第2節(jié) 核酸的分離純化

1、第二節(jié) 核酸的分離純化,主要內(nèi)容,前言 1 核酸分離、純化原則 1.1 保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性 1.2. 防止核酸的生物降解 2 分離提取核酸的主要步驟 2.1 細胞的破碎 2.2 核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 2.3 核酸的沉淀 2.4 核酸的濃度測定 2.5 核酸的保存,核酸（nucleic acid）是遺傳信息的攜帶者，是基因表達的物質(zhì)基礎(chǔ)。 無論是進行核酸結(jié)構(gòu)還是功能研究，首先需要對核酸進行分離和純化。 核酸樣品質(zhì)量將直接關(guān)系到實驗的成敗。,前 言,Home,1 核酸分離、純化原則,1.1 保持核酸分子一級結(jié)構(gòu)的完整性 1.1.1 意義：遺傳信息全部儲存在一級結(jié)構(gòu)之中，級結(jié)構(gòu)還決

2、定其高級結(jié)構(gòu)的形式以及和其他生物大分子結(jié)合的方式。 1.1.2 分離核酸原則： 1）溫度不要過高； 2）控制pH值范圍(pH值5-9); 3）保持一定離子強度; 4）減少物理因素對核酸的機械剪切力.,Home,1.2 防止核酸的生物降解,細胞內(nèi)或外來的各種核酸酶能消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，破壞核酸一級結(jié)構(gòu)。 所用器械和一些試劑需高溫滅菌，提取緩沖液中需加核酸酶抑制劑。,1.2.1 DNA酶抑制劑,(1） 金屬離子螯合劑： DNA酶需要金屬二價離子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金屬二價離子螯合劑，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二鈉)、8-羥基喹啉； (2） 陰離于型表面

3、活性劑： 如SDS，該試劑除對核酸酶有抑制作用外，還能使蛋白質(zhì)變性，并與變性蛋白結(jié)合成帶負電荷的復合物，該復合物在高鹽溶液中沉淀。,1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制劑,RNAase分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿，不宜失活。 (1) 皂土（bentonite ） 作用機制：皂土帶負電荷，能吸附RNase，使其失活。,(2) DEPC(二乙基焦碳酸鹽) (C2H5OCOOCOOC2H5) 粘性液體，很強的核酸酶抑制劑。 作用機制：與蛋白質(zhì)中His結(jié)合使蛋白變性。 使用注意： 1）DEPC也能破壞單鏈核酸中大部分腺嘌呤環(huán)。但濃度比使蛋白質(zhì)變性的濃度大1001000倍。 2）容

4、易降解，保存在4 或液氮中； 3）提RNA時，0.1% DEPC浸泡器皿37 2 h。 4）劇毒。,（3) 肝素 （4）復合硅酸鹽（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧釩核糖核苷復合物 (Vanadyl-Ribonucleoside Complex, VRC),Home,(1) 高速組織搗碎機搗碎 (2) 玻璃勻漿器勻漿 (3) 超聲波處理法 (4) 液氮研磨法 (5) 化學處理法(SDS、LDS，吐溫80等） (6) 生化法（溶菌酶、纖維素酶等）,Home,2.1 細胞的破碎,2.2 核蛋白的解聚、變性蛋白的去除 核酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合力主要是正負靜電吸力(核酸

5、與堿性蛋白的結(jié)合)、氫鍵和非極性的范德華力。 分離核酸最困難的是將與核酸緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)分開，同時避免核酸降解。,2.2.1 加入濃鹽溶液（如NaCl） 核酸-蛋白質(zhì)加入NaCl后，破壞靜電吸力，使氫鍵破壞，核蛋白解聚； 2.2.2 加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，還具有使核酸從蛋白質(zhì)上游離出來的功能；,2. 2.3 酚/氯仿抽提 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并對核酸酶有抑制作用。 氯仿比重大，能加速有機相與水相分層，減少殘留在水相中的酚，同時氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。 在酚/氯仿抽提核酸提取液時，需要振搖，為防止起泡和促使水相與有機相的分離，再加上一定量的異戊

6、醇（酚：氯：異戊醉=25：24：1）。,(1）使用注意 酚通常是透明無色的結(jié)晶，如果酚結(jié)晶呈現(xiàn)粉紅色或黃色，表明其中含有酚的氧化產(chǎn)物，例如醌、二酸等。變色的酚不能用于核酸抽提實驗，因為氧化物可破壞核酸的磷酸二酯鍵。 (2）安全操作 酚腐蝕性很強，并可引起嚴重的灼傷，操作時應(yīng)戴手套。,使用酚時應(yīng)注意,Home,2.3 核酸的沉淀,沉淀是濃縮核酸最常用的方法。 優(yōu)點： 改變核酸的溶解緩沖液； 重新調(diào)整核酸的濃度； 去除溶液中某些鹽離子與雜質(zhì)。,2.3.1 核酸沉淀的鹽類及濃度,當核酸溶液的pH值大于4時，核酸分子呈多聚陰離子狀態(tài)，它與1價或2價陽離子形成的鹽在許多有機溶劑中不溶解，也不會被有機溶劑

7、變性。,2.3.2 有機沉淀劑,（1）乙醇 優(yōu)點： 對鹽類沉淀少，沉淀中所含跡量乙醇易揮發(fā)除去，不影響以后實驗。 缺點： 需要量大，一般要求低溫操作。,（2）異丙醇,優(yōu)點： 需體積小，速度快，適于濃度低、體積大的DNA樣品沉淀。一般不需低溫長時間放置。 缺點： 易使鹽類、蔗糖與DNA共沉淀異丙醇難以揮發(fā)除去。所以，最后用70乙醇漂洗數(shù)次。,（3）聚乙二醇（PEG）,優(yōu)點： 可用不同濃度的PEG選擇沉淀不同相對分子質(zhì)量的DNA片段。應(yīng)用6000相對分子質(zhì)量的PEG進行DNA沉淀時，使用濃度與DNA片段的大小成反比。 注意： PEG沉淀一般需加0.5mol/L的NaCl或10 mmol/L的MgC

8、l2。要除去DNA沉淀中PEG。,（4）精胺,精胺不是有機溶劑，但可快速有效沉淀DNA。 原理是： 精胺與DNA結(jié)合后，使DNA在溶液中結(jié)構(gòu)凝縮而發(fā)生沉淀，并可使單核苷酸和蛋白質(zhì)雜質(zhì)與DNA分開，達到純化DNA的目的。,2.3.3 核酸沉淀的溫度和時間,一般強調(diào)，核酸沉淀在低溫長時間下進行。低溫長時間沉淀，易導致鹽與DNA共沉淀，影響以后的實驗。一般使用0冰水，10-15min， DNA樣品足可達到實驗要求。,Home,2.4 核酸的濃度測定,2.4.1 紫外分光光度法測DNA和RNA的含量 前提：核酸樣品要較純，無顯著蛋白質(zhì)、酚、瓊脂糖及其他核酸污染。測定濃度應(yīng)大于0.25 g/ml 。 結(jié)

9、論：在波長260nm紫外光下，1 OD值的吸光度相當于雙鏈DNA濃度為50g/ml；單鏈DNA為37 g/ml；RNA為40 ug/ml。,紫外分光光度計測定核酸濃度的操作步驟,a吸取一定量的DNA樣品或RNA樣品，加水至特定體積后，轉(zhuǎn)入分光光度計的石英比色杯中。 b分光光度計先用一定量的水校正零點。 c測定待測樣品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d計算濃度。 雙鏈DNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù) 50/1000； RNA樣品濃度(g/l) = OD260核酸稀釋倍數(shù)40/1000。 e分析純度。,A：測DNA： 純的DNA樣品OD260/OD280應(yīng)為1.

10、8，OD260mOD230應(yīng)大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9時，表明有RNA污染。 2) 小于1.6時，表明樣品中存在蛋白質(zhì)或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0時，表明溶液中有殘存的鹽和小分子雜質(zhì)，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出現(xiàn)既含蛋白質(zhì)又含RNA的DNA溶液比值為1.8的情況。,測定結(jié)果分析,B：測RNA 純的RNA樣品其OD260OD280應(yīng)介于1.7-2.0之間，OD260/OD230比值應(yīng)大于2.0。 1）若RNA樣品OD260/OD280比值太小，說明有蛋白質(zhì)或酚的污染； 2）比值大于2.0時，可能被異硫氰酸胍等污染； 3）OD260/OD230比值小于2.0時表明有小分子及鹽存在。,2.4.2 溴乙錠熒光法測定核酸的含量,原理：DNA、RNA在熒光染料溴乙錠(EB)嵌入堿基平面之間后，DNA、RNA樣品在紫外光激發(fā)下，可發(fā)出紅色熒光，熒光強度與核酸含量成正比。使用一系列已知的不同濃度DNA溶液作標準對照，可比較出被測DNA溶液濃度。 注意：此法的比較主要基于目測，是估計水平。,Home,2.5 核酸的保存,(1) 對DNA