細胞生物學研究方法專題講座.ppt

1、第三章 細胞生物學研究方法,STUDY METHODS OF CELL BIOLOGY,本章內(nèi)容提要,細胞生物學研究方法多種多樣,總的說來,可分為四個大類: 顯微技術 細胞組分分析與原位檢測技術 細胞培養(yǎng)與細胞工程 分子生物學技術,第一節(jié) 細胞形態(tài)結(jié)構的觀察方法,顯微鏡是觀察細胞的主要工具。 根據(jù)光源不同可分為:,光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。,前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，后者則以電子束為光源,顯微鏡的發(fā)明打開了微觀世界的大門,光學顯微鏡,透射電子顯微鏡,掃描電子顯微鏡,、光學顯微技術,普通復式光學顯微鏡 熒光顯微鏡 激光共聚焦掃描顯微鏡 暗視野顯微鏡 相差和微分干涉顯微鏡 倒

2、置顯微鏡,1.顯微鏡的發(fā)明,300多年前 Leeuwenhoek 世界上最早的顯微鏡,Robert Hooke 軟木蜂窩狀的小格子“細胞”,（一）普通光學顯微鏡 Light microscopy,Large Student Microscope made byCharles Chevalier 1840,1812年，蘇格蘭人D. Brewster 發(fā)明油浸物鏡，改進了體視顯微鏡。,現(xiàn)代顯微鏡,2.光學顯微鏡構成： 照明系統(tǒng): 光學放大系統(tǒng): 機械裝置:鏡座.鏡柱等,目鏡與物鏡(玻璃透鏡),光學顯微鏡,光源、折光鏡、聚光鏡,3. 成像原理：,經(jīng)物鏡形成倒立實像，經(jīng)目鏡進一步放大成像。,4. 分辨

3、力： D=0.61/NA 其中為入射光線波長；NAsin(/2 )，為鏡口率 , n=介質(zhì)折射率；=鏡口角（樣品對物鏡鏡口的張角） 。,指分辨物體最小間隔的能力. 是顯微鏡的最重要參數(shù).,如何提高顯微鏡的分辨能力？,顯微鏡的物像是否清楚主要決定了哪些因素？,增加分辨率的二個必備條件: 增大鏡口率-有一定限度 縮短波長-為可靠辦法 普通光鏡的最大分辨率為0.2m, 大于0.2m的結(jié)構為顯微結(jié)構, 而小于0.2m的稱為亞顯微結(jié)構.,幾種介質(zhì)的折射率,為什么使用油鏡能提高分辨率?,不同光線的波長,光學顯微鏡的幾個光學特點： 制作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.651.78，所用介質(zhì)的折射率越接近玻璃的

4、越好。 sin /2的最大值必然小于1；介質(zhì)為空氣，鏡口率一般為0.050.95；其中低倍鏡0.28，高倍鏡0.65，油鏡1.25，油鏡頭用香柏油為介質(zhì)，鏡口率可接近1.5。 普通光線的波長為400700nm，分辨力數(shù)值不會小于0.2m，人眼的分辨力為0.2mm, 因此光學顯微鏡的最大設計倍數(shù)為1000X。,.普通光鏡樣品的制作:,取材固定脫水包埋切片脫蠟復水染色脫水透明封片觀察,固定劑(甲醛)固定：殺死細胞，穩(wěn)定細胞的化學成份； 包埋劑(石蠟)包埋; 切片(5m )； 染色:如蘇木精對負電荷分子有親和性，能顯示出細胞內(nèi)核酸的分布；酸性染料如伊紅可使細胞質(zhì)染色；蘇丹染料的乙醇飽和溶液能使脂肪著

5、色。,（二）熒光顯微鏡 Fluorescence microscope,特點：光源為紫外線，波長較短，分辨力高于普通顯微鏡(0.1m )； 有兩個特殊的濾光片；可觀察活細胞.,紫外線發(fā)生裝置(如弧光燈、水銀燈等 ),什么是熒光 ?,物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。 即：物質(zhì)吸收短波光，發(fā)射出的長波光。,熒光顯微鏡的光通路,熒光顯微鏡的特殊用途: 用于觀察能激發(fā)出熒光的結(jié)構 免疫熒光觀察、基因定位、疾病診斷 細胞與組織中物質(zhì)的吸收與運輸 化學物質(zhì)的分布與定位等 熒光現(xiàn)象有兩種: 自發(fā)熒光（葉綠素） 誘發(fā)熒光（加熒光素）,微管呈綠色、微絲紅色、核藍色,

6、Fluorescence image of epithelial cell, DNA in blue and Microtubules in green,（三）激光共聚焦掃描顯微鏡 Laser confocal scanning microscope, LCSM,用激光作光源，逐點、逐行、逐面快速掃描。一束光線通過聚焦成點，在樣品表面掃描后成象。它是一個掃描光學顯微鏡，因為在一個時間試樣上只有一個點被照亮。隨著試樣被掃描，像素的積累便構成了圖像。 因為物鏡的焦平面很?。ㄖ挥?.5皮米）所以能夠獲得試樣的真正光學斷面。所有在焦平面以上或以下的圖像數(shù)據(jù)都到不了探測器。隨著焦平面的上升或者下降（Z軸

7、），可以得到試樣的分層圖像并存儲起來，這些分層圖像就由計算機重構成三維圖像。 分辨力是普通光學顯微鏡的3倍。 用途類似熒光顯微鏡，但能掃描不同層次，形成立體圖像, 研究亞細胞結(jié)構與組分。 共聚焦?,物鏡與聚光鏡同時聚焦到同一個小點。,laser confocal scanning microscope, LCSM,LCSM Image of a Xenopus Melanophore microtubule cytoskeleton (green) and the nucleus (blue),（四）暗視野顯微鏡 dark field microscope,聚光鏡中央有擋光片，照明光線不直接進

8、人物鏡，只允許被標本反射和衍射的光線進入物鏡，因而視野的背景是黑的，物體的邊緣是亮的。 可觀察 4200nm的微粒子，分辨率比普通顯微鏡高50倍。,用以觀察未經(jīng)染色的活體或膠體粒子,暗視野顯微鏡光路,把透過標本的可見光的光程差變成振幅差，明者更明，暗者更暗，立體感增強。從而提高了各種結(jié)構間的對比度，使各種結(jié)構變得清晰可見。在構造上，相差顯微鏡有不同于普通光學顯微鏡的特殊之處: 物鏡中加了涂有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4.光源聚光器中增加一環(huán)形光闌。,（五）相差顯微鏡phase contrast microscope,由PZernike 于1932年發(fā)明，并因此獲1953

9、年諾貝爾物理獎。,原理,用途：觀察未經(jīng)染色的標本和活細胞。,（六）微分干涉顯微鏡 Differential interference contrast microscope （DIC）,1952年，Nomarski發(fā)明，利用兩組平面偏振光的干涉，光線經(jīng)棱鏡折射后分成兩束，在不同時間經(jīng)過樣品后兩束光再會合，從而樣品中厚度上的微小差異就轉(zhuǎn)化成明暗區(qū)別，加強影像的明暗效果，能顯示結(jié)構的三維立體投影。觀察培養(yǎng)的活細胞。,DIC顯微鏡下的硅藻,（七）倒置顯微鏡 inverse microscope,物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，通常具有相差物鏡，有的還具有

10、熒光裝置。,倒置顯微鏡,正置顯微鏡,（八）當代顯微鏡的發(fā)展趨勢,采用組合方式，集普通光鏡加相差、熒光、暗視野、DIC、攝影裝置于一體。 自動化與電子化。,(九)熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術,熒光能量共振轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是較早發(fā)展起來的一門技術，隨著綠色熒光蛋白應用技術的發(fā)展，F(xiàn)RET已經(jīng)成為檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，在生物大分子相互作用分析、細胞生理研究、免疫分析等方面有著廣泛的應用。,什么是熒光 ?,物質(zhì)中的電子吸收光的能量由低能狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)楦吣軤顟B(tài)，再回到低能狀態(tài)時釋放出的光。 即：物質(zhì)吸

11、收短波光，發(fā)射出的長波光。,任何熒光物質(zhì)都具有兩種特征光譜： 激發(fā)光譜與發(fā)射光譜,39,其中S0、S1和S2分別表示分子的基態(tài)、第一和第二電子激發(fā)的單重態(tài),T1和T2則分別表示分子的第一和第二電子激發(fā)的三重態(tài)。,V=0、1、2、3、表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動能級。,分子內(nèi)的光物理過程,保持固有的熒光特性 熒光波長激發(fā)波長 熒光強度極小于激發(fā)光的強度 有不同程度的衰減 熒光強度取決于激發(fā)光強度、被檢物濃度、熒光效率,熒光的性質(zhì),熒光能量共振轉(zhuǎn)移的原理,I.熒光能量共振轉(zhuǎn)移: 受激態(tài)熒光素將其能量向另一個熒光素傳遞，使后者被激發(fā)，這一過程稱熒光能量共振轉(zhuǎn)移。能量的提供者叫供體熒光素，能量的接受者叫受體

12、熒光素。,供體熒光素 受體熒光素,1.供體與受體間的距離 10nm或=1-7nm 2.供體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜有實質(zhì)性的重疊,II.熒光能量共振轉(zhuǎn)移的條件,488nm 520nm 650nm,供體熒光素 (Cy2) 受體熒光素 (Cy3),供體熒光素 (Cy2) 受體熒光素 (Cy3),熒光能量共振轉(zhuǎn)移的結(jié)果：使得供體的熒光強度比它單獨存在時要低的多（熒光猝滅），而受體發(fā)射的熒光卻大大增強（敏化熒光）。,(十)熒光漂白恢復技術,fluorescence photobleaching recovery,FPR 熒光漂白后的恢復技術是將待測細胞用熒光物質(zhì)標記，借助高強度脈沖式激光照射細胞的某

13、一區(qū)域，可以造成該區(qū)域熒光分子的光淬滅；通過低強度激光掃描成像，可以探測到該區(qū)域周圍的非淬滅熒光分子向受照射區(qū)域擴散的速率。由于光淬滅過程是不可逆的，熒光恢復過程可明顯的反映熒光標記物質(zhì)及其結(jié)合物的運動。,光脫色熒光恢復技術檢測膜流動性,二、電子顯微技術,（一）透射電子顯微鏡 transmission electron microscope, TEM,通過電子束穿透樣品成像,1932 年，德國Ruska 發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）。目前TEM 的分辨力可達0.2nm。,透射電子顯微鏡,(偽彩色),以電子束作光

14、源，電磁場作透鏡。電子束的波長短，小于0.1nm. 由電子照明系統(tǒng)、電磁透鏡成像系統(tǒng)、真空系統(tǒng)、記錄系統(tǒng)、電源系統(tǒng)等5部分構成。 分辨力0.2nm，放大倍數(shù)可達百萬倍。 用于觀察超微結(jié)構（ultrastructure），即小于0.2m、光學顯微鏡下無法看清的結(jié)構，又稱亞顯微結(jié)構（submicroscopic structures）。,1. 原理,電子顯微鏡與光學顯微鏡的基本區(qū)別,分辨本領 光源 透鏡 真空 成像原理 光學 200nm 可見光 玻璃 不要求 樣品吸收光形成明暗 顯微鏡 (400nm- 700nm ) 反差和顏色變化 100nm 紫外光 玻璃 不要求 (約200nm) 電子 0.1

15、nm 電子束 電磁 要求 樣品對電子的散射 顯微鏡 ( 0.010.9nm ) 和透射形成明暗反差,光鏡與電子顯微鏡(透射電鏡)的結(jié)構,2、制樣技術,1）超薄切片 電子束穿透力很弱，用于電鏡觀察的標本須制成厚度僅50nm的超薄切片，用超薄切片機（ultramicrotome）制作。 通常以鋨酸和戊二醛固定樣品，丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式切片，重金屬（鈾、鉛）鹽染色。,電鏡制樣要求:樣品很薄;樣品的精細結(jié)構保持完好,萊卡超薄切片機,電鏡樣品的制備過程,2）負染技術,用重金屬鹽(如磷鎢酸)對鋪展在載網(wǎng)上的樣品染色；吸去染料，干燥后，樣品凹陷處鋪了一層重金屬鹽，而凸出的地方

16、沒有染料沉積，從而出現(xiàn)負染效果，分辨力可達1.5nm左右。,Negative Stained Actin,3）冰凍蝕刻 freeze-etching,亦稱冰凍斷裂。標本置于干冰或液氮中冰凍。然后斷開，升溫后，冰升華，暴露出了斷面結(jié)構。向斷裂面上噴涂一層蒸汽碳和鉑。然后將組織溶掉，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為復膜（replica）。,A Yeast Cell,冰凍蝕刻技術,通過電視成像 20世紀60年代問世，用來觀察標本表面結(jié)構。 分辨力為610nm，由于人眼的分辨力（區(qū)別熒光屏上距離最近兩個光點的能力）為0.2mm，掃描電鏡的有效放大倍率為: 0.2mm/10nm=20000X。,（二）掃描電

17、子顯微鏡scanning electron microscope，SEM,掃描電鏡及其圖像,人類紅細胞,工作原理：是用一束極細的電子束掃描樣品，在樣品表面激發(fā)出次級電子，次級電子的多少與樣品表面結(jié)構有關，次級電子由探測器收集，信號經(jīng)放大用來調(diào)制熒光屏上電子束的強度，顯示出與電子束同步的掃描圖像。 為了使標本表面發(fā)射出次級電子，標本在固定、脫水后，要噴涂上一層重金屬膜，重金屬在電子束的轟擊下發(fā)出次級電子信號。 電視的方式成像,掃描電鏡的光學系統(tǒng),掃描電子顯微鏡原理,透射電鏡,人類紅細胞,yeast,Man sperm,（三）掃描隧道顯微鏡scanning tunneling microscope

18、，STM,原理：根據(jù)隧道效應而設計，當原子尺度的針尖在不到一個納米的高度上掃描樣品時，此處電子云重疊，外加一電壓（2mV2V），針尖與樣品之間形成隧道電流。電流強度與針尖和樣品間的距離有函數(shù)關系，將掃描過程中電流的變化轉(zhuǎn)換為圖像，即可顯示出原子水平的凹凸形態(tài)。 分辨率：橫向為0.10.2nm，縱向可達0.001nm。 用途：三態(tài)（固態(tài)、液態(tài)和氣態(tài)）物質(zhì)均可進行觀察。,什么是隧道電流?低電壓下,當兩電極之間近到一定距離(100nm以內(nèi))時,電極之間所產(chǎn)生的電流.,掃描隧道顯微鏡原理,Cs atoms (red) on the GaAs surface (blue).,掃描隧道顯微鏡成像,STM

19、image, Benzene molecules accumulate at step edges on Cu,三、顯微操作技術micromanipulation technique,在倒置顯微鏡下利用顯微操作器進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控制顯微注射針在顯微鏡視野內(nèi)移動的機械裝置。 顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。 細胞核移植技術已有幾十年的歷史，Gordon等人（1962）對非洲爪蟾進行核移植獲得成功。我國著名學者童第周等上個世紀70年代在魚類細胞核移植方面進行了許多工作，并取得了豐碩成果。,顯微操作儀,第二節(jié) 細胞分離技術,

20、一、離心技術,是分離細胞器（如細胞核、線粒體、高爾基體）及各種大分子基本手段。 轉(zhuǎn)速為1025kr/min的離心機稱為高速離心機。 轉(zhuǎn)速25kr/min，離心力89K者稱為超速離心機。 目前超速離心機的最高轉(zhuǎn)速可達100000r/min，離心力超過500Kg。,（一）差速離心 Differential centrifugation,特點： 介質(zhì)密度均一； 速度由低向高，逐級離心。 用途：分離大小相差懸殊的細胞和細胞器。 沉降順序：核線粒體溶酶體與過氧化物酶體內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與高基體核蛋白體。 可將細胞器初步分離，常需進一步通過密度梯離心再行分離純化。,Low speed,High speed,Diffe

21、rential centrifugation,（二）密度梯度離心,用介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過離心力場的作用使細胞分層、分離。 類型：速度沉降、等密度沉降。 常用介質(zhì)：氯化銫、蔗糖、多聚蔗糖。 分離活細胞的介質(zhì)要求： 1）能產(chǎn)生密度梯度，且密度高時，粘度不高； 2）pH中性或易調(diào)為中性； 3）濃度大時滲透壓不大； 4）對細胞無毒。,CsCl 密度梯度離心分離DNA,密度梯度離心分離溶酶體、線粒體和微體,1、速度沉降 velocity sedimentation,用途：分離密度相近而大小不等的細胞或細胞器。 特點：介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密

22、度應小于被分離生物顆粒的最小密度。 原理：介質(zhì)密度梯度平緩，分離物按各自的沉降系數(shù)以不同的速度沉降而達到分離。,2.等密度沉降 isopycnic sedimentation,用途：分離密度不等的顆粒。 特點： 介質(zhì)密度較高，陡度大，介質(zhì)的最高密度應大于被分離組分的最大密度。 所需的力場通常比速率沉降法大10100倍，往往需要高速或超速離心。 原理：樣品各成分在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)過一定時間的離心則沉降到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在那里達到平衡，從而將不同密度的成分分離。,Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation,二、流式細胞術,用途：對單

23、個細胞進行快速定量分析與分選的一門技術。 原理：包在鞘液中的細胞通過高頻振蕩控制的噴嘴，形成包含單個細胞的液滴，在激光束的照射下，這些細胞發(fā)出散射光和熒光，經(jīng)探測器檢測，轉(zhuǎn)換為電信號，送入計算機處理，輸出統(tǒng)計結(jié)果，并可根據(jù)這些性質(zhì)分選出高純度的細胞亞群，分離純度可達99%。包被細胞的液流稱為鞘液，所用儀器稱為流式細胞計（flow cytometer）。,當代最先進的細胞定量分析技術,三、細胞電泳,原理：在一定pH值下細胞表面帶有凈的正或負電荷，能在外加電場的作用下發(fā)生泳動。 各種細胞或處于不同生理狀態(tài)的同種細胞荷電量有所不同，故在一定的電場中的泳動速度不同 。 用途：檢測細胞生理狀態(tài)和病理狀態(tài)

24、、分離不同種類的細胞， 如分離哺乳動物的XY精子。,第三節(jié) 細胞組分的分析方法,一、細胞內(nèi)大分子物質(zhì)的顯示方法,組織化學和細胞化學染色方法（histochemical and cytochemical staining method）用于對某些細胞成分進行定性和定位研究。 （一）固定 物理固定：血膜空氣快速干燥、冷凍干燥。 化學固定：如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和鋨酸等試劑。顯示多糖常用乙醇固定，顯示酶類多用甲醛丙酮緩沖液固定。,（二）顯示方法,金屬沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反應產(chǎn)物最終生成CoS或PbS有色沉淀，而顯示出酶活性。 Schiff反應：細胞中的醛基可使Schiff試劑

25、中的無色品紅變?yōu)榧t色。用于顯示糖和脫氧核糖核酸（Feulgen反應）。 聯(lián)苯胺反應：過氧化氫酶分解H202。產(chǎn)生新生氧，后者再將無色聯(lián)苯胺氧化成聯(lián)苯胺藍，進而變成棕色化合物。 脂溶染色法：借蘇丹染料溶于脂類而使脂類顯色。 茚三酮反應：顯示蛋白質(zhì)。 6.多糖類：PAS反應黃色,Feulgen反應,二、特異蛋白抗原的定位與定性,1. 免疫熒光技術 2. 免疫電鏡技術 3. 免疫印跡技術 4. 放射免疫沉淀技術,1.免疫熒光技術 根據(jù)免疫學原理，利用抗體同特定抗原專一結(jié)合，對抗原進行定位測定的技術。常用的標記物有熒光素和酶。 免疫熒光法（immunofluorescent technique）：常用

26、的螢光素有異硫氰酸熒光素、羅丹明等。 酶標免疫法（enzyme-labeled antibody method）：常用的酶有辣根過氧化物酶，酶與底物發(fā)生反應后形成不透明的沉積物，從而顯示出抗原存在的部位。,抗原,標記抗體,光原,熒光,直接法原理示意圖,間接法原理示意圖,抗原,抗體,標記抗體,光原,熒光,補體,抗體,標記抗補體抗體,光源,熒光,補體結(jié)合法原理示意圖,2.免疫電鏡技術: 免疫鐵蛋白技術 免疫酶標技術 免疫膠體金技術,三、顯微光譜分析技術,細胞中有一些成分具有特定的吸收光譜，核酸、蛋白質(zhì)、細胞色素、維生素等都有自己特征性的吸收曲線。 可利用顯微分光光度計對某些成分進行定位、定性和定量測定。,四、放射自顯影術,用于研究標記化合物在機體、組織和細胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用機理、作用部位等等。 原理：將放射性同位素標記的化合物導入生物體內(nèi)，經(jīng)過一段時間后，制取切片，涂上鹵化銀乳膠，經(jīng)放射性曝光，使乳膠感光。 一般用14C和3H標記。常用3H-TDR來顯示DNA，用3H-UDR顯示RNA；用3H氨基酸研究蛋白質(zhì)，用3H甘露糖、3H巖藻糖研究多糖。 14C半衰期為5730年，3H為12.5年。,放射自顯影術,五、