生物檢測技術(shù)多抗和單抗綜述

1、多克隆抗體與單克隆抗體 的制備,三、半抗原免疫原的制備,1.半抗原（hapten) ：僅有抗原性而無免疫原性的物質(zhì)低分子量的化學物質(zhì)。例如多糖、多肽、甾族激素、脂肪胺、類脂質(zhì)、核苷、某些藥物(包括抗生素）及其他化學物品等。 2.載體 (carrier)：賦予半抗原以免疫原性的物質(zhì)；蛋白質(zhì)、多肽聚合物、大聚合物；,第一節(jié) 半抗原免疫原的制備,載體類型,1.蛋白質(zhì)：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白等。,載體類型,2.多肽聚合物：人工合成的，常見的有多聚賴 氨酸，其分子量大（可達十幾萬到幾十萬)， 這種多聚物和半抗原結(jié)合后，可刺激免疫動 物產(chǎn)生高效價、高親和力的抗體。,3.

2、大聚合物：羧甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可與半抗原結(jié)合，加入弗氏完全佐劑亦 可誘發(fā)動物產(chǎn)生抗體。,物理方法：利用通過電荷和微孔吸附半抗原 吸附的載體有羧甲基纖維素 （ CMC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、硫酸葡聚糖等,3、半抗原與載體的連接方法,化學方法：利用某些功能基團將半抗原連接到載體上 帶有游離氨基或羧基以及兩種基團都有的半抗原：碳二亞胺法 戊二醛法 混和酸酐法 不帶氨基和羧基的半抗原：用化學方法使其轉(zhuǎn)變?yōu)閹в杏坞x氨基或游離羧基的衍生物，再與載體連接 - 琥珀酸酐碳二亞胺法,第二節(jié)、多克隆抗體（polyclonal antibody, PcAb） 將由多種抗原成分組成的抗原物質(zhì)，采用

3、傳統(tǒng)方法免疫接種實驗動物后采集免疫血液，分離所得到的抗血清即為多克隆抗體。,抗血清的制備是將制備好的免疫原按照一定的免疫程序接種給所選擇的動物，該動物在含有多種抗原表位的抗原刺激下，體內(nèi)多個B細胞克隆被激活并產(chǎn)生針對某一抗原多種不同表位的抗體，其混合物為多克隆抗體。,免疫血清的制備,1.免疫動物選擇 2.免疫方法 3.動物采血法 4.免疫血清的分離及保存,能作免疫接種用的動物主要是哺乳類和禽類。兔、綿羊、豚鼠、雞、山羊和馬。 1.抗原與免疫動物種屬差異越遠越好。 2.動物必須適齡、健壯、無感染。 3.動物體內(nèi)有與抗原相類似的物質(zhì)或其它原因而使該抗原對該動物免疫原性極差，則該動物不能選用。例如：

4、IgE綿羊，胰島素-家兔，酶類-山羊等。 4.抗血清的用量 5.抗血清的要求：例如，馬型抗血清用于沉淀反應(yīng)時較難掌握，因而極少應(yīng)用。,一、免疫動物選擇,常用的免疫動物,兔子（rabbit）：最常用于自制抗體，抗體量較多。（新西蘭,大耳白） 小鼠（mouse）：可用于自制抗體，但抗體量很少。（BALB/C,昆明鼠） 大鼠（rat）：可用于自制抗體，免疫過程要麻醉動物。（Wistar大鼠） 羊（sheep、goat）：常用于較大批量地生產(chǎn)抗體（商品）。 馬（horse）：常用于大批量生產(chǎn)治療用抗體（商品）。 豚鼠（guinea pig）：酶類免疫常用。,3.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐劑抗原多次注

5、射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐劑1月 抗原 混合免疫法：綜合皮下、淋巴結(jié)和靜脈,二、免疫方法,1.免疫原的注射劑量 大:0.51mg/只，小:0.10.6mg/只,2.免疫途徑：免疫反應(yīng)產(chǎn)生速度依次為靜脈 腹腔肌肉皮下皮內(nèi)淋巴結(jié)足掌,免疫間隔時間 第一次和第二次間隔1020天，三次及以后間隔710天；,采集免疫血清前，要預(yù)先測試抗體效價測定，若效價達到要 求，應(yīng)在末次免疫后一周及時采血，否則抗體效價會下降。 (1) 頸動脈采血法; 最常用的方法，家兔、山羊等動物 ； (2) 心臟采血法; 用于豚鼠、大鼠、雞等小動物，要求操作熟練， (3) 靜脈采血法;家兔可用耳中央靜脈，山羊可用頸靜脈；,三

6、、動物采血法,四、免疫血清的分離和保存,1、 收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4下，過夜（切勿冰凍）析出血清，離心，4000rpm,10min。 2、 56 30min滅活在無菌條件，吸出血清，分裝（0.050.2ml）；,1.4保存：可保存36個月 2.低溫保存：-20-40，可保存23年 3.冰凍干燥保存：可保存35年,四、免疫血清的分離和保存,多抗的純化與鑒定,抗原免疫動物制備的抗血清是成分復雜的混合物，除含有特異性抗體外，還存在與目的抗體不相關(guān)的成分。純化目的是除去這些不相關(guān)成分，防止抗血清中其他雜抗體干擾試驗結(jié)果。,鹽析法（硫酸銨沉淀) 辛酸-硫酸銨沉淀法 離子交換法 親和層

7、析法 凝膠過濾法,1、鹽析法（硫酸銨沉淀),原理 在高濃度中性鹽存在下，蛋白質(zhì)在水中的溶解度降低而產(chǎn)生沉淀； 硫酸銨是最常用的中性鹽; 不同蛋白質(zhì)的鹽析常數(shù)不同; 硫酸銨的加入量通常以飽和度表示; (100%飽和度:767g/L),主要步驟 在血清或腹水中加入硫酸銨使抗體沉淀； 4高速離心,棄上清,溶解沉淀； 可反復操作,逐級降低硫酸銨的濃度: 50%飽和度: 0.313g/ml 45%飽和度: 0.277g/ml 40%飽和度: 0.243g/ml 最后一次離心后,用少量PBS溶解沉淀,透析,測定濃度。,特點 成本低，步驟簡單。 抗體的回收率比較高。 抗體純度比較低，電泳后可見到明顯的雜帶,

8、不適合于做各種標記。 需要高速離心機。,2、正辛酸-硫酸銨沉淀法,原理 兩步沉淀： 先加正辛酸去雜蛋白: 正辛酸是一種有機酸,在酸性條件下(pH4.5)可使大分子的雜蛋白沉淀. 后加硫酸銨使抗體沉淀。,主要步驟： 血清濾紙過濾去沉淀和脂質(zhì)，濾液用4倍體積60mmo1/ L醋酸緩沖液(pH4.0)稀釋后，用Na0H調(diào)，PH值至4.5。 逐滴加入辛酸(終濃度25u1/ml)，室溫h攪拌30分鐘后，以6000-8000r/min.離心30分鐘，收集上清液。 上清液經(jīng)濾紙過濾2次，將濾液與10*PBS(0.lmol/L，pH7.4按10:1比例混合，調(diào)pH至7.4,置冰浴冷至40度。 每毫升上述混合液

9、加0.2778固體硫酸錢，40度攪拌30分鐘，以4000-6000r/min離心巧一20分鐘，將沉淀溶于少量YBS，透析，測蛋白含量，凍存。,特點 成本較低，步驟較復雜。 抗體回收率很低。 抗體純度高，電泳后雜帶很少，適合于各種標記。 需要高速離心機，耐高速離心的玻璃離心管。,3、離子交換法,原理 利用溶液中各種帶電粒子與離子交換劑之間結(jié)合力的差異進行物質(zhì)分離； DEAE是一種陰離子交換劑，自身帶正電荷 (Diethylaminoethyl,二乙氨基乙基)； 將樣品的pH值調(diào)至等電點以上,使樣品帶負電荷； 采用鹽溶液洗脫,通過高濃度的帶同種電荷的離子(Cl-)置換被分離的組分。,+,+,+,+

10、,+,- - - - - - - -,帶負電荷 的被吸附上,帶負電荷少 的先被置換,帶負電荷多 的后被置換,NaCl Tris 梯度混合儀,連續(xù)梯度洗脫:,階段洗脫:,T,離子強度,蛋白濃度,T,倒入一定濃度的NaCl溶液,通過離心來分離,主要步驟 先用硫酸銨沉淀抗體，粗提； 將樣品過柱； 洗去沒有結(jié)合的物質(zhì)； 用梯度NaCl溶液洗脫，等量收集洗脫液； 紫外分光光度計測量，保留A280值明顯升高的樣品； 匯集樣品，濃縮，測定濃度。,圖3 在DEAE-纖維素上人血清蛋白的層析示意圖 (M=IgM, G=IgG, A=IgA),特點 成本較低，步驟較簡單。 抗體回收率較高。 抗體純度較高，電泳后可

11、見少量雜帶，適合于各種標記。 純化后抗體體積大，需要濃縮。 需要冷柜，自動收集器。,4、親和層析法,原理 利用蛋白質(zhì)之間的特異性結(jié)合 （抗體-抗原，受體-配體） 將一種配基與凝膠顆粒結(jié)合,捕捉與它相配的物質(zhì)。 洗脫一般采用改變pH值的方法,使用前,樣品結(jié)合(Binding),洗脫(Elution),主要步驟 將Protein A與活化的柱子相結(jié)合(買商品柱)； 將腹水或血清處理后過柱； 用結(jié)合緩沖液洗柱子，直到A280值為零； 用甘氨酸緩沖液洗脫抗體，等量收集洗脫液； 測定洗脫液的A280值，保留A280值明顯升高的樣品； 匯集樣品，濃縮，測定濃度。,葡萄球菌A蛋白 (staphylococc

12、al protein A,SPA) 金黃色葡萄球菌細胞壁上的一種蛋白 分子量42000,等電點pH5.1 可與大多數(shù)動物Ig的Fc段結(jié)合 一個SPA分子有4個相似的活性部位 與IgG的結(jié)合最強,與IgM, IgA的結(jié)合較差,特點 成本高，步驟較簡單。 抗體回收率低。 抗體純度高，適合于各種標記。 純化后抗體體積大，需要濃縮。 需要自動收集器。,5、凝膠過濾法(分子篩),原理 將樣品混合物通過一定孔徑的凝膠介質(zhì),由于流經(jīng)路徑的差異,使不同分子質(zhì)量的組分分離. 大分子物質(zhì)直接從凝膠顆粒外通過，走得快；小 分子物質(zhì)進入凝膠顆粒的內(nèi)部再出來，走得慢。 適合于IgM類抗體的純化 (五聚體,分子量約800

13、KD),主要步驟 將腹水或血清處理后上柱,樣品要濃； (可用G-200，柱子要長，80-100cm) 待樣品入柱后,用緩沖液過柱； 等量收集洗脫液,測定洗脫液的A280值。 收集第一峰。,凝膠過濾法純化抗體,血清蛋白的分級分離常用凝膠過濾法進行，按分子大小可分為三組： 第一組包括IgM和一些脂蛋白； 第二組主要是IgG和較少量的IgA、IgD、IgE等球蛋白； 第三組主要白蛋白、血清粘蛋白、鐵傳遞蛋白等。,在凝膠過濾柱上血清蛋白的層析示意圖 (M=IgM, G=IgG, A=IgA),特點 成本高，步驟較簡單。 抗體回收率較高，分離條件緩和，抗體活性不受影響。 抗體純度較高。 需要自動收集器。

14、,1.抗體效價的鑒定：即為抗體活性滴定,特異性抗體的鑒定,2.抗體特異性鑒定： 細菌類抗原的抗體用凝集試驗 可溶性抗原的抗體用雙向瓊脂擴散試驗,3.抗體的純度鑒定：免疫電泳分析法,4.抗體親和力鑒定：親和力高則靈敏度好,第三節(jié) 單克隆抗體（monoclonal antibody, McAb）,由單個B細胞增殖所產(chǎn)生的抗體，其遺傳背景完全一致，因此，抗體分子的氨基酸序列、類型、抗原特異性等生物學性狀均相同。,應(yīng)用： 高效治療劑 （抗病毒） 藥物導彈（ McAb 與毒素偶聯(lián)）（抗腫瘤）,具有高特異性、高純度、效價高等優(yōu)點。,McAb and PcAb,淋巴細胞雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體：,該技術(shù)由G

15、.Kohler、C.Milstein于1975年創(chuàng)建，1984年獲諾貝爾獎。,免疫B淋巴細胞 骨髓瘤細胞 （可分泌McAb ， （在體外能長期繁殖） 在體外不能長期繁殖） 細胞融合 雜交瘤細胞 （分泌McAb ，長期繁殖） 生長繁殖 產(chǎn)生McAb,雜交瘤技術(shù)原理： 聚乙二醇（PEG）：細胞融合劑，使免疫的小鼠脾細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合 HAT培養(yǎng)基的選擇培養(yǎng)：反復的免疫學檢測篩選克隆化增殖的雜交瘤細胞系 單克隆抗體生成：接種雜交瘤細胞于小鼠腹腔，腹水中即可得到高效價的單克隆抗體,流 程,雜交瘤技術(shù)的原理及流程,動 物： BALB/c小鼠 712周齡 20g25g體重,動物免疫,細胞性抗原： （

16、12）107/只，不加佐劑，23周重復一次 可溶性抗原： 首次，完全福氏佐劑+100微克抗原，36周100200微克抗原，融合前3天，加強免疫,免疫方法,B淋巴細胞的分離,免疫脾細胞的制備： 1108的淋巴細胞 無菌手術(shù)制備；,常用的小鼠骨髓瘤細胞株為SP20、NS1； 不產(chǎn)生Ig的重鏈和輕鏈 HGPRT-;TK-;次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、胸腺嘧啶核苷激酶； 與提供淋巴細胞的動物品系相同,骨髓瘤細胞,培養(yǎng)骨髓瘤細胞 選擇對數(shù)生長期的細胞進行傳代培養(yǎng),細胞形態(tài)：渾圓、透亮、均一、排列整齊 避免細胞返祖：定期用8-氮鳥嘌呤 （8-AG）處理細胞。注意事項：切忌過多傳代培養(yǎng)，可將細胞分裝凍存于

17、-80或液氮及干冰中,細胞融合劑： PEG:分子量4000 的PEG是最常用的細胞融合劑； 作用機理：誘導細胞膜上脂類物質(zhì)結(jié)構(gòu)重排，使細胞膜易打開而有助于細胞融合； 作用特點：隨機發(fā)生的，不同廠商、批號、分子量的PEG，其純度與毒性有所不同； 常用培養(yǎng)液：RPM1640或DMEM培養(yǎng)液；,細胞融合,骨髓瘤細胞與B細胞(1:3) 50% PEG 1min內(nèi)加完; 2min內(nèi)加10ml培養(yǎng)液,細胞融合,1ml 50%的PEG（無菌，預(yù)溫37）在1分鐘內(nèi)滴完,靜置90秒,時間一到,將事先準備的培養(yǎng)液一滴一滴加入,停止PEG作用；根據(jù)細胞數(shù)量加入HAT培養(yǎng)基，使之分加到96孔板中時每孔細胞數(shù)為（0.5

18、1.5）105個。融合后7天，換用HT培養(yǎng)液。,細胞融合,致敏淋巴細胞,骨髓瘤細胞,離心 1000rpm 10min,50%PEG 1ml,培養(yǎng)液 10ml,離心 1000rpm 7min,37。C搖動、由慢漸快1min、靜止1.5min,加入HAT培養(yǎng)液懸浮細胞，置于培養(yǎng)孔內(nèi),。,飼養(yǎng)細胞,1020天出現(xiàn)克隆 HAT篩選 挑克隆,融合細胞的早期培養(yǎng),雜交瘤細胞的選擇性培養(yǎng),HAT培養(yǎng)基： H（Hypoxanthine）:次黃嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；葉酸拮抗物，阻斷DNA合成主要途徑 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前體”，供細胞通過替代途徑合成DNA,B

19、淋巴細胞:壽命短,分泌特異系性抗體 骨髓瘤細胞：壽命長 雜交瘤細胞：壽命長，單克隆抗體,HAT選擇作用： 淋巴細胞：不能生長，57天死亡； 骨髓瘤細胞：不能生長，57天死亡；DNA合成的主要途徑被A阻斷;HGPRT缺乏，DNA合成的替代途徑受阻。,雜交瘤細胞： 從淋巴細胞獲得產(chǎn)生某種抗體的遺傳信息； 從骨髓瘤細胞獲得不斷繁殖的能力； 利用淋巴細胞的HGPRT，將H合成為嘌呤堿并最終與T一起合成DNA, 可長期生長繁殖；,隨機融合后的細胞類型,細胞組合 HGPRT 生長狀態(tài) 淋巴細胞 + 骨髓瘤 + 長期生長 淋巴細胞 + 淋巴細胞 + 短期生長 骨髓瘤 + 骨髓瘤 不能生長 未融合淋巴細胞 +

20、 短期生長 未融合骨髓瘤 不能生長,有限稀釋法(limiting dilution) 顯微操作法(micromanipulation) FACS法（fluorescence activated cell sorter） 軟瓊脂平板法(soft agar method),陽性雜交瘤細胞的克隆化培養(yǎng)與凍存,特點： 不需任何特殊設(shè)備 克隆出現(xiàn)效率高 實驗室常用方法 方法： 細胞懸液通過系列稀釋 每個培養(yǎng)孔含0.51個細胞,有限稀釋法,配制方案：雜交瘤細胞（15）x106/ml) + 細胞凍存液(30%40% 牛血清，50%60% RPMI-1640培養(yǎng)液，10%DMSO ) “慢凍”：分步冷凍，30-70液氮 “快融”：取出立即浸入3740水浴中，使其迅速融化、復蘇,雜交瘤細胞的凍存與復蘇,防止污染 避免染色體丟失 防止非分泌細胞的過度生長 防止細胞密度過高而死亡,細胞冷凍的意義,單克隆抗體的制備,經(jīng)過反復克隆化獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株應(yīng)立即擴大培養(yǎng)（除及時凍存的細胞外）。因多次傳代易引起染色體逐漸丟失而使細胞產(chǎn)生抗體能力逐漸減弱甚至消失，還應(yīng)盡早使用獲得的抗體陽性雜交瘤細胞株制