第十二章 基因診斷.ppt

1、第十二章 基因診斷Gene Diagnosis,基因診斷的概念 用分子生物學(xué)的理論和技術(shù)，通過直接探查在基因存在狀態(tài)，從基因結(jié)構(gòu)、定位、復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯水平分析基因功能，從而對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法。,檢測(cè)目標(biāo)分子是DNA或RNA，反映基因的結(jié)構(gòu)和功能，檢測(cè)基因有內(nèi)源性基因和外源性基因。,第一節(jié) 基因診斷的技術(shù)和方法,基因診斷的特點(diǎn),高特異性； 高靈敏度； 早期診斷性； 應(yīng)用的廣泛性；, 核酸分子雜交,制備樣品,制備探針,雜交,檢測(cè),獲得滿意的高特異性雜交的關(guān)鍵是控制好雜交條件和雜交后沖洗條件,二、 基因診斷常用的分子生物學(xué)技術(shù),（二）PCR PCR是在試管內(nèi)利用DNA聚合酶催化的反應(yīng)反

2、復(fù)進(jìn)行同一段DNA片段合成的過程。 PCR在基因診斷中的作用 從極少樣品即可擴(kuò)增出肉眼可見的產(chǎn)物。 放大待診信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度, SSCP,DNA酶切Southern雜交分析 DNAPCR 酶切電泳分析, 限制酶酶譜分析, SNP,變性高效液相色譜(DHPLC)是一種高效、準(zhǔn)確、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)SNP的技術(shù)，因其檢測(cè)SNP的高靈敏度、低成本以及全自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。 PCR擴(kuò)增包含SNP位點(diǎn)的片段，變性后緩慢復(fù)性。樣品為雜合子時(shí)，出現(xiàn)4各組分：兩個(gè)同源雙鏈和兩個(gè)異源雜合雙鏈。,病例SOX9基因HMG box內(nèi)發(fā)生單堿基置換突變R178L(GT)，如圖2所示，左側(cè)正常對(duì)照第225位堿基為C，

3、而該患兒為A（反義鏈中）,例：序列分析用于基因診斷研究,（六）DNA序列測(cè)定：直接、準(zhǔn)確,生物芯片（biochip)技術(shù)： 根據(jù)生物分子間特異性相互作用，將生化分析過程集成于芯片表面，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA、RNA、多肽、蛋白質(zhì)等各種生物成分的高通量快速檢測(cè)分析。 三類：診斷芯片；表達(dá)譜芯片；檢測(cè)芯片,（七）生物芯片（biochip),二、基因診斷技術(shù)路線和方法的選擇,基因診斷技術(shù)途徑： 直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常的直接診斷途徑； 利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析的間接診斷途徑。,（一）直接診斷途徑,直接診斷途徑的必要條件 被檢基因的突變類型與疾病發(fā)病有直接的因果關(guān)系： 被檢基因

4、的正常分子結(jié)構(gòu)已被確定； 被檢基因突變位點(diǎn)固定而且已知。,珠蛋白生成障礙性貧血- 珠蛋白基因突變：,PCR-RE分析 MaeI CAAG-CTAG,1.點(diǎn)突變： （1）導(dǎo)致特異性限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)改變,1.點(diǎn)突變： （2）無(wú)限制性酶切位點(diǎn)改變,PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交及等位基因特異PCR（allele specific PCR，AS-PCR）或稱為等位基因特異性擴(kuò)增（ASA）等技術(shù)。PCR-ASO斑點(diǎn)雜交或反向斑點(diǎn)雜交技術(shù)可快速、簡(jiǎn)易地檢測(cè)已知突變。,PCR/ASO 一對(duì)探針(正常探針和突變探針各一) 突變堿基置探針中央 控制雜交條件,反向點(diǎn)雜交,多重PCR 引物1,2確定有無(wú)缺失及

5、缺失片段大小 引物3, 4確定缺失部位,2.大片段丟失或插入的診斷,（1）Southern 印跡雜交、斑點(diǎn)雜交、原位雜交，通過設(shè)計(jì)一系列相應(yīng)于缺失區(qū)域的核苷酸探針，正常者出現(xiàn)雜交信號(hào)，而患者則因缺失這一區(qū)域，而檢測(cè)不到雜交信號(hào),3.基因重排：核酸分子探針雜交與PCR,PCR:設(shè)計(jì)3條引物進(jìn)行2個(gè)PCR反應(yīng). 1、正常位點(diǎn)序列，2、重排位點(diǎn)序列，3、基因內(nèi)序列；,mRNA的相對(duì)定量分析：RT-PCR mRNA的絕對(duì)定量分析：實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR mRNA長(zhǎng)度分析： RT-PCR產(chǎn)物電泳條帶的長(zhǎng)度和大小分析,4.基因表達(dá)異常,（二）間接診斷途徑,間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)志 DNA多

6、態(tài)性：指群體中的DNA分子存在至少兩種不同的類型，即個(gè)體間同一染色體的相同位置上DNA核苷酸序列存在一定的差異或變異。,多態(tài)性在人群中出現(xiàn)的頻率應(yīng)大于1%（如小于1% 常認(rèn)為是異常突變）。 在生物進(jìn)化過程中形成的，它本身并不致病或于遺傳病有直接聯(lián)系，故稱為“中性突變”。 人類的23對(duì)染色體中，每一條上都帶有許多遺傳多態(tài)性位點(diǎn)，其中一些位點(diǎn)在染色體上的位置與致病基因靠的很近，甚至連鎖在一起遺傳，并且呈孟德爾式遺傳。因此，可利用這一多態(tài)性位點(diǎn)作為遺傳指示標(biāo)記。,DNA指紋分析用于個(gè)體鑒定,1、RFLP,鐮刀型細(xì)胞貧血癥HBS,2、單個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的連鎖分析,一、遺傳性疾病基因診斷的策略 直接診斷 點(diǎn)

7、突變 間接診斷 多態(tài)性連鎖分析,第二節(jié) 遺傳病的基因診斷,鐮刀型紅細(xì)胞貧血癥： 第六位密碼由GAG突變成GTG,感染性疾病基因診斷的策略： 針對(duì)病原體特異的核酸序列設(shè)計(jì)探針進(jìn)行雜交 應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增病原體基因保守序列 核酸雜交技術(shù)與PCR技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用,第三節(jié) 感染性疾病的基因診斷,第五節(jié) 腫瘤的基因診斷,一、腫瘤基因診斷的策略 檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因 癌基因、抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移基因 檢測(cè)腫瘤相關(guān)病毒的基因 鼻咽癌EB，宮頸癌HPV 檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物基因或mRNA 肝癌甲胎蛋白（AFP） 結(jié)腸癌癌胚抗原（CEA）,二、腫瘤相關(guān)基因的檢測(cè),ras癌基因的檢測(cè) ras基因中最常見的點(diǎn)突變是第12，13或61密碼子突變 檢測(cè)方法： PCR-SSCP PCR PCR/ASO, p53的檢測(cè) p53基因突變主要為點(diǎn)突變，熱點(diǎn)區(qū)域位于密碼子130290 檢測(cè)方法： PCRSSCP PCR測(cè)序 PCRRFLP,第五節(jié) 基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用,人類個(gè)體多樣性和個(gè)性取決于基因組DNA核苷酸序列的差異，其中微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA等是重要的多態(tài)性標(biāo)志。不同個(gè)體間重復(fù)單位數(shù)目不同。致使 RFLP和PCR分析得到的序列長(zhǎng)度不同。,針對(duì)重復(fù)序列人工合成寡核苷酸短片段作為探針，與經(jīng)過酶切的人基因組DNA進(jìn)行Southren印跡雜交，可以得到大小不等的雜交帶，而且雜交帶的數(shù)目和