電泳圖譜的圖像分析及細胞蛋白譜的建立

1、蛋白質(zhì)組學，發(fā)表教師：張玲2007.10.11，回顧，F(xiàn)unctional analysis，、State 1，state 1，2de，第四章電泳圖像分析與細胞蛋白譜的建立， 課程內(nèi)容掌握：熟悉蛋白電泳圖像分析系統(tǒng)：使用PDQuest軟件自動檢測、匹配和分析了解：二維電泳圖像數(shù)據(jù)庫、電泳圖像的圖像分析概要what can we get from image analysis？ 雙軸凝膠電泳技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學研究的主要技術(shù)之一，雙軸電泳可以根據(jù)等電點和分子量一次分離數(shù)千種蛋白質(zhì)，在染色的蛋白質(zhì)再PAGE上形成密度不同、分布不均勻的復(fù)雜點圖案。 如何有效地分析雙向凝膠電泳圖譜，如何檢測、定量、比

2、較、分析圖像上的蛋白質(zhì)點，挖掘有價值的蛋白質(zhì)點信息是雙向電泳分析軟件亟待解決的問題。PDQuest軟件概述、PDQuest軟件顯示(imaging )、分析(analyzing )雙向電泳數(shù)據(jù)庫檢索的封裝硬件：一定的計算機配置、Pentirm 166處理器、64M內(nèi)存、3G硬件1000 windows操作系統(tǒng)軟件： PDQuest雙軸凝膠圖像分析軟件、Bio-Rad Laboratory、Hercules、CA、PDQuest軟件的使用、以PDQUEST 2-D分析軟件為例的雙軸電泳分析的基本實驗過程凝膠的圖像處理分析和細胞蛋白光譜的建立，典型的工藝凝膠圖像的掃描：圖像加工：斑點檢測和定量：凝

3、膠配方：數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)提示(report) 2-DE數(shù)據(jù)庫的建立：PDQuest軟件， PDQUEST 2-D分析軟件一圖像采集與加工：雙斑點檢測三斑點匹配四數(shù)據(jù)分析與輸出，PDQuest軟件的使用，一、圖像采集與加工，一、掃描：凝膠染色后用清華紫光掃描儀掃描，透射模式，全色rgg 2 .圖像加工：用PDQUEST 2-D解析軟件打開以tiff格式保存的文件即可。 (單擊“打開”圖標和“文件”菜單，選擇“打開”命令，選擇要保存二維圖像文件的光盤、路徑和文件名，然后雙擊文件名或單擊“打開”以打開二維圖像文件將自動打開以tiff格式保存的文件。單擊工具欄中的“control the image d

4、isplay”圖標，將顯示更改此對話框中的“High”和“Low”值以更改亮度的對話框。 工具欄的crop可以剪切沒有蛋白質(zhì)點的凝膠邊緣部分，降低分析的復(fù)雜性，但請注意，希望您分析的多個凝膠圖像剪切成相同大小。 (操作時選擇其中一個凝膠圖像，選擇要切斷的區(qū)域，然后在imageadvancecropsavecropsettings中輸入保存了crop的設(shè)定條件的名稱， 在切斷其他圖像時，只要選擇以前在imageadvancecroploadcropsettings中保存的名稱即可)二、點檢查、圖像的取入和加工后進行點檢查。 PDQUEST 2-D分析軟件通過被稱為“蛋白質(zhì)點檢查指南(spot i

5、dentification wizard )”的程序?qū)崿F(xiàn)。 然后單擊spot菜單并選擇spot標識向?qū)С绦颉?該程序首先需要手動設(shè)定最小光點、最弱光點、最大光點、最小光點、背景值等檢測殘奧參數(shù)，然后程序進行自動檢測，調(diào)整檢測的靈敏度，如果檢測效果不理想，則重復(fù)該步驟。 程序允許您手動調(diào)整條紋、背景、斑點和其他選項。 設(shè)定這些殘奧參數(shù)后，點擊Find spot centers，結(jié)果在凝膠圖像中檢測出的斑點以“字(Spot Crosshairs )”顯示，使檢測出的蛋白質(zhì)斑點盡量適合肉眼觀察。如果輸入要保存在Parameter Set項中的名稱，則將保存蛋白質(zhì)斑點的殘奧儀表，保存的殘奧儀表將自動檢

6、測所有2d凝膠中的蛋白質(zhì)斑點。 單擊“Process all gels”后，將顯示“Auto-detect spots”窗口，您可以在其中選擇需要斑點檢測的凝膠圖像(這些凝膠)。完成蛋白質(zhì)斑點檢測后，軟件將自動關(guān)閉“gel image”和“gel spot” 在進行斑點檢查時，為了將被污染的非蛋白質(zhì)點識別為蛋白質(zhì)點，或者將本來一個蛋白質(zhì)點識別為兩個蛋白質(zhì)點，或者錯誤地識別相反的情況。 因此，在匹配之前，可以同時打開gel掃描、gel圖像和gel spot圖，然后單擊“編輯spot工具”以添加斑點和移除斑點對話框三、PDQUEST可以建立Matchset，以便在完成斑點匹配和蛋白質(zhì)斑點檢測之后，

7、對不同凝膠中的蛋白質(zhì)斑點的變化進行比較分析。 單擊“匹配創(chuàng)建匹配”(matchcreat Matchset )將顯示“匹配”(matchset )對話框，您可以在其中輸入文件名、保存路徑、為gelspot圖像選擇(選擇)或上載文件名，然后單擊整個Matchset在單個窗口中表示，其中的子窗口分別用于表示參考圖像(用REF表示)和成員橡膠圖像(member gel )。 Matchset完成后，接下來設(shè)置標記點，其作用是將凝膠上的蛋白點與排列位置匹配。 單擊工具欄上的“匹配工具”圖標將顯示一個包含斑點匹配工具的窗口，如landmark、unlandmark、match gel和match all

8、 gels以及“匹配”菜單。 標記點識別良好，并且優(yōu)選選擇所有成員膠上出現(xiàn)的蛋白質(zhì)斑點，盡量避開蛋白質(zhì)斑點聚集的地方，以不同倍率確定該蛋白質(zhì)斑點在所有成員膠上為同一蛋白質(zhì)斑點。 只要設(shè)置至少2個標記點，就可以利用PDQUEST的自動匹配功能完成不同凝膠上的蛋白質(zhì)斑點的匹配。 一般設(shè)置的地標斑點個數(shù)為總斑點的10%左右，分別用肉眼檢查應(yīng)該一致的斑點是否一致。 可以手動編輯錯誤匹配的蛋白質(zhì)斑點或未識別的匹配。 您也可以在此處執(zhí)行斑點編輯功能，然后單擊“viewinterchange all images”，使所有成員的膠水和參考膠水在Gel spot狀態(tài)下變成Gel image，在Gel imag

9、e狀態(tài)下進行“Edit Spot Tools”，編輯蛋白質(zhì)斑點標記點用綠色三角形標記，每種漿料上匹配的蛋白質(zhì)點用綠色字母標記，匹配的蛋白質(zhì)點不用紅色環(huán)形標記，即表現(xiàn)出差異的蛋白質(zhì)，四，數(shù)據(jù)分析和輸出為了分析蛋白質(zhì)斑點之間的差異表達，PDQUEST提供了多個分析程序，包括蛋白質(zhì)斑點量分析和散點圖工具，可以打開量分析、Matchset，然后使用databaseanalysiscreateanall 下次單擊參照圖時，將出現(xiàn)一個對話框，您可以在其中輸入名稱和類型選項。 選擇“quaape”進行量的比較，有兩種“比較”格式。 一個是Gel，一個橡膠兩個可以相互比較(成員橡膠和參照橡膠只能比較)。 另一

10、個是組，可以將相同樣本的多個橡膠合為一組(這是databasereplicategroup )。然后選擇a和b，分別表示2塊橡膠或2組橡膠。復(fù)制組、選擇支持交叉地址中的已刪除、已刪除或已刪除等選項。 選項的話，可以輸入倍數(shù)關(guān)系。 缺省值為2 times，如果設(shè)置了允許輸入其他數(shù)值的殘奧儀表，則在單擊go時，參考橡膠上會出現(xiàn)黃色圓形標記的蛋白質(zhì)斑點。 如果你選擇Increased BA 2 times，這些黃色圓圈的蛋白質(zhì)斑點在量上是b是a的2倍以上的蛋白質(zhì)點。 為了糾正銀染對蛋白質(zhì)點定量分析的影響，所有點的含量，單一點的光密度值比上膠上所有點的光密度值正常化，單擊“EditNormalize”

11、時，將顯示一個對話框，左上角的enable ne 下面的窗口被激活，在Basis下面選擇totalofallvalize，這樣所有的點都正?；?。 單擊規(guī)范化Normalization、散點工具Scatter plot、Reports下的Scatter plot，顯示散點分析對話框，可選擇x、y軸分別表示1張膠，Markers下的倍數(shù)如果相關(guān)系數(shù)大于0.4，則表示兩者存在較大的相關(guān)，如果小于0.4，則表示比0.2小的相關(guān)，表示沒有相關(guān)。 Reports Scatter plots可讓您列印所有凝膠圖表之間的相關(guān)圖表。 點擊量化直方圖Graphs、ReportsMore GraphsPage G

12、raphs，則在有邊顯示一對化框，顯示所有蛋白質(zhì)點不同膠上的量化直方圖，在顯示要分析的蛋白質(zhì)點的量化直方圖的情況下， 在對話框的“輸入”(Input )下，選擇“分析集”(Analysis set )以顯示一個對話框，在該對話框中，可以在“所有蛋白質(zhì)點”(All Match Spots )或“特定分析的蛋白質(zhì)點”(Specificd Analysis Set )的不同糊上、proteomicsananlysisinthecontrolandexperimental，應(yīng)用，材料：無腔眼金魚胚胎，正常眼金魚胚胎，差異點：量化直方圖：2D Gel Databases膀胱癌等(丹麥centerforgenomereses http:/bio base.dk/CGI-bin/celis e co2dbase大腸桿菌(在NCBI庫內(nèi)) FTP :/NCBI e co2dbase heart-2 d page人類心肌(德國柏林) http:/www.Chemie . pleisshsc-2dpage人類心臟(英國HHE mie heartsciencenter ) http:/www.hare field.n Thames.NHS.uk/nhli/protei