發(fā)酵分析第3次課1

1、生物工程分析與檢測第3次課,尹禮國 Email: Blog: Tel授課地點：3601 授課時間：2006年9月20 辦公地點：實驗大樓三樓B319,本次課堂教學目的,回憶上次課堂教學的重要內容 理解水的硬度、粗脂肪、粗纖維、廢糖蜜中膠體和灰分測定的原理 掌握以上分析的具本操作方法。,概述：,水的硬度主要由水中所含鈣鹽和鎂鹽所形成，常用鈣鎂表示硬度。鈣和鎂的酸式碳酸鹽加熱分解析出沉淀而除去。這種鹽所形成的硬度為暫時硬度。鈣和鎂的其它鹽類(如硫酸鹽、氯化物等)加熱不能分解，所形成的硬度為永久硬度。暫時硬度與永久硬度之和稱為總硬度。 碳酸鹽硬度和非碳酸鹽硬度，經長期燒煮后

2、，都能形成鍋垢，這樣既浪費燃料，又易阻塞水管，嚴重時會引起鍋爐爆炸。同時，硬水不宜作為釀造用水。 表示方法： 用1升水中含鈣離子、鎂離子的當量數為單位 用1升水中含有鈣鹽及鎂鹽的總量相當于10氧化鈣時，稱為1度（又稱德國度）。 硬水處理方法有電滲析法、離子交換法樹脂（磺化媒法）等。,第五節(jié)水分硬度的測定,一、原理,EDTA（Ethylenediamine Tetraacetie acid）二鈉鹽與水中鈣鎂生成可溶性無色絡合物，指示劑鉻黑T與鈣鎂能形成酒紅色絡合物，但EDTA與鈣鎂的絡合物更穩(wěn)定。當在水樣中加入藍色的鉻黑T后，生成鉻黑T鈣、鎂絡合物，而使溶液呈紅色。再用EDTA滴定時，生成無色的

3、EDTA鈣、鎂絡合物，鉻黑T被被游離出來，溶液由紅色突變?yōu)樗{色，以示終點。 鉻黑T能與許多金屬離子，如Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cd2+等形成紅色的絡合物。顯然，銘黑T在pH6或pH12時，游離指示劑的顏色與形成的金屬離子絡合物顏色沒有顯著的差別。只有在pH=811時進行滴定， 終點由金屬離子絡合物的紅色變成游離指示劑的藍色，顏色變化才顯著。因此，使用金屬指示劑，必須注意選用合適的pH范圍。,第一章第五節(jié)釀造水的硬度測定,（二）試劑,1） pH10鹽酸羥胺氫氧化銨緩沖溶液 2）1%鉻黑鐵指示劑。 3） 0.02N乙二胺四乙酸二鈉標準溶液,（三）測定步驟 1總硬度的測定 吸取50mL水樣（若

4、硬度過大，可少取水樣，用純水稀釋至50mL，若硬度過低，改用100mL），置于250mL三角瓶中。加入5mL緩沖溶液和5滴鉻黑T指示劑，立即用乙二胺四乙酸二鈉標準溶液滴定至溶液從紫紅色成為不變的天藍色為止。 2永久硬度的測定 吸取50mL水樣（若硬度過大，可少取水樣，用純水稀釋至50mL，若硬度過低，改用100mL），置于250mL三角瓶中，煮沸10分鐘，用濾紙過濾，濾液用250mL三角瓶接收，用水充分洗滌，使濾液約為50mL。加入5mL緩沖溶液和5滴鉻黑T指示劑，立即用乙二胺四乙酸二鈉標準溶液滴定至溶液從紫紅色成為不變的天藍色為止。,第一章第五節(jié)釀造水的硬度測定,（五）討論,1）鉻黑T指示劑

5、易被空氣氧化而失效，故配制時加入還原劑（如鹽酸羥胺）則可延長使用期限。固體指示劑的配制方法是稱取0.05克鉻黑T，加100g氯化鈉，研磨均勻，用時加1小匙。 2）EDTA溶液用標準氧化鎂溶液標定時，標準氧化鎂溶液配制一定要在1：4硫酸溶液中溶解后再稀釋，否則所配制的氧化鎂溶液為白色渾濁液體。 3）水樣中含有二價銅與三價鐵時，可分別加入硫化鈉和三乙醇胺排除干擾。,第一章第五節(jié)釀造水的硬度測定,第六節(jié)原料中粗脂肪的測定,一、原理 脂肪可作為微生物發(fā)酵碳源，但在某些發(fā)酵生產中脂肪含量過高會影響發(fā)酵的進行或產生許多副產物。脂肪不溶于水，易溶于乙醚、石油醚、氯仿等有機溶劑，脂肪的測定是用有機溶劑溶出，蒸

6、發(fā)有機溶劑，殘渣即為脂肪。然而殘渣中除脂肪外，還包括其他揮發(fā)油，樹脂、部分有機酸、色素等，故稱粗脂肪。原料中粗脂肪的測定采用索氏抽提法。,第一章第六節(jié)原料中粗脂肪的測定,索氏抽提器,1濾紙筒 2浸取管 3支管 4虹吸管,三、測定步驟,取158cm定性濾紙，卷成直徑約為2cm的圓筒，用脫脂細白線扎住，將濾紙筒的一端折入筒內，壓緊成圓筒底，取少量脫脂棉放入筒底，將濾紙筒準確稱重。在濾紙筒內裝入約25克干燥后的試樣，準確稱重。試樣上放一層脫脂棉，并將筒的頂端紙邊捺入筒內，使整個濾紙筒高約4cm。 將裝有試樣的濾紙筒放入索氏抽提器的浸取管中，在抽提瓶中放入約三分之二的無水乙醚，于約50水浴中抽提45小

7、時，抽提速度為每分鐘乙醚滴下速度約150滴或每小時乙醚虹吸管吸58次為宜。抽提完后，將抽提瓶中乙醚蒸發(fā)或蒸餾回收，然后于100150烘箱內干燥1小時，準確稱重，直至恒重。,第七節(jié)原料中粗纖維素的測定,原理 試樣經酸堿處理后，使淀粉、半纖維素、蛋白質、脂肪等變成可溶性物質而被除去，殘剩的纖維素和其他植物質的膜壁等統(tǒng)稱為粗纖維素，稱量。對含油脂較試樣可用硝酸醋酸處理試樣。 測定步驟 準確稱取23克試樣，置入500mL三角瓶中，加100mL乙醚，蓋嚴，靜置過夜，以除去脂肪。用傾瀉法除去乙醚層，再用乙醚洗滌殘渣，殘存少量乙醚于水浴中蒸發(fā)去。 加200mL1.25%硫酸溶液，煮沸半小時，抽濾，用熱水洗滌

8、至濾液呈中性。 將殘渣用1.25%氫氧化鈉溶液轉入500mL燒杯中，補足1.25%氫氧化鈉溶液至200ml，蓋上表面皿，煮沸半小時，用經灼燒過的古氏坩堝抽濾，用熱水洗滌至濾液呈中性，再用乙醇、乙醚洗滌。將古氏坩堝連同纖維素，于100105干燥至恒重，然后灼燒至恒重,第八節(jié)廢糖蜜中總膠體的測定,概述 發(fā)酵工業(yè)所謂的糖蜜（molasses（A thick syrup produced in refining raw sugar and ranging from light to dark brown in color），主要指制糖工業(yè)上的廢糖蜜。所謂廢糖蜜是指不能再用以煮制糖品的，分為甘蔗糖蜜、糖

9、蜜是很好的發(fā)酵原料，糖蜜原料發(fā)酵生產谷氨酸可大幅度降低成本，節(jié)約能源，節(jié)約酸、堿，簡化操作，便于實行高糖發(fā)酵工藝，有利于產酸率和轉化率提高。,原理,利用乙醇能除去使親水膠體穩(wěn)定的水膜，而使膠體凝聚。一般廢糖蜜呈堿性，加入乙醇之前應先將樣品調至酸性，一方面避免在堿性溶液中蔗糖鹽與膠體一同沉出，另一方面把溶液調節(jié)到膠體的等電點（約PH4-4.5），使膠體更易沉淀出來。 測定前必須先將樣品稀釋后過濾除去不溶性懸浮物，以免與膠體一同沉出，使結果偏高。沉淀出來的膠體表面吸附有糖分，須用乙醇充分洗滌，直至洗液對萘酚不起反應為止。,第一章第八節(jié)廢糖蜜中總膠體的測定,測定步驟,準確稱取10克試樣，用水稀釋定容

10、至200mL，過濾。吸取5mL濾液于三角瓶中，用0.1N鹽酸溶液調節(jié)到pH4.5。加95%精餾乙醇45mL于沸水浴上加熱15分鐘。用已稱重的干濾紙過濾，沉淀用90%乙醇充分洗滌至濾液與萘酚不起反應為止，沉淀物連同濾紙在100烘箱中烘干，直至恒重。,第一章第八節(jié)廢糖蜜中總膠體的測定,討論,糖的定性檢驗：模氏反應 萘酚是鑒別糖類的試劑，戊糖、己糖、聚戊糖及聚己糖等，在濃硫酸存在下脫水生成糠醛及其衍生物，再與萘酚反應生成紫色化合物，可以檢別糖類的存在。 試驗方法：取濾液約3mL于試管中，加3滴萘酚溶液，搖勻后將試管傾斜，沿管壁緩緩加入12mL濃硫酸，兩液面接觸生成紫色環(huán)證明有糖類存在。,第九節(jié)廢糖蜜

11、灰分的測定,原理 灰分是指有機物質經完全燃燒后所殘留的物質，其中含有微生物發(fā)酵過程中所需要的某些微量無機鹽等，但灰分過高則妨礙發(fā)酵。 廢糖蜜在灼燒時糖類和其他有機物先變成碳，進一步氧化生成二氧化碳而被除去。同時生成的二氧化碳與樣品中各種陽離子作用生成相應的碳酸鹽，磷和硫的有機物則在灼燒過程中變?yōu)榱姿猁}和硫酸鹽。這種樣品直接灼燒所得的殘留物質稱為碳酸灰，這種方法稱為直接燒灰法。,原理,在直接燒灰法中，應先將樣品在較低溫度下灼燒至完全炭化，然后移入高溫爐。若開始溫度過高，樣品因燃燒過劇而噴濺損失或由于部分聚集的有機物未能立即全部灰分，而使硫和磷的化合物在高溫下被碳還原成游離態(tài)元素揮發(fā)損失。灼燒時溫

12、度一般控制不宜超過600，若灼燒溫度過高，會使灰分熔融，凝聚為固形物而把未灰化的碳粒覆蓋，使其不易熔盡。另外，熔融的堿金屬碳酸鹽腐蝕坩堝，若變成氧化物則重量減輕。 硫酸灰：灼燒前先加入濃硫酸使有機物易于除去，然后再高溫灼燒，這種方法操作比較容易，殘留的灰分為硫酸鹽，稱為硫酸灰，其重量較碳酸灰為重。 所以，在標識時要注明“碳酸灰”或 “硫酸灰”。,第一章第九節(jié)廢糖蜜中灰分的測定,試劑,純橄欖油 碳酸銨溶液 濃硫酸 1：1硝酸溶液,測定步驟,碳酸灰法（直接燒灰法） 準確稱取4.55.5克試樣，置入磁坩堝中（磁坩堝應先于600下灼燒至恒重），加幾滴純橄欖油以抑制基過快揮發(fā)及減輕冒泡膨脹現(xiàn)象，加熱至樣

13、品完全炭化。將磁坩堝移入高溫爐，在500600下灼燒至全部變成白灰（有時略帶淡紅色）。取出冷卻，加入少許碳酸銨溶液，在水浴上蒸發(fā)至干，再放入高溫爐，在上述溫度下灼燒1015分鐘，取出，于干燥器70冷卻至室溫，稱重。再灼燒，直至恒重。 硫酸灰法 準確稱取4.55.5克試樣于坩堝中，加入23mL濃硫酸，用鉑絲（或鎳鉻絲）攪拌均勻，鉑絲上粘附的樣品可用一小塊無灰濾紙擦凈，并將此塊濾紙放入坩堝內與樣品處理。開始時緩慢加熱，加熱過程須防止樣品溢出，至樣品全部炭化及部分灰化后移入高溫爐，在600下灼燒至全部變成白灰。取出冷卻，加1：1硝酸溶液數滴，繼續(xù)灼燒15分鐘。燒好的灰分應呈白色或淺紅色，取出在干燥器

14、70冷卻后稱重。再灼燒，直至恒重。,干法灰化,又稱熔融法,是將試樣與熔劑一起,高溫灼燒分解試樣。常用于測定金屬與無機鹽類。 熔劑：碳酸鈉、碳酸鉀、硫酸氫鉀、焦硫酸鉀等。 助灰劑：硝酸、硫酸、硝酸鎂等到 特點：干法灰化溫度特高，有些物質易揮發(fā)損失。如鉛的測定中，灰化溫度需在500以下進行。引入較多鉀、鈉鹽，同時也可能從坩堝中帶入雜質，故一般采用濕法消化。,第四節(jié)粗蛋白測定,概述 原料中蛋白質含量的高低對發(fā)酵制品的質量關系甚大。如啤酒釀造中，原料中蛋白質含量過高，往往能造成啤酒渾濁。但對醬油等發(fā)酵食品，需選用蛋白質含量較高的原料（如黃豆粉）。對酵母講，含氮量是酵母成品質量的一個重要指標。,一、原料

15、中粗蛋白的測定,pro的測定通常利用經典的凱氏定氮法，其原理是將樣品與濃硫酸共熱消化，蛋白質中的氮生成硫酸銨鹽，然后堿化蒸餾使氨游離，用標準酸接收，過量酸用標準堿滴定。根據樣品中pro含量不同又分為凱氏定氮常量法、半微量法和微量法，但它們的基本原理都是一樣的。 凱氏定氮法所測得的為試樣中總氮量，除蛋白質中氮外，還包括氨基酸、酰胺、核酸等中的氮，換算成蛋白質，稱為粗蛋白質。,原理,1）試樣消化：,準確稱取試樣2克，置入250mL凱氏定氮瓶中，加3克硫酸鉀和1克硫酸銅，加20mL濃硫酸，瓶口安放一只小三角漏斗，于電爐上加熱消化。若消化液色澤難褪去，則冷卻后，加35mLH2O2，繼續(xù)加熱，直至消化液

16、清澈透明為止。冷卻，轉入100mL容量瓶中（預先加入20mL水），用水充分洗滌凱氏定氮瓶，冷卻至室溫，再用水定容至刻度，搖勻。,加堿蒸餾,吸取50mL稀釋消化液，置入500mL平底燒瓶中，加約100mL水和數粒沸石或素瓷（素瓷要預先用酸堿處理或煅燒過），加60mL30%氫氧化鈉溶液（或在燒瓶上安一分液漏斗加堿），立即蓋嚴，蒸餾約45分鐘（或蒸出原液體積約三分之一）。接收瓶中預先準確加入25或50mL0.1N硫酸溶液。,3）滴定,蒸餾完后，用水洗滌冷凝器，取出接收瓶，加4滴0.1%甲基紅指示劑，用0.1N氫氧化鈉溶液滴定至黃色。,5討論（一）,1）凱氏定氮瓶既適用于有機氮，又適用于無機氮，其測定

17、范圍較寬。常一法可測定約40mg氮，而用水蒸汽蒸餾的半微量法可測定至數，最低可檢出0.05氮。 2）凱氏定氮法消化時，必須在通風柜中進行。開始消化時宜用文火加熱，穩(wěn)定后，才用強火加熱，中途需搖動凱氏定氮瓶，使附在瓶壁上的黑點沖下。 3）凱氏定氮法消化時可催化劑可采用汞；蒸餾時也有中數粒鋅防暴沸；接收液也可采用24%硼酸溶液，用標準酸滴定，其指示劑為甲基紅溴甲酚綠混合指示劑，終點變色敏銳。,5討論（二）,4）氮與蛋白換算系數：pro%=總氮%K 乳制品K=6.38（N=15.7%），小麥粉K=5.79（N=17.6%），動物膠K=5.6（N=18.0%） 冰蛋K=6.7（N=14.8%），大豆制

18、品K=6.0（16.7%），K=6.25則（N=16%）,5）影響氨化和速度的因素（一）,（1）K氏燒瓶和取樣量 如果稱1g以上的樣品，就需要K氏燒瓶最小500ml，8001000ml的更好，這樣的K氏燒瓶對于縮短氨化時間，加熱的均勻性和完全氨化效果最好。 （2）分解劑H2SO4和K2SO4的添加量 有機物分解需要H2SO4量，H2SO4應根據有機物種類不同而加的量就不同，如果試樣含脂類高，則加H2SO4多，為了提高分解溫度，要大量添加K2SO4，但不能太多，也不能太少，太少則氨化不充分。,影響氨化和速度的因素（二）,（3）催化劑 用作催化劑的有Hg、HgO、Se，硒化合物，CuSO4、TiO2，對Hg，HgO有毒但結果好，Se與