實驗 聚丙烯酰胺.ppt

1、實驗 聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白,11級醫(yī)學檢驗四小組,實驗?zāi)康?掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理 熟悉盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術(shù),實驗原理,以聚丙烯酰胺凝膠做支持物的電泳技術(shù)是聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）。 聚丙烯酰胺凝膠是單體聚丙烯酰胺（Acr)和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺(Bis)交聯(lián)而成的，催化劑為過硫酸銨(AP)，加速劑為四甲基乙二胺TEMED, 形成三維網(wǎng)狀凝膠。,聚丙烯酰胺凝膠（PAG）的聚合反應(yīng)：,由單體聚丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)凝膠。 Bis：交聯(lián)劑 過硫酸銨(AP) ：引發(fā)劑，提供自由基， 引發(fā)聚合反應(yīng) 四甲基乙二胺(TE

2、MED)：催化劑, 加快引發(fā) 釋放自由基的速度,三大效應(yīng),聚丙烯酰胺凝膠電泳采用不連續(xù)系統(tǒng)（即緩沖液成分、pH及凝膠孔徑不連續(xù)）聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)、電荷效應(yīng)，將血清中各蛋白質(zhì)成份依其分子大小、電荷多少不同而進行高效分離。,1. 濃縮效應(yīng),分離機制：,凝膠層孔徑不連續(xù)：濃縮膠大孔徑，分離膠小孔徑 緩沖液離子不連續(xù)：電泳液中Gly-(慢離子)； 凝膠中 Cl-(快離子)；Pr-介于二者之間 pH值不連續(xù)：電泳緩沖液pH=8.3；濃縮膠pH=6.7； 分離膠pH=8.9 電位梯度不連續(xù),緩沖液離子成分、PH的不連續(xù)性：電極緩沖液通常為pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液，樣品

3、及凝膠中緩沖液為pH6.7 Tris-HCL緩沖液。電極緩沖液的pH=8.3，甘氨酸的電離小，有效遷移率小，稱為慢離子；濃縮膠中的氯離子完全電離，有效遷移率大，稱為快離子；蛋白質(zhì)在濃縮膠中介于二者之間。 電位梯度的不連續(xù)性：電泳開始后，氯離子跑得最快，留下一段低電導區(qū)，產(chǎn)生高電位梯度（電位與電導率成反比），使甘氨酸離子追趕氯離子，蛋白質(zhì)夾在中間而被壓縮。1cm厚樣品層可以壓縮0.25m的厚度。,有效遷移率 = 遷移率 解離度,2.分子篩效應(yīng) 分子量或分子大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率，這就是分子篩效應(yīng)。當樣品進入分離膠，凝膠孔徑變小，分子量小，

4、阻力小，移動快；分子量大，阻力大，移動慢。 3.電荷效應(yīng) 電荷量不同，遷移率不同。,實驗儀器,電泳裝置 穩(wěn)壓電源,盤狀電泳槽,毛細滴管 刻度吸量管 玻璃管和橡膠帽 微量移液器 注射器和長針頭 脫色搖床,試劑,Acr和Bis：棕色瓶保存 TEMED-四甲基乙二胺，避光保存。 過硫酸銨(新鮮配制) 染色液：0.1溴酚蘭液 洗脫液：7醋酸 其他試劑：見下表貯存液的配制。,1準備 每人取電泳管1支，并在距電泳管下端7cm和7.5cm處畫橫線做標記，加1-2滴40蔗糖于橡膠帽內(nèi)堵住電泳管底部，塞緊。,實驗步驟,2制膠(取小燒杯2個,按表加液),按上述操作混勻分離膠溶液，緩慢注入玻璃管7cm處，滴加一滴蒸

5、餾水，然后在室溫下聚合，聚合20-30min； 待分離膠成膠后，用濾紙條吸干上層水分，灌濃縮膠至7.5cm處，再滴加蒸餾水一滴，靜置15min左右。 濃縮膠凝膠后，吸取上層水，拔掉橡膠帽吸去下層蔗糖溶液。將電泳管套在橡皮塞中，裝入電泳槽，然后加入下槽緩沖液，排凈管底空氣使用。,3灌柱,4樣品液制備： 血清:0.1ml 40%蔗糖:0.1ml 0.05%溴酚蘭:0.1ml 添加于一個小試管中混勻備用,5裝電泳管和上樣 將凝膠管插入電泳槽槽底橡膠塞孔中，加入電極緩沖液與下電泳槽，隨后放入凝膠管及上槽，除氣泡,然后在上層添加緩沖溶液覆蓋凝膠管上端，除氣泡。 加樣品液10l至濃縮膠面。 6電泳 上槽負

6、極（黑） 下槽正極（紅） 電流：先濃縮膠:1.5mA/管 然后分離膠:3.0mA/管,7剝膠 電泳完成后取下玻管，用一長針頭注射器吸滿蒸餾水為潤滑劑，將針頭插入玻管內(nèi)壁和凝膠柱表面之間，緩緩旋轉(zhuǎn)玻管，一邊注水一邊使針頭呈螺旋式推進。最后可用洗耳球在玻管濃縮膠端輕加壓力，就可將凝膠柱壓出玻管。,8 固定和染色： 先用固定液固定5分鐘，再在培養(yǎng)皿中裝0.用洗脫液漂洗脫色。1%溴酚藍堿性染液染色10mim（染液回收）。 9脫色 加洗脫液（7%冰醋酸）搖床脫色，三次，每次23min，一周之后觀察結(jié)果。,實驗結(jié)果,+,1丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺是神經(jīng)毒性試劑，對皮膚有刺激作用，注意避免直接接觸。 2制膠

7、時，要充分搖勻，加速劑TEMED最后加。 3注膠過程最好一次性完成,避免產(chǎn)生氣泡。 4. 氨基黑染色脫色染液回收。 5固體膠切忌倒入水池。 6. 注意觀察實驗現(xiàn)象：分界面，濃縮效應(yīng) 7.水封的目的是為了使分離膠上延平直，并排除氣泡。 8.凝膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。 9.剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分。,注意事項：,方法學評價,PAGE優(yōu)點： 分辨率高，具有三大效應(yīng)，靈敏度高可達10-6g 可以通過控制單體和交聯(lián)劑的濃度來調(diào)節(jié)凝膠孔徑的大小使大分子得到更好地分離。 聚丙烯酰胺凝膠只帶有不活潑的酰胺基側(cè)鏈，所以凝膠性能穩(wěn)定，電滲作用小，無吸附，化學惰性強，與生物大分子

8、不發(fā)生反應(yīng)。電泳過程中不受溫度、PH的變化影響。 在一定濃度范圍內(nèi)，凝膠透明，有彈性，機械性能好，易于觀察。,單體純度高，在相同的實驗條件下，電泳結(jié)果有很好的重復(fù)性。 凝膠雜質(zhì)少，在很多溶劑中不溶，可適用于少量樣品的制備，不致污染樣品。 缺點：但它的操作較復(fù)雜,影響實驗效果的因素較多,使其在生化實驗教學中的開展受到一定限制。,醋酸纖維薄膜電泳,優(yōu)點： 樣品用量少、靈敏度高 區(qū)帶清晰，分離效果好 易于定量，便于保存。 對各種蛋白質(zhì)幾乎完全不吸附，無拖尾現(xiàn)象。對染料也沒有吸附，電滲作用小。 應(yīng)用面廣。 缺點： 分辨率較聚丙烯酰胺凝膠電泳要低,SDS-PAGE 優(yōu)點與PAGE相似，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常應(yīng)用于提純過程中純度的檢測，純化的蛋白質(zhì)通常在SDS電泳上應(yīng)只有一條帶，但如果蛋白質(zhì)是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應(yīng)于各個亞基的幾條帶。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳具有較高的靈敏度，一般只需要不到微克