核酸檢測基本知識

1、核酸檢測基本知識1.什么是核酸檢測核酸的定義：核酸是由核苷酸或脫氧核苷酸通過3，5-磷酸二酯鍵連接而成的一類生物大分子。核酸具有非常重要的生物功能，主要是貯存遺傳信息和傳遞遺傳信息。2.核酸的分類核酸大分子可分為兩類：脫氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。3.核酸的組成DNA和RNA都是由一個(gè)一個(gè)核苷酸(nucleotide)頭尾相連而形成的，由C、H、O、N、P，5種元素組成。DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳物質(zhì)，RNA是少數(shù)不含DNA的病毒（如HIV病毒，流感病毒，SARS病毒等）的遺傳物質(zhì)。RNA平均長度大約為2000個(gè)核苷酸，而人的DNA卻是很長的，約有3X109個(gè)核苷酸。4.核酸的功

2、能在蛋白質(zhì)的復(fù)制和合成中起著儲存和傳遞遺傳信息的作用。核酸不僅是基本的遺傳物質(zhì)，而且在蛋白質(zhì)的生物合成上也占重要位置，因而在生長、遺傳、變異等一系列重大生命現(xiàn)象中起決定性的作用。DNA與RNA都是核酸，它們在化學(xué)組成上有什么區(qū)別如下：DNA與RNA的比較DNARNA主要存在部位細(xì)胞核細(xì)胞質(zhì)基本組成單位脫氧核苷酸核糖核苷酸堿基種類A、G、C、TA、G、C、U五碳糖種類脫氧核糖核糖核苷酸鏈兩條脫氧核苷酸鏈一條核糖核苷酸鏈5.檢測方法核酸檢測方法，主要通過同時(shí)進(jìn)行靶核酸擴(kuò)增和可檢測信號的生成來檢測樣品中的靶核酸?？蓱?yīng)用于臨床微生物學(xué)、血液篩選、遺傳病診斷和預(yù)防、法醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的核酸檢測。目前主要使用的

3、方法有以下幾種：a.核酸序列依賴性擴(kuò)增法NASBA是由一對引物介導(dǎo)的、連續(xù)均一的、體外特異性核苷酸序列等溫?cái)U(kuò)增RNA的新技術(shù)。反應(yīng)在42進(jìn)行,可在2h內(nèi)將RNA模板擴(kuò)增約109倍。NASBA原理是提取病毒RNA,加入AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶和引物進(jìn)行擴(kuò)增。整個(gè)反應(yīng)分非循環(huán)相和循環(huán)相:在非循環(huán)相中,引物I與模板RNA退火后在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA,形成RNA:DNA雜合體,隨即RNaseH降解RNA,引物與cDNA退火,在反轉(zhuǎn)錄酶作用下合成第2條DNA互補(bǔ)鏈。雙鏈DNA可在T7RNA聚合酶的作用下,經(jīng)其啟動(dòng)子序列起動(dòng)而轉(zhuǎn)錄RNA，RNA又可在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下反轉(zhuǎn)錄

4、成DNA，進(jìn)入循環(huán)相,對模板進(jìn)行大量擴(kuò)增。b.轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增技術(shù)TMA技術(shù)原理與NASBA基本一致，略有不同之處是TMA利用的是MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶及T7RNA聚合酶兩種酶，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶既有逆轉(zhuǎn)錄酶的活性又具有RNA酶H活性。反應(yīng)在41.5進(jìn)行,可在1h內(nèi)將RNA模板擴(kuò)增約109倍。c.連接酶酶促鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)LCR是基于靶分子依賴的寡核苷酸探針相互連接的一種探針擴(kuò)增技術(shù)，是繼PCR后新發(fā)展的一種較有前景的體外擴(kuò)增技術(shù)。它的原理就是由2段寡核苷酸單鏈DNA探針與目標(biāo)序列雜交,當(dāng)該2段DNA探針與沒有發(fā)生突變的模板褪火后,如果2探針是緊鄰的,中間沒有核苷酸間隔,則可在連接酶作用下連接起來,連

5、接以后的新鏈又可以作為模板,引導(dǎo)下一周期的連接產(chǎn)生新的子鏈。若連接區(qū)段發(fā)生核苷酸的堿基突變,則連接反應(yīng)不能發(fā)生,擴(kuò)增反應(yīng)終止。d.多聚酶鏈反應(yīng)檢測法(PCR)PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備。模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合。引物的延伸：DNA模板引物結(jié)

6、合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成1條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性退火延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成1個(gè)循環(huán)需24min，23h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍。檢測HIVRNA,需要先利用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，繼而以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可，這樣的反應(yīng)稱為RT-PCR。e.實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程,最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析

7、的方法。本技術(shù)的原理是使用熒光基團(tuán)標(biāo)記探針,5端標(biāo)記熒光基團(tuán)R,3端標(biāo)記淬滅基團(tuán)Q,在沒有PCR擴(kuò)增時(shí),由于熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)空間距離很近,使熒光基團(tuán)被淬滅,不發(fā)熒光;而當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí),引物與熒光標(biāo)記的特異性探針同時(shí)結(jié)合在模板上,熒光標(biāo)記的探針與模板的結(jié)合位置位于上下游引物之間,利用Taq酶的53外切酶活性,將熒光探針?biāo)?熒光基團(tuán)被釋放出來,由于在空間上與淬滅基團(tuán)分開,則發(fā)出熒光。發(fā)出的熒光可以被熒光探頭檢測到,一邊擴(kuò)增,一邊檢測,這樣就實(shí)現(xiàn)了“實(shí)時(shí)”檢測。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從半定量到定量的飛躍,而且與常規(guī)PCR相比,它具有特異性強(qiáng)、自動(dòng)化程度高、有效解決了PCR污染問題等特點(diǎn)。f.支鏈

8、DNA檢測法bDNAbDNA是定量檢測血漿中的HIV1型RNA的一種方法。bDNA是指人工合成的帶有側(cè)鏈的DNA片段,在其每個(gè)側(cè)鏈上都可以標(biāo)記被激發(fā)的標(biāo)記物。將HIV的RNA通過離心從病毒顆粒中釋放出來,然后用捕獲探針1將其捕獲到微孔中。捕獲探針2與病毒RNA的另一部分特異結(jié)合,又與預(yù)放大探針結(jié)合。后者再與放大探針即bDNA探針雜交。兩套靶探針分別與病毒RNA的pol基因的不同區(qū)域特異結(jié)合。在微孔中形成HIVRNA寡核苷酸復(fù)合物。再加入1種化學(xué)發(fā)光底物孵育后可放大化學(xué)發(fā)光信號。通過發(fā)光強(qiáng)度來定量,因?yàn)榘l(fā)光強(qiáng)度與樣品中HIVRNA含量成比例。bDNA不存在擴(kuò)增物的交叉污染,這較PCR是一大進(jìn)步。

9、bDNA有數(shù)十個(gè)覆蓋整個(gè)基因組的探針,可以方便地檢測HIV某些變異株,但靈敏度不及PCR，提高bDNA靈敏度是一大難點(diǎn)。檢測步驟HIV核酸定性檢測技術(shù)，其檢測過程分為核酸提取、逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA、PCR擴(kuò)增反應(yīng)、擴(kuò)增產(chǎn)物定性分和結(jié)果判定和完成報(bào)告單。6.實(shí)驗(yàn)室檢測具體步驟如下：a.核酸提取使用硅膠柱離心、磁性硅膠顆粒分離方法以及自動(dòng)化儀器等商品化試劑或設(shè)備并按說明書操作。提取RNA時(shí)應(yīng)注意防止RNA降解。DNA應(yīng)置于-20保存，RNA和需長期保存的DNA應(yīng)置于-80保存。b.逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無R

10、NA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴(kuò)增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。建議使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng)。逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成反應(yīng)需使用逆轉(zhuǎn)錄引物、dNTPs、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DTT、緩沖液和適量無RNA/DNA酶的超純水以及RNA模板。在擴(kuò)增儀或水浴箱中，在規(guī)定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用商品化RT-PCR一步法試劑進(jìn)行第一輪擴(kuò)增反應(yīng)。c.PCR擴(kuò)增反應(yīng)（使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法）PCR反應(yīng)需使用引物、dNTPs、DNA聚合酶（如Taq酶等）、緩沖液、和適量無RNA/DNA酶超純水、以及模板（DNA或cDNA）。在擴(kuò)增儀中，按照設(shè)定的程序進(jìn)行擴(kuò)增。使用二次擴(kuò)增的套式PCR擴(kuò)增方法。e.擴(kuò)增產(chǎn)物定性分析擴(kuò)增產(chǎn)物常用分析方法是瓊脂糖凝膠電泳法，與分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，判斷擴(kuò)增片段是否在預(yù)期的分子量范圍內(nèi)。其它擴(kuò)增產(chǎn)物分析方法還有限制性內(nèi)切酶酶切分析、特異性探針雜交分析以及DNA序列分析等。自動(dòng)化核酸擴(kuò)增儀使用酶聯(lián)比色分析或熒光探針雜交等原理測定。f.結(jié)果判定和完成報(bào)告單（1）實(shí)驗(yàn)成立的條件：每一次檢測需同時(shí)做兩個(gè)陽性對照、兩個(gè)陰性對照，只有陽性對照擴(kuò)增出預(yù)期的片段、陰性對照沒有擴(kuò)增出任何片段、雙份