中國極地微生物的研究進展ppt課件

1、中國極地微生物的研究進展,苑孟,1,中國極地微生物學考察研究簡史,從1981年起,中國微生物學家即涉足南極,并于1987年發(fā)表了第一篇論文(Nichuzhiet al.,1987),即The hetertrophic microbes in dry Victoria land and Ross Island Antarctica； 1984年之前,中國學者曾參與南大洋水體的細菌和生物量考察,并發(fā)表過數篇論文； 從1984年起,中國開始獨立組隊進行南極考察,中國海洋微生物學家參加了相關的考察活動； 上世紀末,我們進行了中國首次北極考察,微生物研究涉足北極地區(qū)(50年代吳寶鈴先生曾隨前蘇聯學者赴北

2、極作過考察),并發(fā)表過論文； 中國南北極微生物考察研究的成果為掌握極地微生物的基本狀況,及研究全球變化對該特定生態(tài)環(huán)境系統(tǒng)的影響奠定了初步基礎；本世紀初,中國學者又開始關注世界第三極青藏高原的微生物及其環(huán)境狀況。,2,（一）類別 目前中國所取得的南極微生物主要類別見表2。,中國極地微生物調查研究主要成果,3,4,由該表可見,研究的微生物以細菌為主,次為菌物(即真菌)。 不完全統(tǒng)計表明所研究的細菌大約有38屬(種),絲狀菌物6屬,酵母8屬(種),此外尚有腸系細菌。不同功能類型的微生物包括固氮細菌、硝化細菌、石油烴降解菌、耐重金屬菌、耐LPS菌、耐酸菌及衛(wèi)生狀況指示菌等等。 南極微生物的優(yōu)勢菌群：

3、、-變性細菌群，噬纖維菌-黃桿菌-擬桿菌群（CFB group）。,5,（二）極地生態(tài)環(huán)境與環(huán)境微生物學的研究 這方面的研究主要將微生物置于整個生態(tài)系統(tǒng)中分析,如南極磷蝦集群過程、集群區(qū)及磷蝦本身的微生物學研究，,在潮間帶生態(tài)系統(tǒng)、食物鏈中的作用,菲爾德斯半島及附近區(qū)域生態(tài)系統(tǒng)中微生物的多樣性、生態(tài)結構特征、食物鏈及與生物/非生物因子間關系分析(吳寶鈴等,1998)。,6,（三）極地微生物的開發(fā)利用研究,1、抗凍物質 冷適應微生物最顯著的特征便是具有相對低的代謝速率，在長期的生物進化過程中形成了一系列的適應低溫的機制。這些機制包括營養(yǎng)物質的吸收和轉運、DNA的復制合成、蛋白質的合成、合成代謝和

4、分解代謝的正常進行、能量代謝的正常進行、細胞的分裂等。,7,2、多不飽和脂肪酸(Poly Unsaturated Fatty Acids，PUFA) 具有廣泛而重要的生物功能，這已經被越來越多的人所認識。然而隨著PUFA開發(fā)應用領域的擴大，來自于植物、哺乳動物和海洋魚的PUFA遠遠不能滿足市場需求，微生物特別是藻類、真菌能合成幾乎所有的PUFA并能在工業(yè)規(guī)模上培育而被視為有開發(fā)價值的可替代的生物資源。在南極細菌中具有多聚不飽和脂肪酸 (PUEA)生成能力的細菌所占比例高于其在溫帶海洋細菌中的比例。,8,3、抗紫外輻射物質 在南極上空的臭氧層最薄時厚度僅為平時的50%，并出現了臭氧空洞，從而使U

5、V一B總輻照度的比例增加uv一B對藻類傷害的主要目標是藻細胞中分子中的蛋白質、色素、DNA等，抑制光合作用、生長發(fā)育，甚至導致細胞死亡。為了避免或減少UV輻射，生活在高輻射環(huán)境下的生物體形成了許多物理的或者化學的保護機制。Scytonemin 、MAAs是兩類抗輻射的物質，如果提取這種化合物、了解其吸收紫外線的機理，有望將其作為防止紫外線的保護劑應用到化妝品中。類胡蘿卜素在保護細胞和生物體免受光、氣體和感光色素等損傷中起重要作用。,9,4、低溫酶 低溫酶的低溫催化能力，低熱穩(wěn)定性使其在工業(yè)應用上有以下的優(yōu)勢:通過溫和的熱處理使低溫酶失活，快速而經濟地終止反應;生產過程在低溫或室溫下進行，無需加

6、熱和冷卻，可以降低成本;生產過程便于監(jiān)控。,10,5、抗菌、抗腫瘤活性物質 據統(tǒng)計，人們己經從微生物中發(fā)現了8000多種具有抗菌和抗腫瘤活性的天然產物。然而，從陸生微生物中新發(fā)現的生物活性物質的種類正在減少，并且大部分是己知的化合物。 另一方面，越來越多的傳染性病菌對傳統(tǒng)抗生素逐漸產生了抗藥性，威脅人類健康的三大疾病之一的癌癥也難以找到有效的治療藥物，從而迫使生物學家尋找新的天然生物活性物質來解決目前面臨的問題。因此，極地微生物由于具有獨特的生理機制而成為最有希望為人類提供產生具有生物活性的新化合物的微生物資源寶庫之一,11,傳統(tǒng)的環(huán)境微生物生態(tài)學研究方法采用計數、微生物培養(yǎng)及鑒定，生理生化分

7、析等手段進行，這些方法在很大程度上依賴于微生物的培養(yǎng)和純種分離技術。 純培養(yǎng)很難，尤其是在南北極這樣的極端環(huán)境中?，F有研究認為在自然界中僅有0.001%一1%的微生物能夠用現有的技術手段進行人工培養(yǎng)。而且經過平板培養(yǎng)微生物有機體還有可能會偏離原來自然種群的生理習性，甚至有可能偏離它們原來的基因型組合。 隨著各種分子生物學技術的應用，使我們不必培養(yǎng)微生物，而直接通過對環(huán)境中的遺傳物質的研究來達到目的，也為從分子水平上開展較為全面的、無偏差的微生物生態(tài)學研究開辟了新的途徑。,極端環(huán)境微生物分子研究方法及進展,12,（一）從自然樣品中直接提取核酸： 從環(huán)境樣品中提取核酸的方法可分為兩類，一是轉移后裂

8、解法，即先將微生物菌體與土壤顆粒分開，再提取DNA。另一類是直接裂解法，即在土壤中直接裂解微生物菌體后提取DNA。相比之下，直接裂解法可以提取出沉積物樣品中近乎所有的微生物種群，且DNA產量大。在高效裂解細胞的同時對己釋放出的DNA不予破壞是提高DNA產出率的決定因素。目前己報道的裂解法有碾磨法、超聲波裂解法、液氮凍融法、變性劑熱裂解法、酶解法等。,需要提取DNA的方法,13,（二）分子生物學分析,1.DNA熔解(解鏈)及復性分析 該方法可應用于微生物群落結構的分析。通過測定整個群落的堿基組成和DNA的復雜性可估計出總的群落遺傳結構及其復雜性。 分析DNA的熔解曲線可以得到堿基組成的于G+C%

9、。在限定條件下，測定溶液中剪切的或熱失活DNA的復性動力學可以測定DNA序列的復雜性。 2.質粒指紋圖譜分析: 質粒的大小和數目隨物種的不同有所差異。質粒數是相對穩(wěn)定的,它可用來區(qū)分同一物種的不同菌株。 3.低分子量RNA分布圖 這種方法為tRNA(75-90%個核苷酸)和 5SrRNA(105-120個核苷酸)的雙相電泳分離。,14,4.結合PCR的一些技術： 克隆文庫分析法 限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP) 末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T-RFLP) 變性梯度凝膠電泳(DGGE)或者溫度梯度凝膠電泳(TGGE) 單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP) 隨機引物擴增多態(tài)性分析(RAPD) 將兩

10、種以上的上述的分子生物學方法結合運用。,15,克隆文庫分析法 主要步驟包括： (1)樣品中總DNA的提??； (2)建立16S rRNA基因克隆文庫； (3)以限制性內切酶進行酶切篩選文庫； (4)測序； (5)序列的比較分析。,16,變性梯度凝膠電泳(DGGE)或者溫度梯度凝膠電泳(TGGE) 在含有連續(xù)變性劑梯度或者連續(xù)溫度梯度的凝膠中，加入雙鏈的 PCR 產物，根據 PCR 擴增產物中不同 G+C 含量的 DNA 組分在凝膠中的移動速度的不同，直接反映 DNA 的多態(tài)性 。低 G+C 含量的組分在凝膠中變性較快，在凝膠中的移動速度較慢，高 G+C 含量的 DNA 在凝膠中變性較慢，在凝膠中

11、的移動速度快，從而使不同 DNA 在凝膠中的位置不同，產生不同的帶。該項技術已經廣泛應用于微生物生態(tài)學研究中，包括微生物群落多樣性研究、環(huán)境變化對微生物群落影響的研究比較不同微環(huán)境微生物群落差異等。,17,南極中山站沉積物中微生物多樣性分析及宏基因組文庫研究 1.南極沉積物中微生物群落結構調查： DNA的提取純化、PCR擴增、DGGE、序列測定和系統(tǒng)計劃關系分析。 2.南極中山站排污入?？诔练e物中微生物宏基因組文庫的構建和研究： 沉積物中總DNA的提取、大片段目的DNA的篩選和回收、插入DNA片段末端補平、連接、體外包裝。cosmid宏基因組文庫的保存和陽性克隆的篩選、宏基因組文庫評估、宏基因

12、組文庫中抗菌活性物質篩選、宏基因組文庫中抗腫瘤活性物質的篩選、宏基因組文庫中酶活篩選。,18,北極深海沉積物中細菌多樣性研究 對溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法等5種方法提取北極深海沉積物宏基因組DNA進行了比較; 并對沉積物宏基因組中16SrDNA基因PCR擴增相關的引物序列、引物濃度、退火溫度和模板稀釋度等條件，以及PCR產物的變性梯度凝膠電泳 (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE)的聚丙烯酞胺凝膠濃度、變性劑濃度梯度進行了優(yōu)化。,19,1.溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP

13、法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法1mL TENP緩沖液(50mMTris，pH8.0，20mMEDTA， 100mMNaCl，0.01g/mLPVP)等5種方法提取北極深海沉積物宏基因組DNA。 2.沉積物宏基因組DNA純化（腐殖酸是土壤DNA提取過程中極難去除的污染物，在PCR擴增時，極少量的腐殖酸，就會抑制DNA聚合酶的活性，干擾擴增結果） 電泳切膠回收 PEG8000純化 在上述粗提沉積物DNA溶液中加入20L的4M的NaCl溶液與80L13%PEG8000溶液(w/v)，冰浴放置 30min;10000r/min離心15mim收集沉淀;用70%的酒精洗沉淀后11000r/m

14、in離心l0min;用滅菌的濾紙條干燥沉淀;加入40L的TE buffer。,20,3. 16SrDNA基因PCR擴增 4. 16SrDNA基因PCR產物DGGE檢測？ 5.優(yōu)勢條帶的回收及PCR擴增 6. 回收條帶的克隆 7.感受態(tài)細胞的制備 8. PCR產物的連接轉化 9.質粒DNA提取 10. 陽性克隆的鑒定 11. 16SrDNAV3-V5區(qū)的PCR擴增及DGGE再鑒定確定位置？ 12.測序，序列分析，建樹,21,DGGE變性劑濃度的選擇，電泳時間的選擇，染色方法的選擇 電泳時間的選擇： 采用了時間間歇(timetravel)的方法，每隔一小時加一次樣，最終根據圖譜清晰分離度來確定出最

15、合適的時間。 染色方法的選擇： EB染色后所顯現的條帶要少一些（只能染雙鏈DNA，不能染單鏈DNA），所以這種方法的靈敏度要低一些。相較而言，銀染法的靈敏度就高了（因為它單雙鏈DNA都能染色）。但是它無法順利的從條帶中回收出DNA。 因次在構建和觀察指紋圖譜時采用銀染法。在要做回收克隆測序的工作時，則采用EB染色。,22,限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism)RFLP技術的基本原理是根據不同生物個體或種群之間DNA片段酶切位點有所差異的特點，利用限制性內切酶進行消化，產生長短、種類、數目不同的限制性片段，然后對這

16、些特定DNA片段的限制性內切酶產物進行分析。凡是可以引起酶切位點變異的突變包括點突變(新產生和去除酶切位點)、基因插人或缺失(插入和缺失造成酶切位點間的長度發(fā)生變化)等均可導致多態(tài)性的產生。將PCR技術與RFLP分析相結合，用于研究環(huán)境中微生物多樣性及群落分布，具體方法是采用特定的引物，如16S rRNA基因通用引物對環(huán)境樣品的總基因組DNA進行PCR擴增，將擴增產物用不同的限制性內切酶酶切，通過電泳分析比較酶切帶型，對特殊帶型的序列進行測定，進而了解該樣品中所包含的微生物序列信息。該方法廣泛用于環(huán)境微生物多樣性及其群落結構的研究。,23,末端限制性片段長度多態(tài)性分析(T-RFLP, Term

17、inal Restriction Fragment Length Polymorphism) T-RFLP 技術與 RFLP 技術基本原理類似，不同的只是在 其 中 一 條 PCR 引 物 的 末 端 加 上 熒 光 標 記 ， 如 TET(4,7,2,7-tetrachloro-6-carboxyfluorescein)，6-FAM (phosphoramidite fluorochrome5-carboxyfluorescein )等。在對目標基因如 16S rRNA 基因進行 PCR 擴增后同樣采用不同的限制性內切酶進行酶切，產生不同長度的片段，電泳結果在測序儀上用基因掃描程序進行掃描，

18、只有那些末端帶有熒光標記的片段能夠被檢測到。簡化了圖譜，就可以用來分析復雜的微生物群落，以及能提供一些多樣性的信息，因為每一個可見的條帶都代表一個單個的 OTU 或核糖體類型。通過這個圖譜，可以計算種的豐度，均度，以及樣品之間的相似性。這一技術能自動的分析大量的土壤樣品，包括點樣和分析。目前 T-RFLP 技術在微生物多樣性及群落結構研究方面應用非常廣泛。,24,東_西太平洋深海沉積物細菌多樣性研究 采用土壤DNA快速提取試劑盒對樣品的DNA進行了提取 瓊脂糖凝膠電泳檢測 16SrRNA 基因序列的PCR擴增（用FAM標記的引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和無標記

19、的引物926R（5-CCGTCAATTCATTTGAGT-3）作為PCR擴增的引物對） PCR產物純化與上樣純化（產物分別用Hha I和Msp I 兩種限制性內切酶進行酶切，并于37過夜。酶切產物分別用乙醇沉淀濃縮（乙醇終濃度為70%）。濃縮后的酶切產物用3100基因分析儀（ABI, USA）進行T-RFLP分析。Liz-500作為T-RFLP分析的分子內標） 末端限制性片段（T-RFs）統(tǒng)計與聚類分析（每一個峰即代表一個末端限制性片段，并且統(tǒng)計數值采用二元統(tǒng)計（有峰計為1；無峰計為0），按照統(tǒng)計數值進行聚類分析，以分析研究不同層位的細菌群落結構。）,25,16S rRNA 基因文庫構建及序列

20、分析 感受態(tài)細胞的制備 細菌16S rRNA 基因片斷的擴增 PCR產物的純化與連接 重組載體的轉化 擴增的16S rRNA 基因基因的限制性酶切分析 用水煮法快速提取細胞中的基因組DNA，用特定的引物進行PCR檢測篩選的克隆是否是陽性克隆以及插入的片段大小是否正確，片斷大小合適的PCR產物分別用Msp I和Hha I兩種限制性內切酶進行酶切，酶切產物用4%的瓊脂糖凝膠進行電泳分析。根據酶切帶型判斷分類學單元（OTUs）的多少。,26,多樣性覆蓋率分析與稀釋曲線分析 構建的16S rRNA基因文庫的多樣性覆蓋百分率用公式：1 (m/N) 100計算，其中m是指每個16S rRNA基因文庫中OT

21、Us的數目，N是指每個文庫總的克隆數。百分率越高表明文庫多樣性覆蓋率越高。 16S rRNA基因測序及系統(tǒng)進化分析 通過兩對引物確定目的基因的插入方向，從而確定測序引物,27,當然僅僅依靠16SrDNA序列評估微生物多樣性并不完全可靠的，例如16SrDNA序列同源98%，也可能是兩個完全不同的菌屬同時同種物種(古菌)也有可能相似性差異度達到5%。 熒光原位雜交（FISH）：是一種不依賴于PCR的分子生物學分析技術，可以較為準確快速和動態(tài)的觀察微生物的種群變化，并同時提供形態(tài)數量和空間分布方面信息，同時可以克服核酸提取和PCR擴增過程中存在的偏差。 1.熒光顯微鏡 2.流式細胞術（Flow Cy

22、tometry, FCM） 選擇不同的單克隆抗體及熒光染料，可以利用流式細胞儀同時測定一個細胞上的多個不同的特征，它可以高速分析上萬個細胞，并能同時從一個細胞中測得多個參數，與傳統(tǒng)的熒光鏡檢查相比，具有速度快、精度高、準確性好等優(yōu)點，成為當代最先進的細胞定量分析技術。,28,潛在的問題： 1.核酸回收過程中的偏差，并非所有類群的細胞都能同等有效的裂解，另外，與核酸一起被提取出來的腐殖質會干擾隨后的酶處理步驟。 2.PCR及克隆過程中產生的偏差，由于PCR對某些模板的擴增具有有限性，從而導致對rRNA基因自然豐度的估計會產生潛在的偏差?？赡軙媾R不同物種的基因序列互相集結形成聚合物的危險，PCR技術還面臨著污染的問題。由于不同的細菌其染色體上的r RNA基因的操縱元的拷貝數并不一樣，從而根據特定的r DNA克隆的相對豐度來估算其相應種群相對豐度肯定也會產生偏差。,29,3.探針雜交反應：本以為是專一性的探針可能會與那些未曾被發(fā)現的序列發(fā)生交叉