血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素測定.ppt

1、1,血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素測定,燕 德 起,Biobase,2,血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素測定,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素 膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,Biobase,3,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【原理】 血清中結(jié)合膽紅素可直接與重氮試劑反應(yīng)，產(chǎn)生偶氮膽紅素；非結(jié)合膽紅素須有加速劑咖啡因-苯甲酸鈉-醋酸鈉作用，其分子內(nèi)氫鍵破壞后才能與重氮試劑反應(yīng)，也產(chǎn)生偶氮膽紅素。本法重氮反應(yīng)pH6.5，最后加入堿性酒石酸鈉使紫色偶氮膽紅素(吸收峰530nm)轉(zhuǎn)變成藍色偶氮膽紅素，在600nm波長比色，使檢測靈敏度提高。,Biobase,4,改良J-G法測定血清總膽

2、紅素和結(jié)合膽紅素 【試劑】,1咖啡因-苯甲酸鈉試劑 稱取無水醋酸鈉41.0g，苯甲酸鈉38.0g，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)0.5g，溶于約500ml去離子水中，再加入咖啡因25.0g，攪拌使溶解(加入咖啡因后不能加熱溶解)，用去離子水補足至1L,混勻。濾紙過濾，置棕色瓶，室溫保存。 2堿性酒石酸鈉溶液 稱取氫氧化鈉75.0g，酒石酸鈉(Na2C4H4O6?2H2O)263.0g，用去離子水溶解并補足至1L，混勻。置塑料瓶中，室溫保存。 372.5mmol/L亞硝酸鈉溶液 稱取亞硝酸鈉5.0g，用去離子水溶解并定容至100ml，混勻，置棕色瓶，冰箱保存，穩(wěn)定期不少于3個月。作10倍稀

3、釋成72.5mmol/L，冰箱保存，穩(wěn)定期不少于2周。 428.9mmol/L對氨基苯磺酸溶液 稱取對氨基苯磺酸(NH2C6H4SO3H?H2O)5.0g，溶于800ml去離子水中，加入濃鹽酸15ml，用去離子水補足至1L。 5重氮試劑 臨用前取上述亞硝酸鈉溶液0.5ml和對氨基苯磺酸溶液20ml，混勻即成。 65.0g/L疊氮鈉溶液。,Biobase,5,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素 【試劑】,7膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液 (1) 目前一般用游非結(jié)合膽紅素配制標(biāo)準(zhǔn)液，此標(biāo)準(zhǔn)品須用含白蛋白的溶劑配制，常用人混合血清，對此血清的要求如下： 收集無溶血、無黃疽、無脂濁的新鮮血清，混合，必要時可用濾菌

4、器過濾。取過濾后的血清1ml，加入新鮮0.154mmol/L NaCl溶液24ml，混合。在414nm波長，1cm光徑，以0.154mmol/L NaCl溶液調(diào)零點，其吸光度應(yīng)小于0.100；在460nm的吸光度應(yīng)小于0.04。 (2) 配制標(biāo)準(zhǔn)液的膽紅素須符合下列標(biāo)準(zhǔn)：純膽紅素的氯仿溶液，在25條件下，光徑1.0000.001cm，波長453nm，摩爾吸光系數(shù)應(yīng)在60 7001 600范圍內(nèi)；改良J-G法偶氮膽紅素的摩爾吸光系數(shù)應(yīng)在74 380866。 (3) 膽紅素標(biāo)準(zhǔn)貯存液(171mol/L) 準(zhǔn)確稱取符合要求的膽紅素10mg，加入二甲亞砜1ml，用玻璃棒攪拌，使成混懸液。加入0.05m

5、ol/L碳酸鈉溶液2ml，使膽紅素完全溶解后，移入100ml容量瓶中，以稀釋用血清洗滌數(shù)次并入容量瓶中，緩慢加入0.1mol/L鹽酸2ml，邊加邊搖(勿用力搖動，以免產(chǎn)生氣泡)。最后以稀釋用血清定容。配制過程中應(yīng)盡量避光，貯存容器用黑紙包裹，置4冰箱3d內(nèi)有效，但要求配后盡快作標(biāo)準(zhǔn)曲線。,Biobase,6,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【操作步驟】,混勻后，波長600nm，對照管調(diào)零，讀取吸光度，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的膽紅素濃度。,Biobase,7,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素,標(biāo)準(zhǔn)曲線制作,混勻(不可產(chǎn)生氣泡)，按總膽紅素測定法操作。每一濃度作3個平行管，并分別做

6、標(biāo)準(zhǔn)對照管，用各自的標(biāo)準(zhǔn)對照管調(diào)零，讀取標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度。配制標(biāo)準(zhǔn)液用的溶劑血清中尚有少量膽紅素，同樣測定后得一吸光度值。每個標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度值均應(yīng)減去此吸光度，然后與相應(yīng)膽紅素濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,Biobase,8,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【參考范圍】 血清總膽紅素：5.119mol/L(0.31.1mg/dl)； 血清結(jié)合膽紅素：1.76.8mol/L(0.10.4mg/dl)。 【臨床意義】 1血清總膽紅素測定的意義 (1) 有無黃疸及黃疸程度的鑒別。 (2) 肝細胞損害程度和預(yù)后的判斷 膽紅素濃度明顯升高反映有嚴(yán)重的肝細胞損害。但某些疾病如膽汁淤積型肝炎時，盡管肝細胞受累較

7、輕，血清膽紅素卻可升高。 (3) 新生兒溶血癥 血清膽紅素有助于了解疾病嚴(yán)重程度。 (4) 再生障礙性貧血及數(shù)種繼發(fā)性貧血(主要見于癌或慢性腎炎引起)，血清總膽紅素減少。,Biobase,9,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【臨床意義】 2血清結(jié)合膽紅素測定的意義 結(jié)合膽紅素與總膽紅素的比值可用于鑒別黃疸類型。 (1) 比值20% 溶血性黃疸，陣發(fā)性血紅蛋白尿，惡性貧血，紅細胞增多癥等。 (2) 比值40%60% 肝細胞性黃疸。 (3) 比值60% 阻塞性黃疸。 但以上幾類黃疸，尤其是(2)、(3)類之間有重疊。,Biobase,10,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【注意

8、事項】 1膽紅素對光敏感，標(biāo)準(zhǔn)液及標(biāo)本均應(yīng)盡量避光保存。 2輕度溶血對本法無影響，但嚴(yán)重溶血時可使測定結(jié)果偏低。其原因是血紅蛋白與重氮試劑反應(yīng)形成的產(chǎn)物可破壞偶氮膽紅素，還可被亞硝酸氧化為高鐵血紅蛋白而干擾吸光度測定。血脂及脂溶色素對測定有干擾，應(yīng)盡量取空腹血。 3疊氮鈉能破壞重氮試劑，終止偶氮反應(yīng)。凡用疊氮鈉作防腐劑的質(zhì)控血清，可引起偶氮反應(yīng)不完全，甚至不呈色。 4本法測定血清總膽紅素，在1037條件下不受溫度變化的影響。呈色在2h內(nèi)非常穩(wěn)定。,Biobase,11,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【注意事項】 5標(biāo)本對照管的吸光度一般很接近，若遇標(biāo)本量很少時可不作標(biāo)本對照管，參照

9、其他標(biāo)本對照管的吸光度。 6膽紅素大于342mol/L的標(biāo)本可減少標(biāo)本用量，或用0.154mmol/L NaCl溶液稀釋血清后重測。 7結(jié)合膽紅素測定在臨床上應(yīng)用很廣，但至今無候選參考方法，國內(nèi)也無推薦方法。方法不同，反應(yīng)時間不同，結(jié)果相差很大。時間短、非結(jié)合膽紅素參與反應(yīng)少，結(jié)合膽紅素反應(yīng)也不完全；時間長，結(jié)合膽紅素反應(yīng)較完全，但一部分非結(jié)合膽紅素也參與反應(yīng)。這是一個很難權(quán)衡的問題。在沒有結(jié)合膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液的情況下，問題更復(fù)雜。,Biobase,12,改良J-G法測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素H,【評價】 1靈敏度和線性范圍 本法摩爾吸光系數(shù)為74 380，標(biāo)本中膽紅素17.1mol/L時吸光度

10、約0.08(血清用量已達0.2m1)，正常血清總膽紅素多數(shù)小于17.1mol/L，手工法測定顯得靈敏度很不夠。在病理血清結(jié)合膽紅素增高在17.1mol/L以下時，靈敏度同樣不夠。線性上限雖可做到1.7吸光度，但手工法在膽紅素超過171mol/L時，吸光度已達0.8，應(yīng)減量操作。分析儀檢測靈敏度高得多，最低吸光度可測至0.02，線性上限可達342mol/L；但本法需3次加試劑，一般無法在全自動生化分析儀中使用。 2精密度 正常濃度時精密度較差，特別是批間CV，據(jù)報道為14%20%；而膽紅素342mol/L時，精密度佳，批內(nèi)CV為0.95%，批間CV5%10%。,Biobase,13,改良J-G法

11、測定血清總膽紅素和結(jié)合膽紅素H,【評價】 3重氮反應(yīng)法測定膽紅素，也可用甲醇(M-E法)或二甲亞砜等作加速劑，可做成單一試劑，反應(yīng)pH和顯色pH都在酸性，560nm波長比色，易于自動化。但靈敏度比改良J-G法略低，M-E法摩爾吸光系數(shù)為60 500，Hb干擾較明顯，Hb1g/L時，需用樣品空白校正。 4本法靈敏度高，且可避免其它有色物質(zhì)的干擾，是測定血清總膽紅素的參考方法，但不能自動化分析是其缺點?，F(xiàn)有些商品試劑盒稱咖啡因法或J-G法，但不加堿性酒石酸，即不在堿性條件下顯色，其靈敏度和特異性不如上述方法。,Biobase,14,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【原理】 膽紅素呈黃色，在

12、450nm附近有最大吸收峰。膽紅素氧化酶(BOD)催化膽紅素氧化，隨著膽紅素被氧化，A450nm下降，下降程度與膽紅素被氧化的量相關(guān)。在pH8.0條件下，未結(jié)合膽紅素及結(jié)合膽紅素均被氧化，因而檢測450nm吸光度的下降值可反映總膽紅素含量；加入SDS及膽酸鈉等陰離子表面活性劑可促進其氧化。 在pH3.74.5緩沖液中，BOD催化單葡萄糖醛酸膽紅素(mBc)、雙葡萄糖醛酸膽紅素(dBc)及大部分膽紅素氧化，非結(jié)合膽紅素(Bu)在此pH條件下不被氧化。用配制于人血清中的二?；撬崮懠t素(ditaurobilirubin，DTB)作標(biāo)準(zhǔn)品，檢測此條件下450nm吸光度的下降值可反映結(jié)合膽紅素的含量。,

13、Biobase,15,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【試劑】 10.1mol/LTris-HCl緩沖液(pH8.2) 稱取三羥甲基氨基甲烷(Tris)1.211g，膽酸鈉172.3mg,十二烷基硫酸鈉(SDS)432.6mg，溶于去離子水90ml中，在室溫(2530)用1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.2(約用6ml)，再加蒸餾水至100ml，置冰箱保存，此液含4mmol/L膽酸鈉、15mmol/L SDS。 20.2mol/L磷酸鹽緩沖液(pH4.5)。 3BOD溶液 如系凍干品，按說明書要求復(fù)溶，但復(fù)溶后冰箱保存不宜過長(約可保存1周)，如系液體(可能含有甘油)，置4冰箱可保存較長時

14、間，BOD貯存溶液的酶活性一般在數(shù)千至1萬2萬U/L，BOD工作液酶活性可按反應(yīng)液中BOD終濃度達0.31.0U/ml計算。 4總膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液(342mol/L) 按膽紅素測定J-G法中方法配制，或市售合乎要求的標(biāo)準(zhǔn)液。 5結(jié)合膽紅素標(biāo)準(zhǔn)液 將DTB配于膽紅素濃度可忽略不計的人血清中，或用凍干品按說明書要求重建。配制后分裝于聚丙烯管內(nèi)，70保存，可穩(wěn)定6個月。凍干品未重建前置低溫中，至少穩(wěn)定1年。,Biobase,16,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【操作步驟】 總膽紅素和結(jié)合膽紅素測定分別按表,Biobase,17,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,加入BOD工作液后立即混勻

15、，置37C水浴5min，用分光光度計，在450nm波長，去離子水調(diào)零，讀取各管吸光度(A)。用于對照管的比色杯與非對照管的比色杯不得混用。,Biobase,18,【計算】 血清總膽紅素(mol/L) C總膽紅素 血清結(jié)合膽紅素(mol/L) CDTB 【參考范圍】 與重氮法相似， 總膽紅素為10.264.10mol/L(n=97)， 結(jié)合膽紅素為2.572.56mol/L(n=95)。,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,Biobase,19,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【注意事項】 1BOD濃度的選擇 文獻報道BOD在反應(yīng)液中終濃度為0.181.14U/ml。國內(nèi)有些廠家的試

16、劑盒，BOD在反應(yīng)液中終濃度按標(biāo)示值計算很高，但反應(yīng)速度很慢。 2.選擇BOD濃度時，可根據(jù)所用制品在測定高膽紅素血清標(biāo)本或342mol/L標(biāo)準(zhǔn)液的反應(yīng)速度，即能否在5min反應(yīng)完全而確定。由于測定結(jié)合膽紅素時反應(yīng)液pH偏離BOD的最適范圍，因此要求BOD有較高的濃度，一般使反應(yīng)液中終濃度不低于0.5U/ml。,Biobase,20,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【注意事項】 3Hb在1.0g/L以下時，對結(jié)果影響不大。每升血清中分別加入維生素C 0.1g、半胱氨酸0.5g、谷胱苷肽0.5g、尿素0.5g、尿酸0.5g、葡萄糖10g、乙碘醋酸1g、白蛋白40g對總膽紅素及結(jié)合膽紅素測

17、定幾乎無干擾。每升血清中加L-多巴0.15g、-甲基多巴0.15g使結(jié)果偏低約10%。 4BOD的最適pH 在pH7.39.0之間酶活性的pH曲線變化幅度不大，但最適pH為8.08.2。但在測定結(jié)合膽紅素時，為防止Bu反應(yīng)，選擇pH為4.5，這時樣本中mBc、dBc及大部分膽紅素被氧化；pH低于4.0時，血清樣本易發(fā)生混濁，嚴(yán)重干擾測定結(jié)果；郭健等報道，用枸櫞酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽和碳酸鹽緩沖液比較時，枸櫞酸鹽緩沖液 (0.1mol/L，pH5.0)效果最好。,Biobase,21,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,5結(jié)合膽紅素標(biāo)準(zhǔn)品 合成的二?；撬崮懠t素(DTB)為水溶性化合物，可與重氮

18、化氨基苯磺酸直接反應(yīng)，產(chǎn)生吸收光譜與偶氮膽紅素相似的偶氮色素。用J-G法測得的摩爾吸光系數(shù)與Bu相同。20世紀(jì)80年代后期以來，國外結(jié)合膽紅素測定大多用DTB作標(biāo)準(zhǔn)品。DTB反應(yīng)前后的吸收光譜與Bu相似，最大吸收峰也在450460nm之間。 6混濁問題Doumas報道，成人黃疸血清或肝素抗凝血漿，反應(yīng)15min幾乎均產(chǎn)生混濁而影響結(jié)果。在磷酸鹽緩沖液中加入尿素可防止混濁。經(jīng)電泳證明混濁是因球蛋白及纖維蛋白原沉淀引起。應(yīng)避免使用肝素抗凝。 7光對BOD法測定結(jié)合膽紅素有較大影響。經(jīng)過藍光治療的新生兒黃疽血清，用BOD法測定結(jié)合膽紅素結(jié)果遠比J-G法高，屬假性增高。新生兒血清在體外經(jīng)藍光照射后，用高效液相色譜法(HPLC)未檢出結(jié)合膽紅素，重氮法結(jié)果通常保持不變，但BOD法結(jié)果顯著增高。藍光照射能產(chǎn)生光膽紅素，其在 pH3.7易被BOD氧化。此種假性增高對臨床監(jiān)控新生兒黃疽及鑒別生理性黃疽與初期的病理性黃疽有影響。,Biobase,22,膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結(jié)合膽紅素,【評價】 1BOD法特異性高，手工操作簡便快速，也適合于自動生化分析儀操作。結(jié)合膽紅素的BOD法測定，解決了長期以來用重氮反應(yīng)法