染色體組型分析.ppt

1、遺傳學(xué)實驗之 染色體組型分析,廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,實驗?zāi)康模?掌握染色體組型分析的各種數(shù)據(jù)指標(biāo) 學(xué)習(xí)染色體組型分析的基本方法,實驗原理,定義：染色體組型又稱核型，是指將動物、植物、真菌等的某一個體或某一分類群（亞種、種、屬等）的體細胞內(nèi)的整套染色體，按它們相對恒定的特征排列起來的圖像。 核型模式圖是指將一個染色體組的全部染色體逐個按其特征繪制下來，再按長短、形態(tài)等特征排列起來的圖像。,發(fā)展歷史,1920年提出 三項技術(shù)促進：低滲處理 秋水仙素應(yīng)用 植物凝激素應(yīng)用 染色體分帶技術(shù)：Q帶、G帶、C帶、R帶、T帶、N帶等 FISH技術(shù),染色體的特征,數(shù)目 （2n=？） 長度 （絕對長度、相對長度）

2、 著絲粒位置 （MSMSTT） 隨體與次溢痕的數(shù)目、大小和位置 帶型分析,各類常用實驗生物和人細胞DNA含量與染色體數(shù)目,染色體超螺旋,染色體的大小,燈刷染色體（光鏡觀察）,染色體觀察及核型分析,應(yīng)用意義,染色體組型分析染色體水平上的表型 可確定物種的特征，確定種屬親緣關(guān)系 分析生物物種的變異和進化過程 識別單條染色體、基因定位 臨床應(yīng)用（染色體疾病、產(chǎn)前診斷）,人類23對染色體,組型分析實驗方法,染色體數(shù)目確定 染色體形態(tài)特征： 長度：絕對、相對 相對長度=每條染色體的長度/全套染色體長度 臂比=長臂/短臂 著絲點指數(shù)=短臂/（長+短臂） 隨體的有無,分組排隊原則,著絲粒類型相同，相對長度相

3、近的分一組 同一組的按染色體長短順序配對排列 各指數(shù)相同的染色體配為一對 可根據(jù)隨體的有無進行配對 將染色體按長 短排隊，短臂向上,實驗用品,毫米尺、剪刀、膠水、計算器、白紙 人染色體放大照片,染色體編號(人X染色體),記述一特定帶時，需要寫明4個內(nèi)容：染色體號，長短臂，區(qū)的號序和帶的號序。這些內(nèi)容按順序?qū)懀挥瞄g隔或加標(biāo)點。如果某一帶被再細分，在原帶號數(shù)后加一小數(shù)點，編號原則仍按從著絲粒往臂端序貫編號。如1p31.2代表一號染色體短臂3區(qū)1帶第2亞帶,核型描述,首先列出染色體總數(shù)，然后是性染色體組成，接著列出異常的染色體數(shù)目或形態(tài)。下列統(tǒng)一的命名符號： A-G 染色體組的名稱 1-22 染色

4、體編號 X,Y 性染色體 del 缺失 der 結(jié)構(gòu)重排的染色體 dup 重復(fù) inv 倒位 t 易位 +/- 在染色體符號前表示染色體增加或減少，在染色體符號后表示染色體多出或缺少一部分,實驗步驟,計數(shù)，沿邊緣剪下染色體，編號 初步目測配對，分組 測量長度，計算相對長度、著絲粒指數(shù)、 臂比，相同的染色體間配對 將配對好的染色體排列并粘貼在紙上，每一組下面畫一橫線，在兩端注明起止號，并在橫線下的中部寫明A-G組號，染色體從大到小編為1-22號，性染色體單獨列為一組,思考題,請描述核型： 45，XY, der (14;21) (q21;q14) 47，XY, +21,生命科學(xué)中的“釣魚” （FI

5、SH）技術(shù),遺傳及分子生物學(xué)實驗新技術(shù)新方法系列講座,發(fā)展歷史,熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ Hybridization,FISH)問世于70年代后期,其曾多用于染色 體異常的研究,近年來隨著FISH所應(yīng)用的探針種類的不斷增多,特別是全COSMID探針及染色體原位抑制雜交技 術(shù)的出現(xiàn),使FISH技術(shù)不僅在細胞遺傳學(xué)方面,而且還廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)研究,如診斷、基因定位等,放射性同位素原位雜交技術(shù),原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點，諸如每次檢驗需重新標(biāo)記 、已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性 、需要較長時間的曝光時間和對環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時，需要較多的分

6、裂相進行統(tǒng)計學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計數(shù)上的誤差等。,FISH的基本原理,很簡單, 就是標(biāo)記了熒光的單鏈DNA(探針)和與其互補的DNA(玻片上的標(biāo)本)退火雜交, 通過觀察熒光信號在染色體上的位置來反映相應(yīng)基因的情況.,熒光原位雜交（FISH）,FISH技術(shù)是常規(guī)染色體分析的輔助手段。它是用熒光素標(biāo)記特異探針，與染色體做雜交后，根據(jù)特異的熒光信號來判斷結(jié)果。 它可用于標(biāo)記染色體的識別、特異融合基因的檢測、新基因定位，用全染色體涂抹探針識別復(fù)雜的染色體結(jié)構(gòu)異常。,FISH具有其不可比擬的優(yōu)點：,1.操作簡便，探針標(biāo)記后穩(wěn)定，一次標(biāo)記后可使用二年。 2.方法敏感

7、，能迅速得到結(jié)果。 3.在同一標(biāo)本上，可同時幾種不同探針。 4.不僅可用于分裂細胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究，而且還可用于靜止期細胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究。,FISH的技術(shù)特點：,FISH選用的標(biāo)本可以是分裂期細胞染色體也可以是間期細胞。間期細胞可以是冰凍切片，也可以是細胞滴片或印片。 生物素（Biotin）地高辛（digoxigenin ）, dinitrophenyl(DNP)，aminoacetyl fluorene(AAF)均可用于探針標(biāo)記。,直接標(biāo)記和間接標(biāo)記,用生物素或地高辛標(biāo)記稱為間接標(biāo)記, 雜交后需要通過免疫熒光抗體檢測方能看到熒光信號, 因而 步驟較多, 操作麻煩, 其

8、優(yōu)點是在信號較弱或較小時可經(jīng)抗原抗體反應(yīng)擴大 直接用熒光素標(biāo)記DNA的方法稱為直接標(biāo)記. 由于直接標(biāo)記的探針雜交后可馬上觀察到熒光信號, 省去了煩瑣的免疫熒光反應(yīng), 不再需要購買熒光抗 體, 也由于近年來熒光素的亮度和抗淬滅性的不斷改進和提高, 直接標(biāo)記的熒光探針越來越成為首選, 并采用多種不同顏色的熒光, 方便在同一標(biāo)本上同時檢測多種異常. 其熒光強度 和信號大小都易于在普通熒光顯微鏡下觀察, 使FISH過程變得簡便而易于操作.,探針標(biāo)記,在已知探針DNA結(jié)構(gòu)及序列情況下可采用PCR或RNA逆轉(zhuǎn)錄法標(biāo)探針。通常用Biotin標(biāo)記的探針應(yīng)大于100bp，較小的探針可采用PCR技術(shù)來標(biāo)記。 近年

9、來，VYSIS公司成功的生 產(chǎn)了大片段的DNA探針（100400kb）。由于探針較長，故可將熒光物質(zhì)直接標(biāo)記在核苷酸上，這不僅使雜交過程進一步簡化面且雜交信號增強。,染色體著絲粒熒光,染色體端粒熒光,多色信號采集,常規(guī)的熒光顯微鏡的熒光顯微鏡的照像， 彩色膠片不易多次曝光，限制了這種聯(lián)合標(biāo)記探針的應(yīng)用，使用CCD照像系統(tǒng)，先分別多次攝取灰色的影像關(guān)儲存在計算機內(nèi)，而后冠以人為的顏色，運用軟件系統(tǒng)融合各次得到的影像，最終形成一個復(fù)合的多顏色的圖像。,FISH和G顯帶技術(shù)結(jié)合,對已做過G顯帶的染色體片子用75%的 乙醇或甲醇褪色后，可使FISH更清晰的辨認各條染色體及染色體結(jié)構(gòu)異常（包括某些復(fù)雜的

10、易位，插入，倒位等）,不僅可以用新近G帶外理過的片子，而且還可用陳舊的G帶片子。因此，F(xiàn)ISH技術(shù)可成功的幫助細胞遺傳學(xué)家做出回顧性分析。,FISH技術(shù)和其他技術(shù)的結(jié)合,FISH技術(shù)和RFLP結(jié)合，可以精確地描述原屬于染色本長短臂等結(jié)構(gòu)改變和染色體核形或復(fù)雜片段的性質(zhì)。 FISH和細胞免疫化學(xué)技術(shù)結(jié)合，可以同時用多種顏色反應(yīng)不同的核苷酸鏈和蛋白質(zhì)，這樣可以在單個細胞內(nèi)同時找到基因的位點。轉(zhuǎn)錄和翻譯和產(chǎn)物，有助了解核苷酸結(jié)構(gòu)功能以及表達產(chǎn)物之間關(guān)系的研究。,多色熒光原位雜交（M-FISH）,M-FISH相當(dāng)于在 一次雜交中給每一條染色體都涂上了不同的顏色, 因而很容易就可看到多條染色體間的復(fù)雜易

11、位情況和確定標(biāo)志染 色體的來源. M-FISH是1996年才建立的一種新技術(shù)。使用5種熒光染料按比例標(biāo)記探針，雜交后形成24條染色體上24種特異的熒光色彩以供核型分析。它為人們提供了既豐富又完善的細胞遺傳學(xué)信息，包括確定標(biāo)記染色體的來源、檢測微小的染色體易位和檢測復(fù)雜的染色體易位 。,多色熒光染色體顯帶（Rx-FISH）,能否讓每條區(qū)帶也雜交上不同的顏色呢? 這一想法導(dǎo) 致了彩色核型分析(Rx-FISH)的誕生. Rx-FISH技術(shù)是采用多種熒光素標(biāo)記與人類DNA有高度同原性猿的DNA作為探針，雜交后使人類的24條染色體上呈現(xiàn)特異的帶型。這樣便可根據(jù)彩色的熒光條帶進行核型分析。,比較基因組雜交

12、（CGH）,CGH不需要制備患者的染色體標(biāo)本, 只需采用腫瘤患者的基因組DNA和正常人的基因組DNA作為探針，與正常人的中期染色體分裂相進行雜交。比較兩種探針?biāo)鶚?biāo)的熒光信號的強度比率來判斷腫瘤患者的DNA是否存在缺失、增加或復(fù)制。 因而CGH最適合于檢測實體瘤, 淋巴瘤等不易得到高質(zhì)量染色體標(biāo)本的疾病. CGH另一無法替代的優(yōu)點是, 它可在一次雜交中檢測整個基因遺傳 物質(zhì)的增加或減少, 但精度有限, 對微小的擴增或缺失檢測不出, 僅適用于對整個基因組進行篩查. CGH也無法發(fā) 現(xiàn)平衡染色體易位.,FISH的臨床運用,在細胞遺傳學(xué)檢查中，重復(fù)序列的探針應(yīng)用最多，它們是衛(wèi)星DNA、衛(wèi)星DNA和經(jīng)典

13、衛(wèi)星DNA探針。 衛(wèi)星DNA探針主要檢測人染色體的著絲粒。 衛(wèi)星DNA位于頂端著絲粒染色體及染色體的異染色質(zhì) 周圍。 經(jīng)典衛(wèi)星DNA有著AATGG短片段，位于染色體1、9、15、16和Y染色體長臂異染色質(zhì)周圍，后兩處探針除了可用于染色體數(shù)目檢查外，還可用于上述部位精細改變的檢查。,FISH的臨床運用,白血病檢測中常用的FISH探針有單一序列探針, 著絲粒探針, 整條染色體探針, 常用方法有單標(biāo)記FISH, 雙 標(biāo)記FISH, 比較基因組雜交(CGH), M-FISH 和Rx-FISH等.各種FISH探針及方法均在白血病的診斷, 治療監(jiān)測, 預(yù)后估計和微小殘留病檢測中起重要作用,應(yīng)用實例,常規(guī)的染色體核型分析已廣泛用于各類急、慢性白血病患者的骨髓染色體檢查。如M3型的t（15；17）、M2b型的t（8；21）、CML和部分ALL的Ph染色體等。 FISH技術(shù)已成功地用于t（15；17），t (8；21) 和Ph染色體等的檢測，并為人類基因組實驗室發(fā)現(xiàn)的新基因進行了定位。利用染色體涂抹技術(shù)，結(jié)合常規(guī)核型分析和CGH技術(shù)，確診了多例復(fù)雜的染色體異位。已用CGH技術(shù)，分別對高二倍體ALL的患者和CML患者進行了研究。CGH技術(shù)在實體瘤的D