第五章+凝膠過(guò)濾.ppt

1、第五章 凝膠過(guò)濾,是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一種分離純化方法。 又叫分子篩層析凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，小分子物質(zhì)能進(jìn)入其內(nèi)部，而大分子物質(zhì)卻被排阻在外部。當(dāng)一混合溶液通過(guò)凝膠過(guò)濾層析柱時(shí)，溶液中的物質(zhì)就按不同分子量篩分開(kāi)。,不同類(lèi)型凝膠的篩孔的大小不同,凝膠過(guò)濾基本原理,相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)由于直徑大于凝膠網(wǎng)孔被完全排阻在孔外，只能在凝膠顆粒外的空間向下流動(dòng)，因此流程較短，移動(dòng)速度快，所以首先流出。 相對(duì)分子質(zhì)量較小的物質(zhì)由于直徑小于凝膠網(wǎng)孔，可完全滲透進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔，在向下移動(dòng)過(guò)程中，因此流程較長(zhǎng)，移動(dòng)速率慢，所以最后流出。,中等大小的分子，它們?cè)谀z顆粒內(nèi)外部分滲透，滲透的程度取決于它們

2、分子的大小，所以它們流出的時(shí)間介于二者之間，這樣分子大的組分先流出，分子小的組分后流出。 樣品經(jīng)過(guò)凝膠層析后，各個(gè)組分便按分子從大到小的順序依次流出，從而達(dá)到了分離的目的。,凝膠過(guò)濾層析過(guò)程示意圖,凝膠過(guò)濾的優(yōu)點(diǎn)：,設(shè)備簡(jiǎn)單 操作方便 重復(fù)性好 樣品回收率高等特點(diǎn),適用：,a.分離純化蛋白質(zhì)（包括酶類(lèi)）、核酸、多糖、激素、氨基酸和抗生素等物質(zhì) b.測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量 c.樣品的濃縮和脫鹽等方面,第一節(jié) 凝膠的分類(lèi)及性質(zhì),性質(zhì)： 凝膠不溶于水，但在水中有較大的膨脹度和較好的分子篩功能。,分類(lèi),葡聚糖凝膠（Sephadex） 天然瓊脂糖（Sepharose、Bio-gel A） 交聯(lián)瓊脂糖（Sep

3、harose CL-） 聚丙烯酰胺凝膠（Bio-gel） 交聯(lián)葡聚糖 雙丙烯酰胺共聚凝膠（Sephacry1） 交聯(lián)葡聚糖與葡聚糖共價(jià)結(jié)合的凝膠（Superdex）,一、 葡聚糖凝膠,商品名：Sephadex，由葡聚糖（右旋糖酐）（G型）和3-氯-1，2-環(huán)氧丙烷（交聯(lián)劑）以醚鏈相互交聯(lián)而成的。在交聯(lián)葡聚糖G-25和G-50中分別加入羥丙基基團(tuán)反應(yīng)，即可構(gòu)成LH型烷基化葡聚糖凝膠。,1理化性質(zhì),葡聚糖凝膠：白色珠狀顆粒，在顯微鏡下可見(jiàn)其表面的網(wǎng)狀皺紋。含大量羥基，親水性好，在水溶液或電解質(zhì)溶液中極易膨脹。不同型號(hào)的葡聚糖凝膠的交聯(lián)度不同，膨脹度、吸水量、篩孔的大小和分組范圍有明顯的差異。,1）

4、以G型葡聚糖凝膠作為固定相，以水溶液作為流動(dòng)相，對(duì)水溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的層析方法稱(chēng)為葡聚糖凝膠過(guò)濾層析。 2）以LH型葡聚糖凝膠作為固定相，以有機(jī)溶劑為流動(dòng)相，對(duì)脂溶性物質(zhì)進(jìn)行分離的層析方法稱(chēng)為葡聚糖凝膠滲透層析。,2穩(wěn)定性,葡聚糖凝膠在水溶液、鹽溶液、堿溶液、弱酸溶液和有機(jī)溶劑中穩(wěn)定，不溶解，很少產(chǎn)生化學(xué)降解。 在中性條件下，葡聚糖凝膠懸浮液可高溫（120）消毒30分鐘，性質(zhì)不變。在0.1mol/L HCl 溶液中浸泡1-2小時(shí)，在0.02mol/L HCl 溶液中浸泡6個(gè)月以上，對(duì)分離效果無(wú)明顯的影響。,當(dāng)暴露于強(qiáng)酸或氧化劑溶液時(shí)，易使糖苷鍵水解斷裂。 葡聚糖凝膠欲在室溫下長(zhǎng)期保存時(shí)，應(yīng)加入

5、適量的防腐劑如氯仿、疊氮化鈉等。否則，微生物將生長(zhǎng)。,3吸附性,葡聚糖凝膠系弱酸性物質(zhì)，因?yàn)楹然鶊F(tuán)。該基團(tuán)能與分離物中電荷基團(tuán)（堿性蛋白質(zhì)）發(fā)生吸附作用，可提高洗脫液的離子強(qiáng)度。但當(dāng)離子強(qiáng)度大于0.05時(shí)，對(duì)弱堿性蛋白質(zhì)就無(wú)吸附力了。葡聚糖凝膠層析時(shí)，用含有 NaCl 的緩沖液作洗脫液。,二、瓊脂糖凝膠,瓊脂糖是由D-半乳糖和3、6脫水的L-半乳糖連接構(gòu)成的多糖鏈，在100時(shí)呈液態(tài)，當(dāng)溫度在45以下時(shí)，以氫鍵方式相互連接成線性的雙鏈單環(huán)的瓊脂糖，經(jīng)凝聚即呈束狀的瓊脂糖凝膠。 對(duì)尿素和鹽酸胍等破壞氫鍵的試劑有較強(qiáng)的抵抗力，在pH 4.0-9.0的緩沖液中是穩(wěn)定的。,瓊脂糖的商品名稱(chēng)是因生產(chǎn)廠

6、家不同而異：瑞典稱(chēng) Sepharose美國(guó)稱(chēng) Bio-gel A英國(guó)稱(chēng) Segavac丹麥稱(chēng) Gelarose我國(guó)的同類(lèi)產(chǎn)品與瑞典相同，這些瓊脂糖中除Segavac外，都是以珠狀瓊脂糖凝膠形式出售。,瓊脂糖凝膠按其濃度分：Sepharose 2B（2濃度）、4B（4）和6B（6）。Sepharose 6B的機(jī)械強(qiáng)度大于2B，但是篩孔小于2B。 瓊脂糖凝膠在干燥狀態(tài)下易破裂，一般存放在含防腐劑的水溶液中，避免劇烈的攪動(dòng)。,CL型交聯(lián)瓊脂糖：Sepharose 與1, 3-二溴異丙醇（1, 3-dibromopropanol）在強(qiáng)堿性條件生成的。 優(yōu)點(diǎn)： 其篩孔與同濃度的、未交聯(lián)的瓊脂糖相同，熱穩(wěn)

7、定性與化學(xué)穩(wěn)定性好 可在廣范圍的pH溶液（pH3-14）中使用，用較強(qiáng)的堿溶液短時(shí)間處理，性能不會(huì)改變。 缺點(diǎn)：在氧化劑存在下，會(huì)有少量的多糖鏈發(fā)生解聚。,瓊脂糖凝膠的機(jī)械強(qiáng)度和篩孔的穩(wěn)定性都比葡聚糖凝膠好，用瓊脂糖凝膠進(jìn)行柱層析時(shí)，流速可以快些。,三、聚丙烯酰胺凝膠,商品名Bio-gel。是以甲叉雙丙烯酰胺（雙體）作為交聯(lián)劑，以過(guò)硫酸胺為催化劑，N, N, N, N-四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑，將丙烯酰胺（單體）聚合而成的。當(dāng)改變單體濃度時(shí)，就可得吸水率不同的產(chǎn)物，商品型號(hào)有Bio-gel P-2到P-300。,一般聚丙烯酰胺凝膠均制成珠狀顆粒，以干凝膠形式出售，使用前必須溶脹。 特

8、點(diǎn)： 不溶于水和普通有機(jī)溶劑； 能在濃鹽、尿素和胍鹽等溶液中浸泡； 在pH l-10或短時(shí)間超過(guò)此pH值的溶液中較穩(wěn)定； 要避免長(zhǎng)期與強(qiáng)酸和強(qiáng)堿接觸，否則，酰胺基將迅速發(fā)生分解（高溫條件）。,缺點(diǎn)： 對(duì)芳香族的、酸性和堿性的化合物稍有吸附現(xiàn)象，使用離子強(qiáng)度略高的洗脫液操作可以克服。,四、 Sephacryl,Sephacryl 由烷基葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺共價(jià)交聯(lián)制成的。屬硬性凝膠，具有一定大小的篩孔和少量的羧基基團(tuán)。 Sephacryl 吸水時(shí)，其珠狀顆粒直徑平均值為70 um。通常是用于水相系統(tǒng)中。若在有機(jī)相系統(tǒng)使用時(shí)，其孔徑大小略有變化。,特點(diǎn)：,a. 在所有的溶劑中不溶解，化學(xué)降解很少

9、； b. 可在pH 2-11范圍內(nèi)使用，當(dāng)pH低時(shí)，葡聚糖鏈將發(fā)生少許水解作用；在0.2mol/L NaOH 溶液中（室溫下）處理100小時(shí)，對(duì)其低流速和多孔性沒(méi)有明顯影響； c. 清潔劑（如SDS）、6mol/L鹽酸胍和8 mol/L尿素溶液可作洗脫劑，高溫（120）消毒（pH= 7時(shí)）處理后，層析性質(zhì)沒(méi)明顯變化。,Sephacryl 能用于分離蛋白質(zhì)、核酸、多糖和蛋白聚糖（Proteoglycans）。也可用于大的病毒顆粒（直徑 300-400 nm）的分離。層析時(shí)，用細(xì)顆粒凝膠分辨率高。,第二節(jié) 基本原理,凝膠過(guò)濾層析的基質(zhì)是具有立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、篩孔直徑一致，且呈珠狀顆粒的物質(zhì)。 它可以完

10、全或部分排阻大分子化合物；而不能排阻小分子化合物，讓其在篩孔中自由地?cái)U(kuò)散、滲透。 凝膠層析柱排阻的化合物范圍在0-100之間。,洗脫體積（Ve）包括自加入樣品時(shí)算起，到組分最大濃度出現(xiàn)時(shí)所流出的體積。Ve一般是介于Vo 和Vt之間的。 對(duì)于完全排阻的大分子由于其不進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)， 故其洗脫體積 Ve Vo 對(duì)于完全滲透的小分子由于它可以存在于凝膠柱整個(gè)體積內(nèi)，故其洗脫體積 Ve Vt 分子量介于二者之間的分子，它們的洗脫體積也介于二者之間。,凝膠過(guò)濾的原理,凝膠層析柱洗脫曲線示意圖 完全排阻的大分子 中等分子 完全滲透的小分子,分配系數(shù)：表示某個(gè)組分在內(nèi)水體積和在外水體積中的濃度分配關(guān)系。,K

11、av值的大小和凝膠柱床的總體積（Vt）、外水體積（Vo）以及分離物本身的洗脫體積（Ve）有關(guān)。 Vo和Vt可以通過(guò)測(cè)定得到，測(cè)定了某個(gè)組分的Ve就可以得到這個(gè)組分的分配系數(shù)。在一定的條件下， Vt和Vo都是恒定值。 大分子先從柱中流出Ve值小Kav值小 小分子后從柱中流出Ve值大Kav值大,對(duì)于完全排阻的大分子 Ve Vo 故 Kav 0 對(duì)于完全滲透的小分子 Ve Vt 故 Kav 1 Kav是判斷分離效果的一個(gè)重要參數(shù)，同時(shí)也是測(cè)定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的一個(gè)依據(jù)。 對(duì)于某一型號(hào)的凝膠，在一定的分子質(zhì)量范圍內(nèi)，各個(gè)組分的Kav與其分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系： Kav b lgMr+c 由于Ve 和K

12、av也成線性關(guān)系所以同樣有： Ve b lgMr+c,通過(guò)將一些已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在同一凝膠柱上以相同條件進(jìn)行洗脫，分別測(cè)定Ve 或Kav，并根據(jù)上述的線性關(guān)系繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在相同條件下測(cè)定未知樣品的Ve 或Kav，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可求出其分子質(zhì)量。,蛋白質(zhì)通過(guò)凝膠柱的速度即洗脫體積與其分子量有關(guān)，,LogM,A,B,C,LogM測(cè),V測(cè),先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的 Ve，并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì) Ve作圖得一直線，再測(cè)出 待測(cè)樣品的Ve，查標(biāo)準(zhǔn)曲 線即可確定分子量。,LogM=k1-k2Ve,（Ve為洗脫體積）,影響篩分效果的因素：,1）操作條件：如基質(zhì)的顆粒大小、均勻度、篩孔直徑和床體積的大

13、小、洗脫液的流速以及樣品的種類(lèi)等；2）Kav值的差異性。Kav值差異性大，分離效果好；Kav值差異性小，等于1或等于零（即使樣品個(gè)各組分的分子量相差很大），則分離效果差，或根本不能分開(kāi)。,第三節(jié) 操 作,一、凝膠的選擇和處理 1凝膠的選樣 （1）型號(hào)凝膠型號(hào)很多。型號(hào)不同，篩分范圍也不同。市售的Sephadex的分離范圍，常用高聚糖或球蛋白測(cè)定。Sephadex G型適宜于分離蛋白質(zhì)。若用于分離核酸，則受其空間結(jié)構(gòu)和所帶基團(tuán)的影響，選用高于它們分子量范圍的型號(hào)，或者選用適當(dāng)型號(hào)的生物膠和Sephacryl。,在去除蛋白質(zhì)溶液中的鹽類(lèi)時(shí)，可選用凝膠Sephadex G-25。當(dāng)溶液通過(guò)G-25柱

14、時(shí)，蛋白質(zhì)被排阻在凝膠外面先流出來(lái)，而鹽類(lèi)擴(kuò)散到凝膠網(wǎng)孔里后流出來(lái)。這樣蛋白質(zhì)就得到純化。 一般來(lái)說(shuō)，在規(guī)定的篩分范圍內(nèi)，混合物之間分子量差別越大，分離的效果越好。,（2）粒度,凝膠的粒度有粗有細(xì)（與交聯(lián)度無(wú)關(guān)）。細(xì)顆粒凝膠之間空間小、裝柱易均一，分離效果好（與粗顆粒凝膠相比），但流速慢，采用大直徑的層析柱?？捎糜谛⌒驮囼?yàn)，能得到滿(mǎn)意結(jié)果。粗顆粒凝膠流速快，宜用小直徑的層析柱，如操作得當(dāng)，可得到較滿(mǎn)意的結(jié)果。,2凝膠用量的計(jì)算,根據(jù)層析柱的體積和干凝膠的膨脹度，可計(jì)算出所需干凝膠的用量： 干凝膠用量（g）=r2 h / 膨脹度（床體積/克干膠） 用此法計(jì)算出的干凝膠用量還需增加 10%-20，

15、因?yàn)槟z在處理過(guò)程中會(huì)有一部分損失。,3凝膠的處理,將干凝膠傾入5-10倍的蒸餾水中，根據(jù)凝膠溶脹所需的時(shí)間充分浸泡，除去表面懸浮的小顆粒，再用0.5mol/L NaOH-0.5mol NaCl 溶液在室溫下浸泡30min，抽濾除去堿液，用蒸餾水洗至中性，浸泡于蒸餾水和平衡液中抽氣，除去凝膠顆粒中空隙中的氣泡，或采用加熱煮沸法，不僅去除氣泡，還能加快凝膠的溶脹，但必須避免在酸或堿溶液中加熱。,二、 凝膠柱的制備,1. 柱的選擇直接影響分離效果 當(dāng)用同樣直徑的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)，長(zhǎng)層析柱比短的分辨率高；當(dāng)用同樣長(zhǎng)度的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)，層析柱直徑大的比小的分辨率高； 當(dāng)用同樣體積

16、的層析柱分離兩種以上的物質(zhì)時(shí)，仍是層析柱長(zhǎng)的比短的分辨率高。 理想的層析柱的直徑與長(zhǎng)度之比是1:25-1:100。層析柱最好有夾套，可控制溫度，重復(fù)性好。,2裝柱,裝柱的具體操作與要求按吸附柱層析的裝柱方法進(jìn)行。,裝柱,1）裝柱前，用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過(guò)多的溶液傾出。 2） 先關(guān)閉層析柱出水口，向柱管內(nèi)加入約1/3柱容積的洗脫液，然后邊攪拌，邊將薄漿狀的凝膠液連續(xù)傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后，打開(kāi)柱的出口，調(diào)節(jié)合適的流速，使凝膠繼續(xù)沉集，待沉集的膠面上升到離柱的頂端約5cm處時(shí)停止裝柱，關(guān)閉出水口。,3凝膠柱的鑒定,將藍(lán)色葡聚糖-2000，或紅色葡聚糖或

17、細(xì)胞色素C或血紅蛋白等配成2毫克/毫升的溶液過(guò)柱，觀察色帶是否均勻下降。如均勻下降，則表明柱中凝膠是均勻的、柱中沒(méi)有裂縫和氣泡，否則重新裝柱。如鑒定時(shí)采用的是蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)，有兩個(gè)作用：1）鑒定柱子；2）克服柱子對(duì)某些分離物的不可逆吸附作用。,三、加樣與洗脫,1加樣 加樣量與測(cè)定方法和層析柱大小有關(guān)。 測(cè)定樣品含量的方法靈敏或床體積小時(shí)，加樣量可少。否則反之。 加樣量掌握得當(dāng)，可提高分離效果。,一般來(lái)說(shuō)，加樣量越少，或加樣體積越?。悠窛舛雀邥r(shí)），分辨率越高。 當(dāng)用于樣品的制備和脫鹽時(shí)，加樣量應(yīng)在不影響分辨率的前提下增大。 究竟加樣體積多少為宜？這要視被分離物在層析柱的分配系數(shù)（Kav）或洗脫體

18、積（Ve）來(lái)決定。,分離效果與加樣體積、被分離樣品在層析柱中的洗脫體積或分配系數(shù)，以及凝膠床的體積有關(guān)。為了提高分離效果，在一定范圍內(nèi)，加樣體積越小越好。例如，在蛋白質(zhì)溶液中脫鹽時(shí)，因加樣量過(guò)大會(huì)產(chǎn)生分離不完全的現(xiàn)象。而加樣量減少時(shí)，則產(chǎn)生良好的分離效果。,樣品的粘度也影響層析的分辨率。樣品的粘度大（11.8)比小的分辨率低。一般樣品粘度以小于2，或與洗脫液的粘度相當(dāng)為宜。,2洗脫,所有的洗脫液均以能溶解被洗脫物質(zhì)和不使其變性或失活為原則。一般都以單一緩沖液（如磷酸緩沖液、Tris-HCl 緩沖液等），或者鹽溶液作為洗脫液。也可用蒸餾水作洗脫液。,洗脫時(shí)的流速要嚴(yán)格控制。否則收集的每一部分洗脫體積就不會(huì)恒定。 控制流速的最好裝置：恒流泵（微量泵），它可以使流速恒定，還可以使其在較大范圍內(nèi)選擇。 若無(wú)此裝置，可用控制操作壓的辦法進(jìn)行。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室采用此種方法控制流速。,洗脫流速慢，分離效果就好，但是太慢時(shí)也會(huì)因擴(kuò)散加劇而降低分離效果。加樣后，經(jīng)洗脫收集到的每管洗脫液，可選用適當(dāng)?shù)姆椒ㄟM(jìn)行定性和定量測(cè)定。,四、凝膠柱的再生和保存,1. 再生 僅使用一次的凝膠柱，可