從業(yè)人員健康體檢沙門氏菌、志賀氏菌檢測操作程序(討論稿)

1、從業(yè)人員健康體檢沙門氏菌、志賀氏菌檢測操作程序一、目的本程序用于對從業(yè)人員健康體檢進(jìn)行沙門氏菌、志賀氏菌檢測等致病菌檢測 的方法，以規(guī)范操作程序，保證檢測數(shù)據(jù)的有效性。二、適用范圍：本方法適用于從人體糞便中沙沙門氏菌、志賀氏菌的分離、鑒定及保存的梯相關(guān)操作。三、生物安全要求標(biāo)本及相應(yīng)的致病菌操作必須在BSL-2生物安全實(shí)驗(yàn)室的生物安全柜中進(jìn)行。四、試劑及儀器設(shè)備4.1試劑采便盒、Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基、亞硒酸增菌液（SF）、改良亞硒酸鹽磺綠增菌肉湯（SBG）、沙門志賀培養(yǎng)液、木糖-賴氨酸-脫氧膽酸瓊脂（XLD）、麥康凱瓊脂、沙門顯色培養(yǎng)基、結(jié)晶紫沙門培養(yǎng)基（YS）、三糖鐵（TSI）、動

2、力-吲哚-尿素培養(yǎng)基（MIU）、沙門氏菌屬診斷血清、志賀氏菌屬診斷血清、API20E生化試劑條、磁珠菌種保存管4.2 儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、微生物鑒定儀五、采樣方法5.1 標(biāo)本應(yīng)為新鮮的或轉(zhuǎn)移至Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便或肛拭子，最優(yōu)標(biāo)本是轉(zhuǎn)移到Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子。肛拭子不是最佳標(biāo)本，僅在病人無糞便標(biāo)本時(shí)采用。5.2 糞便標(biāo)本：應(yīng)采集自然排出的新鮮糞便，取稀水樣、粘血樣、膿血樣，黏液樣部分。盛于清潔、干燥、無吸水性的無菌容器，避免混入尿液、水和其他物質(zhì)。5.3肛拭標(biāo)本 ：若無法獲得糞便（如排便困難或嬰幼兒），也可以采用肛拭子，即無菌棉拭子用生理鹽水濕潤后，插入肛門

3、內(nèi)4-5cm處兒童約2-3cm），同一方向輕輕旋轉(zhuǎn)2-3周。以目測能見到糞便為準(zhǔn)。插入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基。5.4 標(biāo)本采集后立即送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測，若室溫保存，不能超過1h；如不能立即送檢，應(yīng)放入Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基中冷藏條件下24小時(shí)內(nèi)送檢。六、檢驗(yàn)程序糞便標(biāo)本或肛子XLD或麥康凱SBG增菌XLD或顯色平板可疑菌落接種TSI和MIU生化符合者做血清凝集和系統(tǒng)生化反應(yīng)菌株保存管保存菌株上送可疑菌落接種TSI和MIU生化符合者做血清凝集和系統(tǒng)生化反應(yīng)七、操作步驟 7.1 分別標(biāo)記一個(gè)XLD平板（或YS平板、麥康凱平板）和1管9ml改良亞硒酸鹽磺綠增菌肉湯（SBG）（或SF增

4、菌液或沙門志賀培養(yǎng)液）。 7.2 用1個(gè)無菌拭子取少量標(biāo)本（不要使拭子 粘得太多，盡量從可見血或黏液的部位收集）接種在XLD平板的第一區(qū)，接著把拭子放入SBG增菌液。再滅菌接種環(huán)在XLD平板的其余區(qū)進(jìn)行劃線接種。如果是Cary-Blair運(yùn)送培養(yǎng)基的糞便拭子，則輕攪混合標(biāo)本后接種增菌液與平板。 7.3 所有培養(yǎng)基均放入361培養(yǎng)，SBG的最佳增菌時(shí)間是1618h（建議每天下午45時(shí)接種標(biāo)本，第二天早上810時(shí)用增菌液劃平板）。 7.4 觀察平板：取培養(yǎng)后的平板，觀察有無可疑菌落。 7.4.1 XLD平板可疑菌落觀察：志賀菌在XLD平板上為粉紅或無色、透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形菌落，直徑1

5、-2mm，而大部分的大腸桿菌類的菌落為黃色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則，直徑2-3mm。大多數(shù)沙門菌在XLD平板上中心黑色的透明、光滑、濕潤、邊緣整齊、圓形的菌落。（圖2） 7.4.YS平板可疑菌落觀察：7.4.麥康凱平板可疑菌落觀察：志賀菌在麥康凱平板上為無色至淺粉色、半透明、光滑、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則、圓形菌落，直徑2-3mm；大多數(shù)沙門菌為無色菌落，粉紅色，帶或不帶黑心，傷寒沙門菌為無色菌落；而大部分的大腸桿菌類的菌落為粉紅或紅色、混濁、凸起、濕潤、邊緣整齊或不規(guī)則，直徑3-4mm。7.4. SBG肉湯增菌：SBG增菌1618小時(shí)后，劃線接種XLE平板或沙門顯色平板，放入361

6、培養(yǎng)1824h。沙門顯色平板可疑菌落觀察：典型的沙門菌在沙門顯色平板上為紫色的菌落，直徑2-3mm。7.4.4 建議的初步篩查方案（初步生化特征見表1）：表沙門菌、傷寒沙門菌、志賀菌及常見腸道菌的初步生化特征大部分沙門菌傷 寒 沙門菌志 賀 氏 菌大 腸 桿 菌枸櫞酸 桿菌變 形 桿 菌TSI（斜面）K（紅色）K（紅色）K（紅色）A（黃色）A（黃色）K（紅色）TSI（底面）A（黃色）A（黃色）A（黃色）A（黃色）A（黃色）A（黃色）TSI（H2S）+（黑色）小部分-+（黑色）+（黑色）TSI（產(chǎn)氣）+（氣泡）-+（氣泡）+（氣泡）+（氣泡）MIU（動力）+（彌漫生長）+（彌漫生長）-（沿接種線

7、生長）+（彌漫生長）+（彌漫生長）+（彌漫生長）MIU（吲哚）-（黃色圓環(huán)）-（黃色圓環(huán)）-（黃色圓環(huán)）+（加試劑變紅色）+（加試劑變紅色）-（黃色圓環(huán)）MIU（尿素）-（黃色）-（黃色）-（黃色）-（黃色）-（黃色）+（紅色）A：糞便（或肛拭子）SBG或SF增菌 XLD分離 接種TSI和MIUB：糞便（或肛拭子）SBG或SF增菌 YS分離 接種TSI和MIUC：糞便（或肛拭子）SBG或SF增菌 XLD和麥康凱分離 接種TSI和MIUD：糞便（或肛拭子）SBG或SF增菌 YS和沙門顯色分離 接種TSI和MIUE：糞便（或肛拭子）SBG或SF增菌 XLD和沙門顯色分離 接種TSI和MIU7.5

8、生化初步鑒定每個(gè)平板挑取35個(gè)分離較好的單個(gè)可疑菌落，分別接種到三糖鐵（TSI）和動力-吲哚-尿素培養(yǎng)基（MIU），361培養(yǎng)1824h。沙門菌和志賀菌的生化特征見表2。7.6 系統(tǒng)生化試驗(yàn)沙門菌和志賀菌初步鑒定陽性菌經(jīng)轉(zhuǎn)種營養(yǎng)瓊脂單，取單個(gè)菌落進(jìn)行系統(tǒng)生化鑒定（可以使用APE20E或全自動生化鑒定系統(tǒng)進(jìn)行）。7.7血清學(xué)試驗(yàn)7.7.1 志賀菌血清學(xué)試驗(yàn)7.7.1.1挑取生化反應(yīng)實(shí)篩符合志賀菌的營養(yǎng)瓊脂斜面，首先用四種多價(jià)血清做玻片凝集反應(yīng)(4種多價(jià)包括：A群1、2型；B群和D群)。凝集者則用B群多價(jià)、D群和A1、A2、血清分別凝集。7.7.1.2若多價(jià)血清不凝集，可能為C群或A群的312型，

9、應(yīng)進(jìn)行C群的四種多價(jià)和A群另三種多價(jià)血清做玻片凝集。7.7.2 沙門菌血清學(xué)試驗(yàn)7.7.2.1挑取生化反應(yīng)實(shí)篩符合沙門菌的營養(yǎng)瓊脂斜面，首先用A-F群O多價(jià)血清做玻片凝集反應(yīng)。7.7.2.2若凝集可按常見O因子檢出頻率，按照O4O10O9O7O8O19O2O11順序凝集。7.7.2.3 H抗原凝集7.7.3 所有凝集陽性的菌落，都要同時(shí)用生理鹽水做凝集試驗(yàn)，只有不出現(xiàn)自凝時(shí)，才可以報(bào)告陽性結(jié)果。8 結(jié)果報(bào)告 8.1 在初步生化鑒定符合后，可以先將可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色，最后綜合生化及血清學(xué)結(jié)果，可以報(bào)告檢出（或未檢出）沙門菌（或志賀菌）。8.2對于從業(yè)人員體檢結(jié)果已經(jīng)納入檢驗(yàn)軟件管理的單位，可以直接在檢驗(yàn)軟件中錄入相應(yīng)結(jié)果。8.3 其他單位可以設(shè)計(jì)專門的報(bào)告格式反饋給送檢單位或送檢科室，檢驗(yàn)報(bào)告中應(yīng)至少包括姓名，性別，年齡，體檢編號，檢測結(jié)果。8.4 檢測結(jié)果為陰性，可以報(bào)告為未檢出腸道沙門菌和志賀菌；檢測結(jié)果為陽