器：通過轉動促進反應器內(nèi)的氧及營養(yǎng)物的混合，設置擋板有助于提高氧的傳遞，在高密度培養(yǎng)時有高的傳氧能力。 缺點：難于大規(guī)模操作，放大困難。,5.固定化生物反應器:前體是細胞的代謝產(chǎn)物必須分泌到細胞外。 優(yōu)點：可保護細胞免受剪切力； 細胞可長時間重復使用 易于實現(xiàn)細胞的高密度培養(yǎng) 細胞