纖維蛋白原的檢測(cè)方法及進(jìn)展

1、李志芳,纖維蛋白原及其檢測(cè)進(jìn)展,即凝血因子I，是血漿中含量最高的一種凝血蛋白是凝血系統(tǒng)的核心蛋白質(zhì)，它在凝血過程的最后階段被凝血酶轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體，最終形成不溶性纖維蛋白凝塊而發(fā)揮血液凝固作用。,纖維蛋白原(flbfinogen，F(xiàn)g),Fg是分子量為340 KDa的血漿糖蛋白，由肝細(xì)胞和巨核細(xì)胞合成，約占血漿總蛋白的2 3 % 。健康人血漿中濃度為2040 gL，電泳分離顯示在2區(qū)帶。 在結(jié)構(gòu)上Fg是由兩條A鏈、兩條B鏈和兩條鏈組成，每三條肽鏈（A、B、肽鏈）絞合成索狀，形成兩條索狀肽鏈，兩者的N-端通過二硫鍵相連，整個(gè)分子成纖維狀。,纖維蛋白原結(jié)構(gòu),纖維蛋白原功能,血漿Fg主要的生理功能

2、是作為凝血蛋白(又稱凝血因子)直接參與體內(nèi)凝血過程，是纖維蛋白的前體，在凝血機(jī)制中參與凝血共同途徑，由可溶性Fg轉(zhuǎn)變?yōu)椴豢扇苄岳w維蛋白，使血液凝固。(主要功能是它的可凝固性),機(jī)制：在凝血酶作用下，纖維蛋白原分子中的兩條鏈的A肽和兩條鏈的B肽都斷裂，形成纖維蛋白單體 ，凝血酶對(duì)纖維蛋白原的 鏈無裂解作用。 纖維蛋白單體生成后即開始聚合成纖維蛋白。在纖維蛋白穩(wěn)定分子（a）作用下，經(jīng)過共價(jià)交聯(lián)的纖維蛋白網(wǎng)更加牢固。纖維蛋白與凝血酶有高親和力，因此纖維蛋白生成后即能吸附凝血酶，有助于局部血凝塊的形成,當(dāng)Fg值超過正常參考范圍(2040 gL)時(shí)，即表示凝血功能異常；若低于15 gL時(shí)，機(jī)體出血的概率

3、明顯增加 Fg同時(shí)又是一種急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，其增加往往是機(jī)體的一種非特異性反應(yīng)，血漿Fg升高（4g/L）見于糖尿病、急性傳染病、腎病綜合癥、妊高癥、心腦血管疾病、惡性腫瘤等 纖維蛋白原減少（2g/L）見于彌散性血管內(nèi)凝血、原發(fā)性纖溶癥、重癥肝炎等,纖維蛋白臨床意義,纖維蛋白原與心腦血管疾病,心腦血管疾病是現(xiàn)代人群中的常見病，其發(fā)生大都存在著Fg的異常增高。 Fg是血漿黏度增高的主要因子,Fg能增強(qiáng)紅細(xì)胞和血小板聚集性，提高全血黏度，使血液處于高凝和高黏狀態(tài)，影響組織血液灌注，促使血栓形成。,纖維蛋白原與腎病糖尿病,腎病綜合征及慢性腎病患者均存在高凝狀態(tài)，F(xiàn)g含量增高為其重要特征。 機(jī)制：尿中大

4、量丟失以白蛋白為主的小分子量蛋白質(zhì)，出現(xiàn)低蛋白血癥，刺激肝臟代償性合成蛋白質(zhì)增多，血漿Fg和凝血因子活性增高被認(rèn)為是肝臟合成蛋白質(zhì)增多的一種表現(xiàn)，這兩種高分子量的凝血前質(zhì)不能由尿丟失，它們?cè)谘獫{中的高濃度、高活性是腎病綜合征血栓形成的部分危險(xiǎn)因素。,糖尿病是血栓前狀態(tài)，其血漿黏度、Fg濃度均明顯高于正常。 改善體內(nèi)血漿黏度和Fg含量對(duì)控制和治療腎病糖尿病有著重要的意義。,纖維蛋白原與DIC,纖維蛋白原減低見于DIC：彌漫性血管內(nèi)凝血，激活纖維蛋白溶解酶原，使血中纖維蛋白溶解酶活力增加，溶解纖維蛋白，消耗體內(nèi)原有的Fg，使其含量減少,纖維蛋白原的檢測(cè)方法,近年來對(duì)纖維蛋白原的測(cè)定日益重視，對(duì)其測(cè)

5、定的精度也提出了更高的要求 ：美國規(guī)定檢測(cè)結(jié)果在靶值20 的范圍內(nèi)，目前測(cè)定主要包括Fg血漿水平、亞組分(HF和LF) 、纖維蛋白單體聚集功能、基因多態(tài)性等幾個(gè)方面，其中血漿Fg含量測(cè)定最為常用 血漿Fg含量測(cè)定方法多達(dá)數(shù)十種，按原理分為三類，即功能、物理化學(xué)和免疫學(xué)測(cè)定法,(一)功能測(cè)定法 該法又稱為可凝固蛋白法，即將Fg作為可凝固蛋白來測(cè)定，因普遍認(rèn)為Fg的主要特性是其可凝性，所以血漿可凝固Fg的檢測(cè)已成為Fg的主要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn),功能測(cè)定法利用Fg特異的2種生化反應(yīng)，即凝血酶的蛋白水解作用和隨后發(fā)生的纖維蛋白單體聚集為纖維蛋白多聚體。在這些 方法中，通過加入凝血酶形成纖維蛋白凝塊后的檢測(cè)手段不

6、同，又可分為重量測(cè)定法、酚試劑比色法、紫外光度法、濁度法和凝血酶凝固時(shí)間法等。,1重量測(cè)定法 將Fg轉(zhuǎn)變成纖維蛋白凝塊經(jīng)反復(fù)洗滌脫水后，用精密天平(精確到0000 1 g)稱重。該法簡單，不需要復(fù)雜的操作或精密儀器，技術(shù)誤差很小。在80年代有一些大型流行病學(xué)研究將該法作為參考方法,2酚試劑比色法 在世界衛(wèi)生組織(wH0)推薦的參考方法出來前曾作為參考方法。該法將過量的凝血酶加入血漿中，將產(chǎn)生的纖維蛋白凝塊洗滌數(shù)次后溶于NaOH溶液中。用FolinCiocalteau酚試劑或Biuret反應(yīng)來測(cè)定。,3.紫外光度法 該法將纖維蛋白凝塊溶解于堿性尿素溶液中，然后通過在280nm波長紫外光直接比色計(jì)

7、算纖維蛋白原的含量 在此基礎(chǔ)上，又發(fā)展成為2種參考方法，即Ancrod法和改良的Jacobsson法,Ancrod法: Ancrod(凝血酶代替品)對(duì)Fg有高特異性，不象凝血酶會(huì)作用于除Fg外的其他幾種血漿蛋白，如因子 。純化的Ancrod只作用于a鏈并釋放A纖維蛋白肽，而不會(huì)被血漿中的肝素抑制，并對(duì)纖維蛋白降解產(chǎn)物靈敏度低。在許多方法不能檢測(cè)到Fg的低濃度血漿中，該法仍有大量凝塊形成，而且比酚試劑比色法重復(fù)性更好。此法在70年代的一些方法學(xué)研究中曾作為參考方法,改良的Jacobsson法 是WHO推薦的參考方法，為第1個(gè)血漿Fg國際標(biāo)準(zhǔn)品(89644)制備時(shí)所推薦使用的方法。該法準(zhǔn)確并滿足2

8、項(xiàng)有效測(cè)定Fg的主要標(biāo)準(zhǔn)：首先通過凝血酶將可凝固的Fg從血漿中分離出來，其次使用了簡便的分光光度法獨(dú)立操作的定量步驟.,4濁度法 該法原理是用凝血酶凝固的血漿，纖維蛋白形成增加了濁度，并達(dá)到一個(gè)與Fg濃度成比例的最后濁度。這種方法靈敏度低，對(duì)Fg的最低檢測(cè)限為0.5 gL。,5動(dòng)態(tài)Fg測(cè)定法(kinetic fibrinogen assay，KFA) 該法基于纖維蛋白凝塊形成的動(dòng)態(tài)反應(yīng)，通過類似凝血酶將Fg轉(zhuǎn)化為纖維蛋白的作用，測(cè)定由于纖維蛋白聚集而引起的濃度增加。該法使用由天然血漿提供的凝血因子，因此非常近似凝血酶和Fg在體內(nèi)的反應(yīng)。KFA法不僅可靠準(zhǔn)確而且可全自動(dòng)化，在常規(guī)檢測(cè)中極為簡便快

9、速。該法與WHO推薦的參考方法和Claus法均有很好的相關(guān)性，且不受肝素和香豆素治療的影響,6. von Clauss法 這是美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)推薦的常規(guī)方法，是最常用的可凝固法，美國1975年使用率已占94 ，此法具有簡單、方便、快速、亦可達(dá)到一定精密度和準(zhǔn)確度的優(yōu)點(diǎn) 衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心1999年也VonClauss法為常規(guī)測(cè)定方法,原理：凝血酶可將可溶性血漿纖維蛋白原轉(zhuǎn)變成不溶性的多倍體纖維素，在高濃度凝血酶及低濃度纖維蛋白原Fg(00508 gL)的條件下血漿凝固時(shí)間由纖維蛋白原濃度決定，在雙對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，凝血酶凝固時(shí)間與纖維蛋白原濃度呈負(fù)相關(guān)的線性關(guān)系,功

10、能法準(zhǔn)確特異，是wH0推薦的參考方法(Jacobsson法)和NCCLS推薦的常規(guī)方法。但這類方法的缺點(diǎn)是：在2個(gè)方面可引起測(cè)定誤差，一是測(cè)定的是纖維蛋白而非Fg。已知Fg變成纖維蛋白時(shí)，會(huì)切下2個(gè)短肽，這樣，纖維蛋白實(shí)際上比Fg的質(zhì)量少了約10。二是纖維蛋白一旦形成，就會(huì)吸附一些凝血因子或纖溶因子，這樣又會(huì)增加所測(cè)Fg的量。此外，在獲得纖維蛋白和洗滌時(shí)比較麻煩且難以做到完全徹底，還容易造成污染。另外還易受肝素等抗凝藥物影響,(二)物理化學(xué)測(cè)定法 這類方法在我國應(yīng)用最廣，可分為鹽析法、熱沉淀法和電泳法等幾種。,1鹽析法 即通過亞硫酸鈉、硫酸銨、甘氨酸或氯化鈉等鹽析后用蛋白質(zhì)顯色劑顯色或比濁法測(cè)

11、定，常見的方法如雙縮脲法，即使用125 亞硫酸鈉溶液將血漿中Fg沉淀分離，然后以雙縮脲試劑顯色。常用的鹽溶液中，除甘氨酸為特異性沉淀外，其余均為非特異性沉淀，而甘氨酸的特異性也僅限于正常血漿；在異常血漿中，甘氨酸的沉淀特異性會(huì)受到很大干擾。所以，現(xiàn)在普遍認(rèn)為這類方法欠準(zhǔn)確。,2、熱沉淀法 即將血漿加熱到56，沉淀的Fg 用離心或非免疫學(xué)的濁度法測(cè)定。這類方法簡單快速，適于寬范圍的Fg濃度測(cè)定，且纖維蛋白降解產(chǎn)物即使處于高濃度也不會(huì)干擾此法，但特異性仍較差，一些研究指出該法與Clauss法的結(jié)果差異有顯著性。,3電泳法 原理是利用Fg電泳時(shí)特征性的遷移率。但Fg是一種相對(duì)較少的蛋白成分，故密度測(cè)

12、定掃描在一定程度上不準(zhǔn)確，而且這種方法太繁瑣、費(fèi)時(shí)，不適于常規(guī)工作,這類方法都比較簡單、快速，尤其適于急診檢驗(yàn)，但缺點(diǎn)是本法的特異性不強(qiáng)。所測(cè)的不是有凝固功能的纖維蛋白原，可能包括部分的降解產(chǎn)物和/或其它蛋白。而電泳法又太繁瑣，不適于常規(guī)工作。,(三)免疫學(xué)測(cè)定法 這類方法是將純Fg作為抗原免疫動(dòng)物，制成多克隆或單克隆抗體，然后用其致敏膠乳或以被動(dòng)或反向血凝、免疫比濁、單向免疫擴(kuò)散、火箭電泳、放射免疫及ELISA 等免疫學(xué)技術(shù)測(cè)定Fg,免疫學(xué)方法簡便快速(除RIA)，與參考方法及Claus法的結(jié)果比較相關(guān)性好，但除可凝固的Fg外，還可測(cè)定變性Fg(如無功能Fg )和Fg降解產(chǎn)物(如果采用多克隆

13、抗體)。 當(dāng)Fg存在異質(zhì)性(如惡性腫瘤、纖溶綜合征、消耗性凝血病等)時(shí)不會(huì)對(duì)免疫法產(chǎn)生明顯干擾。但由于血漿中存在大量無功能的Fg，用功能法測(cè)定時(shí)結(jié)果明顯偏低，而用免疫法或物理化學(xué)法測(cè)定，結(jié)果多正常?？偟恼f來，免疫學(xué)方法用于臨床常規(guī)實(shí)驗(yàn)室仍存在一定問題。,(四)其他方法或技術(shù),1PT演算法 該法根據(jù)PT測(cè)定完成時(shí)，全部Fg均變成纖維蛋白，其形成的濁度或A 改變值與纖維蛋白的含量呈正比，因此可由產(chǎn)生的濁度推算出Fg含量。該法常見于一些自動(dòng)血凝分析儀上，測(cè)定PT的同時(shí)報(bào)告Fg值。一些文獻(xiàn)報(bào)道，在Fg含量正常時(shí)，該法與ClausS法相關(guān)性好，但當(dāng)Fg減低時(shí)，結(jié)果可能偏高。所以，雖然該法經(jīng)濟(jì)、簡單、快速

14、，但如發(fā)現(xiàn)Fg含量較低或較高，應(yīng)改用Clauss法。也有學(xué)者認(rèn)為PT演算法與Clauss,法在正常及異常范圍均有明顯差異,2粘度測(cè)定法 由于Fg外形呈球狀且較大，故對(duì)血漿粘度影響很大，因此可通過從血漿粘度中扣除血清粘度來測(cè)定。粘度測(cè)定法與Clauss法相關(guān)性較好，其重復(fù)性比Clauss法在低Fg濃度時(shí)略差，在中等濃度時(shí)相當(dāng)，在高濃度時(shí)稍好一些，其所需標(biāo)本量相對(duì)較大。雖然這是一種老方法，但對(duì)擁有毛細(xì)血管粘度計(jì)的實(shí)驗(yàn)室不失為一種廉價(jià)、快速且重復(fù)性好的可選方法,總之，所有血漿Fg測(cè)定方法中，功能法的精密度、準(zhǔn)確度、與參考方法的相關(guān)性最好，其中又以clauss 法為佳。物理化學(xué)法雖然相關(guān)性和精密度尚可

15、，但準(zhǔn)確度較差，免疫法也是如此。現(xiàn)有方法除本身存在不足之處外，還有許多干擾因素，如纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物、抗凝藥物等；另功能法還受Fg異質(zhì)性的影響,在血凝儀上測(cè)定纖維蛋白原方法主要有兩種，一是Von clauss法，另一種是P演算法 2008年室間質(zhì)評(píng)中有70家（38%）的實(shí)驗(yàn)室使用Clauss法，有43家（23.4%）使用PT一衍生法，40%實(shí)驗(yàn)室填報(bào)其它（不清楚檢測(cè)方法）,血漿Fg測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化,l 血漿纖維蛋白原測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)品 在國際參考制品出現(xiàn)前，F(xiàn)g的檢測(cè)方法多種多樣，同一方法的試劑盒其生產(chǎn)商所用的標(biāo)準(zhǔn)品也不盡一致，有研究將這些標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)可凝固Fg差異可達(dá)200。因此，需要建立一個(gè)國際標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)定各地區(qū)的二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品，并實(shí)現(xiàn)逐級(jí)質(zhì)控，從而促使全球血漿Fg含量的檢測(cè)既具有廣泛的可比性，又盡可能準(zhǔn)確可靠。,WHO組織研究并于1992年建立了第1個(gè)血漿Fg國際標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)89644，取值24 mgm1) ，邁出了Fg標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)化的關(guān)鍵一步。該標(biāo)準(zhǔn)品建立后，其使用得到普及，但該標(biāo)準(zhǔn)品在復(fù)溶時(shí)有些混濁，長期存放后尤為明顯。WHO于1999年又建立了第2個(gè)血漿Fg國際標(biāo)準(zhǔn)品(編號(hào)98612，取值22 mg安瓿)以代替前一標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過近幾年的普及，血漿Fg測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)化已經(jīng)成形。,2.纖維蛋白原（Fg）測(cè)定的推薦方法 Jocobsson法為世界衛(wèi)生組