藥品的無菌檢查技術(shù).ppt

1、藥物無菌檢查技術(shù)，由：王綏福(高級講師)蘇慧紅(助理講師)于2005年3月在廣州醫(yī)藥中專學校任教，教學目標：1。通過直接接種了解無菌檢查的操作。2.知道如何準備無菌測試的測試溶液。3.熟悉無菌檢查結(jié)果的判斷。4.學習使用膜無菌檢查。5、掌握影響無菌檢查的因素及解決方法。教學重點：直接接種法無菌檢查的操作。教學難點：膜無菌檢查的使用。在第五節(jié)直接接種檢驗技術(shù)中，藥品無菌檢驗方法的具體操作方法可分為直接接種法和膜過濾法。中國藥典(2005年版)指出，如果測試樣品的性質(zhì)允許，應首選膜過濾。對試驗產(chǎn)品進行無菌試驗時，試驗方法和試驗條件應與驗證方法相同。直接接種法是指將每支(或每瓶)試樣按規(guī)定量接種到裝

2、有巰基乙酸液體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的每個容器中。除非另有規(guī)定，每個容器中培養(yǎng)基的量應滿足接種試樣的體積不得超過培養(yǎng)基體積的10%的要求。同時，每管中巰基乙酸液體培養(yǎng)基的量不得少于15毫升，每管中改良馬丁培養(yǎng)基的量不得少于10毫升。用同樣的方法驗證培養(yǎng)基的數(shù)量和高度；用每種培養(yǎng)基接種的試管數(shù)量與測試產(chǎn)品的數(shù)量相同。由于直接接種法具有操作簡單的優(yōu)點，特別適用于無抑菌和防腐作用的藥物的無菌檢查。據(jù)統(tǒng)計，中國藥典(2005年版二部)共有57個品種(39.3%)受本法規(guī)定。在操作過程中，待測試容器的表面或外包裝應通過浸入或用適當?shù)南緞┠Σ吝M行徹底消毒。如果容器內(nèi)有一定程度的真空，可使用適當?shù)臒o菌設備

3、(如帶滅菌過濾器的針頭)將無菌空氣引入待測容器內(nèi)，然后根據(jù)無菌操作打開容器取出內(nèi)容物。無論采用何種檢驗方法，檢驗操作過程包括兩個步驟：檢驗對象的處理、接種、培養(yǎng)和觀察。除非另有規(guī)定，試驗樣品應根據(jù)不同樣品通過以下方法進行處理和接種。1懸浮液和其他未澄清的水溶液最容易操作。在無菌操作下，取一定量的供試品，接種到每管培養(yǎng)基中。2.取規(guī)定量的固體制劑試樣，在無菌操作下直接接種到各管的培養(yǎng)基中；或向試樣中加入合適的溶劑進行溶解，或根據(jù)標簽說明重新溶解后，進行規(guī)定量的無菌操作，并將其接種到每管培養(yǎng)基中。取規(guī)定量的3-內(nèi)酰胺或磺胺試樣，混合，加入適量的無菌內(nèi)酰胺酶溶液或?qū)Π被郊姿崛芤褐泻?，接種到每管培養(yǎng)

4、基中或直接接種到每管含內(nèi)酰胺酶或?qū)Π被郊姿岬呐囵B(yǎng)基中。4.取規(guī)定量的水不溶性試樣，混合，加入適量的聚山梨酯80或其他合適的乳化劑和稀釋劑進行乳化，并接種到每管培養(yǎng)基中?；蛘咧苯咏臃N到含有聚山梨酯80或其他合適乳化劑的每一個試管培養(yǎng)基中。1。試驗產(chǎn)品的處理和接種。將規(guī)定數(shù)量的測試產(chǎn)品包扎好，用無菌操作拆開每個包裝，從不同部位切下約100毫克或3厘米的測試產(chǎn)品；接種適量的培養(yǎng)基，使其足以將試驗品浸入每個試管中。6.腸子、縫線等。受試產(chǎn)品的腸、縫合線和其他一次性醫(yī)用材料應按照規(guī)定的數(shù)量裝入最小的包裝中，無菌打開包裝，并接種在適量的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基應足以將受試產(chǎn)品浸入每個試管中。7.服用規(guī)定量的無

5、菌醫(yī)療器械。如有必要，將它們打碎或切成小塊，并接種到一個丙烯中(陰性對照的目的是表明在接受試驗產(chǎn)品之前的培養(yǎng)基、試驗產(chǎn)品的稀釋劑和無菌試驗操作都是無菌生長，并且試驗產(chǎn)品陽性檢測的細菌確實是試驗產(chǎn)品。)如果測試溶液未經(jīng)驗證，可以同時進行。方法見第5節(jié)直接接種法的驗證試驗。接種陽性對照，根據(jù)GMP和中國藥典要求，陽性對照的接種應在陽性對照室內(nèi)進行，防止交叉污染。接種時，應根據(jù)驗證試驗結(jié)果選擇陽性對照菌。方法是：將100 cfu以下的陽性對照菌接種到相應的培養(yǎng)基中(菌液的配制同同一培養(yǎng)基的敏感試驗菌液)。測試樣品的量與接種在每個培養(yǎng)基中用于測試樣品無菌測試的樣品的量相同(見表62和表63)。陽性對照

6、試管應在4872小時內(nèi)生長良好。培養(yǎng)觀察、培養(yǎng)基培養(yǎng)、按規(guī)定溫度培養(yǎng)14天，每天觀察記錄濁度、新鮮培養(yǎng)基或交叉斜面培養(yǎng)基、培養(yǎng)液涂片、染色、鏡檢，并判斷是否有細菌。3.從結(jié)果判斷，受試產(chǎn)品符合要求，培養(yǎng)基管澄清，或混濁但已確認無菌生長，受試產(chǎn)品不符合要求，當滿足以下至少一個條件時，測試結(jié)果無效：無菌檢查相關(guān)設施的微生物監(jiān)測數(shù)據(jù)顯示不符合要求。對無菌測試過程的回顧表明，該操作程序是錯誤的。細菌在陰性對照試管中生長。在鑒定試管中生長的微生物后，證實微生物的生長是由無菌測試和/或無菌操作技術(shù)中使用的不當物品引起的。如果測試被確認無效，請重試。再次嘗試時，重新拿同樣數(shù)量的測試產(chǎn)品，并依法再次嘗試。如果

7、測試產(chǎn)品無菌生長，則判定測試產(chǎn)品符合要求；如果細菌生長，則判斷被測產(chǎn)品不符合規(guī)定。直接接種法，試驗樣品無抗菌作用，取樣，接種于培養(yǎng)基中巰基乙酸液體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基試管中，培養(yǎng)，每天觀察14天，報告，澄清無混濁，合格，混濁(疑似病例)，鏡檢和再培養(yǎng)，確認，無菌細菌，不合格，培養(yǎng)基，直接接種具有適用性廣，準確性強的特點。中國藥典(2005年版)規(guī)定，如果測試樣品的性質(zhì)允許，應首選膜過濾。據(jù)統(tǒng)計，中國藥典(2005年版，第二部分)使用該方法的品種有88個(占60.7%)。膜過濾方法可采用封閉式膜過濾器(圖62)或普通膜過濾器(圖63)，但應首選封閉式膜過濾器。圖6-4: HTY微濾膜孔徑測試儀

8、圖：細菌被濾膜堵塞。一批過濾膜通常是新購買的。由于不同制造商生產(chǎn)的相同規(guī)格的過濾膜質(zhì)量不一致，因此應使用以下三種方法之一來測試過濾膜的孔徑。只有符合要求的才能用于無菌檢查。(1)氣泡法的原理是測量濾膜的孔徑，可以用氣泡壓力法測量(圖6-4)。將濾膜浸入水中，使其完全濕潤，然后用鑷子夾住濾膜，放在泡點測量裝置(上?；S生產(chǎn)的DY25)或濾膜孔徑測試儀上。在膜上放一個與濾膜大小相同的尼龍網(wǎng)，加一個多孔板，擰緊螺旋固定環(huán)，在多孔板上加入35毫米深的水(注意消除氣泡)，關(guān)閉放氣閥，啟動空氣壓縮機或氮氣閥。使壓力緩慢上升，注意觀察水面上產(chǎn)生的第一個氣泡，并記錄壓力表的壓力，泡點壓力不應小于0.2 MP

9、a(2.2 kg/cm2)。水流法的原理是在一定的壓力下，水的定量流動中國藥典沒有規(guī)定膜的過濾速度，但藥典()規(guī)定膜的直徑為47毫米；低于93千帕(700毫米汞柱)。流速為5575毫米/分鐘。該方法操作簡單，但誤差較大。(3)細菌過濾法，其原理是利用細菌細胞大小穩(wěn)定的特點，將標準菌株制備的菌液用待測濾膜過濾，培養(yǎng)后濾液無菌生長，使濾膜孔徑符合要求。常用的細菌是粘質(zhì)沙雷氏菌(CMCC(B)41002)。將該細菌的斜面培養(yǎng)物接種在營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在3035下培養(yǎng)1820小時，用0.9氯化鈉溶液(相當于7x105cfu/ml)稀釋至10-3，然后將1毫升該細菌溶液加入50毫升0.9氯化鈉溶液中，并

10、通過膜過濾進行過濾。取5毫升濾液，接種到40毫升營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，在3035培養(yǎng)24小時，無菌生長。當濾膜加入到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基管中時，細菌會生長，證明濾膜具有合格的過濾效果。三、膜過濾檢驗的操作，應根據(jù)不同的樣品和不同的樣品處理方法。應首選封閉式薄膜過濾器，薄膜孔徑不超過0.45米，直徑為47毫米。根據(jù)試樣及其溶劑的特性，選擇濾膜材料。過濾器和薄膜在使用前應通過適當?shù)姆椒ㄟM行消毒。使用時，應保證過濾前后膜的完整性。在過濾水溶性測試溶液之前，先過濾少量洗滌液以濕潤濾膜。油樣的濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為了充分發(fā)揮膜的最大過濾效率，應注意保持測試液和沖洗液覆蓋整個膜表面。供試品溶液經(jīng)濾膜過濾

11、后，如需用沖洗液沖洗濾膜，每次沖洗量為100毫升，總過濾量不宜過大，以免損壞濾膜上的微生物。不同測試產(chǎn)品的處理操作介紹如下：(1)取規(guī)定量的水溶液，直接過濾，或?qū)⑵浠烊胙b有適量稀釋劑的無菌容器中，混合均勻后立即過濾。如果被測產(chǎn)品有抑菌作用或含有防腐劑，濾膜必須用適量的沖洗液沖洗，沖洗次數(shù)不得少于三次。清洗后，如果使用封閉式過濾器，將100毫升巰基乙酸液體介質(zhì)和改良的馬丁介質(zhì)加入相應的濾筒中。如果只使用薄膜過濾器，無菌取出濾膜，將其切成3等份；將它們置于含有50毫升巰基乙酸液體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基的容器中，其中一個接種陽性對照值作為陽性對照。2、取規(guī)定量的水溶性固體制劑進行試驗，加入適當?shù)娜軇?/p>

12、使其溶解或按標簽說明重新溶解，然后按水溶液法進行試驗。取規(guī)定量的3-內(nèi)酰胺試驗產(chǎn)品，按照水溶液或固體制劑試驗產(chǎn)品的處理方法進行處理，立即過濾，并用合適的洗滌液洗滌濾膜。然后，用含有適量-內(nèi)酰胺酶的沖洗液除去殘留在濾筒和濾膜上的抗生素，然后接種培養(yǎng)基，必要時可向培養(yǎng)基中加入少量-內(nèi)酰胺酶；或者將濾膜直接連接到含有適量-內(nèi)酰胺酶的培養(yǎng)基上。接種培養(yǎng)基的方法應按照水溶液試驗項目下的方法操作。4、取規(guī)定量的水不溶性制劑，直接過濾；或者混合并溶解在含有聚山梨醇酯80或其它合適乳化劑的稀釋劑中，充分混合并過濾。用含01%1%聚山梨醇酯80的沖洗液沖洗濾膜至少三次。濾膜在含或不含聚山梨醇酯80的培養(yǎng)基中培養(yǎng)

13、。培養(yǎng)基的接種應按照水溶液試驗項目下的方法進行。5取規(guī)定量的軟膏和可溶于異丙醇的粘稠油溶液通過無菌操作在溶解器上端快速鉆一個小孔，釋放推進劑后無菌打開容器，然后按照水溶性制劑或非水溶性制劑下的方法操作。7、取規(guī)定量的裝有藥物的注射器，安裝無菌針頭(不包括在包裝中)，吸入稀釋劑或?qū)⑵淙芙庠跇撕炆巷@示的溶劑中(如有必要)，然后按照水溶性制劑或非水溶性供試品下的方法操作。同時，應采用直接接種法檢查包裝中無菌針頭的無菌性。8、帶導管的醫(yī)療器械(輸血袋、輸液袋等)取規(guī)定量的測試產(chǎn)品，分別用5010毫升沖洗液沖洗每個最小包裝的內(nèi)壁，將沖洗液收集在無菌容器中，然后按照水溶液測試產(chǎn)品的方法操作。同時，應使用直

14、接接種法檢查包裝中針頭的無菌性。4、培養(yǎng)和觀察采用直接接種檢驗法。五、結(jié)果判斷與直接接種檢查方法相同。開啟膜過濾操作，將藥物加入無菌稀釋液溶液中，用無菌稀釋液溶劑沖洗濾膜三次，取下濾膜，取下上層濾紙，將濾膜分成三部分，加入巰基乙酸液體培養(yǎng)基和改良馬丁培養(yǎng)基試管，在規(guī)定的溫度和時間下培養(yǎng)，用膜過濾法檢查教學膜，并檢查第7節(jié)中各種中和(滅活)劑的作用機理。1.巰基乙酸鹽、半胱氨酸和巰基化合物的作用機理。這些化合物可以與重金屬結(jié)合，因為它們含有巰基，所以它們可以減輕或防止含有汞和砷的重金屬化合物對細菌的毒性或抑制作用。此外，巰基乙酸鹽可以保持培養(yǎng)基中的氧化還原電位，尤其是保持培養(yǎng)基下層的厭氧狀態(tài)，有利于厭氧菌的生長。半胱氨酸可以用作細菌生長的氮源。2.青霉素酶的作用機理青霉素酶是目前較為理想的青霉素滅活劑，它能通過破壞青霉素結(jié)構(gòu)中的內(nèi)酰胺環(huán)，快速、徹底、特異地滅活青霉素?；前奉愃幬锏姆肿咏Y(jié)構(gòu)與對氨基苯甲酸非常相似，因此它可以競爭性地取代對氨基苯甲酸在葉酸結(jié)構(gòu)中的位