動(dòng)物組織RNA提取及熒光定量PCR-精講.ppt

1、RNA提取及Q-PCR相關(guān)技術(shù),主講：宋志新,利用含有變性劑和Rnase抑制劑的有機(jī)溶劑提取RNA，是目前常用的RNA提取方法。 Trizol（主要成分為異硫氰酸胍和酚），具有極強(qiáng)的裂解能力，可在短時(shí)間內(nèi)裂解細(xì)胞和組織樣本，保持樣品中RNA的完整性，有效抑制RNA的降解。樣品在Total RNA Extraction Reagent中能夠充分被裂解，在加入氯仿離心后，溶液會(huì)形成上清層、中間層和有機(jī)層(鮮紅色下層)，RNA分布在上層水相中，收集上清層后，經(jīng)異丙醇沉淀便可以回收得到Total RNA。提取的總RNA純度高，基本不含蛋白質(zhì)及基因組DNA，提取的RNA可直接用于Northern，點(diǎn)雜交

2、，mRNA純化，體外翻譯，RT-PCR，以及構(gòu)建cDNA文庫(kù)等各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。 Total RNA Extraction Reagent廣泛適用于培養(yǎng)細(xì)胞、動(dòng)物組織、微生物等。 下面介紹動(dòng)物組織Total RNA的提取方法,RNA提取,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),概要,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,實(shí)驗(yàn)材料 1、組織（以小鼠肝臟為例） 2、RNAiso Plus（Code No: 9108）（作用同TRIzol） 3、其他：氯仿、異丙醇、75%乙醇、研缽、加樣器、1.5ml EP管、槍頭等。（均為RNase-free）,0

3、.1%DEPC水,有毒,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,準(zhǔn)備工作 戴口罩、手套、帽子 提取區(qū)域：用75%乙醇擦拭試驗(yàn)臺(tái) 試驗(yàn)器具：用75%乙醇擦拭加樣槍 準(zhǔn)備RNase-free的槍頭和離心管 低溫離心機(jī)預(yù)冷至4 準(zhǔn)備-20預(yù)冷的75%乙醇,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的提取步驟 1、從小鼠體內(nèi)取出肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水清洗。 2、使用液氮迅速冷凍組織， -80冰箱保存。 3、使用液氮充分預(yù)冷研缽。 4、將稱(chēng)重冷凍的組織（約50-100mg）從冰箱取出后迅速放入預(yù)冷好的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入

4、液氮，直至組織被研磨成粉末狀。（注：無(wú)明顯的可見(jiàn)顆粒，如果研磨不徹底會(huì)影響RNA的收率和質(zhì)量。）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的提取步驟 5、向研磨成粉末狀的樣品中加入1ml RNAiso Plus，并完全覆蓋樣品。（注：在加入RNAiso Plus時(shí)要保證組織沒(méi)有融化，否則RNA易被RNase降解。） 6、室溫靜置510 min。 7、待樣品融化后，用研杵繼續(xù)研磨至裂解液呈透明狀。將勻漿液轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管中，室溫靜置5 min后，4，13000rpm離心5 min，將上清轉(zhuǎn)移至新的1.5ml EP管中。,RNA提取,概要,RT-PCR

5、,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的提取步驟 8、每1ml液體中加入1/5體積（約200l）的氯仿，蓋緊EP管，用手劇烈震蕩15秒，直至溶液充分乳化，無(wú)分相現(xiàn)象。（注：不能用振蕩器混勻，因?yàn)槿菀自斐蒁NA和RNA的物理降解。） 9、室溫靜置5 min，4，13000rpm離心15 min。 10、從離心機(jī)中小心取出EP管，此時(shí)勻漿液分為三層，上層是透明的水層，RNA溶解在此層中；半固體狀的中間層，此層 中包含DNA；下層為粉紅色的 有機(jī)溶劑，蛋白質(zhì)、多糖等物 質(zhì)溶解在此層中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的提取步驟 11、將上層水

6、相溶液小心轉(zhuǎn)移至新的EP管中，大約每個(gè)EP管中能取出400500l，謹(jǐn)慎操作，切勿吸到中間層。 （注：下層有機(jī)廢液勿亂丟，收集起來(lái)統(tǒng)一進(jìn)行無(wú)毒化處理。） 12、加入等體積異丙醇，上下顛倒EP管，充分混勻。 13、室溫靜置10 min后，4，13000rpm離心10 min?？稍陔x心后的EP管底部觀察到少量的白色沉淀。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的提取步驟 14、小心棄去上清。 15、向含有沉淀的EP管中緩緩加入1ml預(yù)冷75%乙醇，輕輕上下顛倒，清洗沉淀。（動(dòng)作輕柔，無(wú)需將沉淀懸浮起來(lái)） 16、4，13000rpm離心5 min。用移液器除去

7、上清。 17、將EP管瞬時(shí)離心，用移液器仔細(xì)將殘存在EP管底部的少量液體除去。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的提取步驟 18、打開(kāi)EP管，室溫放置干燥（目的是讓殘留的乙醇揮發(fā)，乙醇的殘留可能對(duì)后續(xù)的反應(yīng)有影響）。干燥的時(shí)間不宜太久，RNA完全干燥后很難溶解 19、用RNase-free ddH2O溶解沉淀。（視RNA量的多少所加RNase-free ddH2O的體積從20-200不等，肝臟組織RNA產(chǎn)率較高，肺組織產(chǎn)率低） 20、RNA溶液保存在-80冰箱中。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的濃度

8、及質(zhì)量檢測(cè) 1、濃度及純度檢測(cè)： （Thermo SCIENTIFIC NANODROP 1000 Spectrometer ） 核酸在260nm附近有強(qiáng)吸收，蛋白質(zhì)在280nm附近有強(qiáng)吸收。所以測(cè)定溶液在260nm和280nm下的吸光度，根據(jù)A260計(jì)算提取的核酸量，根據(jù)A260/A280的比值評(píng)價(jià)提取的核酸純度。 理想的RNA純度A260/A280應(yīng)在1.82.2范圍內(nèi)。 低離子強(qiáng)度或低pH值會(huì)使OD280升高，從而使OD260/OD280值低（1.65）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的濃度及質(zhì)量檢測(cè) 2、質(zhì)量檢測(cè)凝膠電泳法 利用1%的瓊脂

9、糖凝膠進(jìn)行電泳，如果可以清晰觀察到兩條rRNA條帶（真核生物：28S和18S；原核生物：23S和16S），且其濃度比值大約為2:1，則RNA未降解。 若觀察到smear現(xiàn)象，或比值小于2:1，則RNA已發(fā)生降解。 如果觀察到大于28S或23S的條帶，則樣品可能有基因組DNA污染，這時(shí)可以考慮使用DNase I處理。,若有條帶，可能混入了基因組DNA,28S rRNA,18S rRNA,tRNA等,DL2000 DNA Marker 電泳圖（1%瓊脂糖膠，TAE）,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的濃度及質(zhì)量檢測(cè) 2、質(zhì)量檢測(cè)凝膠電泳法 實(shí)驗(yàn)材料：

10、a. 提取的RNA溶液 b. DL2000 DNA Marker c. 6Loading Buffer d. 1%的瓊脂糖凝膠（加1l Goldview/20ml凝膠） e. 1TAE Buffer f. 電泳儀 g. UV凝膠成像儀,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的濃度及質(zhì)量檢測(cè) 2、質(zhì)量檢測(cè)凝膠電泳法 實(shí)驗(yàn)操作： 1）取10l RNA原液至一個(gè)1.5ml EP管中，使用RNase-free ddH2O將其稀釋至200ng/l。 注：需RNase-free ddH2O體積(l)=10lRNA濃度(ng/l) /200(ng/l)-10l 2）取

11、5l RNA（200 ng/l）至一個(gè)小 EP管中，以供電泳使用。 （注：剩余部分于-80保存?zhèn)銻T反應(yīng)用） 3）將上步的RNA 70加熱2 min。 4）冰上冷卻。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA的濃度及質(zhì)量檢測(cè) 2、質(zhì)量檢測(cè)凝膠電泳法 實(shí)驗(yàn)操作： 5）向每管中加入1l 6Loading Buffer，混合均勻。 6）將瓊脂糖凝膠放入到電泳槽中。 7）導(dǎo)入1TAE Buffer，完全浸過(guò)膠面。 8）點(diǎn)樣：將管內(nèi)樣品全部加入到一個(gè)凝膠孔里。 9）電泳：100-120V，約20-30分鐘。 10）凝膠成像。,RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PC

12、R,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA產(chǎn)率估計(jì),RNA提取,概要,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),RNA 提取,RNA降解,巨噬細(xì)胞RNA,巨噬細(xì)胞RNA,動(dòng)物組織RNA,逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),Q-PCR,反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng) RNA自身不能作為PCR反應(yīng)的模板，所以必須先將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。 實(shí)驗(yàn)操作： 1）將提取的RNA調(diào)整濃度為500ng/l，并于70變性2min。 2）配反應(yīng)體系（注意：不同的試劑盒體系不同，我們用的是TaKaRa的RR037A） 20l體系 5x Buffer 4l Oligo dT Primer 1l

13、Random 6 mers 1l DEPC H2O 1l Enzymermix 1l 提取的RNA模板 2l,逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),Q-PCR,反轉(zhuǎn)錄（RT）反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)操作： 1）RT-PCR程序： 37, 15min 85, 5s 4, ,反轉(zhuǎn)錄過(guò)程,使反轉(zhuǎn)錄酶失活,得到的cDNA短期可在4保存數(shù)天，長(zhǎng)期保存應(yīng)在-20以下,熒光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)整個(gè)反應(yīng)進(jìn)程，并結(jié)合相應(yīng)的軟件對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。,熒光

14、定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),熒光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),熒光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),QPCR,雙標(biāo)記探針（Taqman Probe）,熒光報(bào)告基團(tuán) （Reporter）,熒光淬滅基團(tuán) （Quencher）,序列特異性,寡核苷酸探針,游離狀態(tài)下，F(xiàn)RET效應(yīng)，不發(fā)熒光,伴隨產(chǎn)物生成，熒光積累,雙標(biāo)記探針（Taqman Probe）,熒光定量PCR（Q-PCR）,概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總

15、結(jié),QPCR,注意事項(xiàng)總結(jié),概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),常見(jiàn)問(wèn)題及疑難解答 提取RNA收率低 當(dāng)收率明顯低于預(yù)期時(shí)，可以考慮以下原因： 1）加入Trizol或RNAiso Plus后樣品勻漿不充分； 2）分層時(shí)水相回收率低； 3）RNA沉降后與水復(fù)溶性不好； 4）異丙醇沉降或洗滌過(guò)程中混入Rnase。,注意事項(xiàng)總結(jié),概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),常見(jiàn)問(wèn)題及疑難解答 提取的RNA難以溶解 1）75%乙醇清洗沉淀后不要干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或加熱干燥； 2）若難溶可以于60加熱5分鐘后再于冰上溶解數(shù)小時(shí)。,注意事項(xiàng)總結(jié),概要,RNA 提取,RT-PCR,Q-PCR,注意事項(xiàng)總結(jié),常見(jiàn)問(wèn)題及疑難解答 提取的RNA降解 1）提取RNA應(yīng)采用新鮮的組織材料，或者