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1、第三章 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué),第三章 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué),DNA,mRNA,蛋白質(zhì),轉(zhuǎn)錄,翻譯,基因,蛋白質(zhì),細胞特異性基因表達,生理狀態(tài),蛋白質(zhì)相互作用,溫度,應(yīng)激狀態(tài),培養(yǎng)條件,藥物作用,數(shù)量有限,結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,復(fù)雜性,多變性,直接反應(yīng)生命現(xiàn)象,復(fù)雜的調(diào)控,第三章 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué),第一節(jié) 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義,第二節(jié) 蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點的分離與分析,第三節(jié) 蛋白質(zhì)相互作用的研究,第四節(jié) 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫及其應(yīng)用,第一節(jié) 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義,第一節(jié) 蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義,蛋白質(zhì)組 protein + genome proteome 一種基因組所表達的全套蛋白質(zhì) 一個細胞

2、或一個機體的基因所表達的全部蛋白質(zhì),蛋白質(zhì)組學(xué) 旨在闡明生物體全部蛋白質(zhì)的表達模式與功能模式 從整體的角度分析、鑒定細胞內(nèi)動態(tài)變化的蛋白質(zhì)的組成、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、表達水平與修飾狀態(tài),了解蛋白質(zhì)之間、蛋白質(zhì)與大分子之間的相互作用與聯(lián)系,揭示蛋白質(zhì)的功能與細胞生命活動的規(guī)律,一、蛋白質(zhì)組與蛋白質(zhì)組學(xué)的定義,第二節(jié) 蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點的分離與分析,一、分離純化,第二節(jié) 蛋白質(zhì)組及其質(zhì)點的分離與分析,二、分析鑒定,一、 分 離 純 化,（二）破碎細胞,（三）蛋白質(zhì)混合物的分離方法,（四）蛋白質(zhì)分離純化的條件,（一）選擇材料,所含目的蛋白質(zhì)含量 材料易得,一、分 離 純 化,（一）選擇材料,一、分 離 純 化

3、,（二）破碎細胞,機械法 物理法 化學(xué)法,根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度、分子大小及形狀、電離性 質(zhì)、生物學(xué)功能的差異進行： 1、根據(jù)溶解度 2、根據(jù)分子量 透析和超濾 平衡離心 凝膠過濾層析,（三）蛋白質(zhì)混合物的分離方法,一、分 離 純 化,3 、根據(jù)電荷 毛細管電泳 離子交換層析,一、分 離 純 化,4 、根據(jù)蛋白質(zhì)的親和能力 親和層析,（四） 蛋白質(zhì)分離純化的條件,緩沖液 鹽、金屬離子和螯合劑 還原劑 去垢劑 蛋白酶抑制劑 表面效應(yīng) 蛋白質(zhì)的環(huán)境因素 溫度 儲存,一、 分 離 純 化,二、分析鑒定,（一）Western印跡技術(shù) 基本操作步驟： 蛋白樣品的制備 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移

4、蛋白質(zhì)與抗體的結(jié)合反應(yīng) 目標(biāo)蛋白質(zhì)的顯示,western 印跡基本步驟圖示,Western免疫印跡,用于測定特定蛋白質(zhì)的大小和含量, 基本原理,將經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離的蛋白組分從凝膠轉(zhuǎn)移至固相支持體上，以針對特定蛋白質(zhì)的抗體作為探針，與附著于固相支持體的靶蛋白所呈現(xiàn)的抗原表位進行特異性反應(yīng)，結(jié)合上的抗體可用二抗檢測。,常用的二抗是與辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗免疫球蛋白或A蛋白；實際應(yīng)用中常常還需要設(shè)置適當(dāng)?shù)膶φ铡?常需要內(nèi)參蛋白量化蛋白量； GAPDH、ACTIN、ALBUMIN ,將SDS-PAGE的高分辨能力與抗原抗體反應(yīng)的特 異性、敏感性相結(jié)合 (靈敏度達到ng級)

5、蛋白電泳在變性條件下進行，消除了蛋白溶解、 聚集以及與外來蛋白共沉淀等問題, 特點,免疫熒光法(immunofluorescence),主要用于檢測目的蛋白在細胞內(nèi)的定位。, 基本原理,將待檢的目的蛋白作為抗原，固定在載玻片上，先加上針對目的蛋白的抗體(第一抗體)進行反應(yīng)，再加上針對第一抗體的熒光素標(biāo)記抗體(第二抗體)進行反應(yīng)，稱作間接免疫熒光法。如果將熒光素標(biāo)記在第一抗體上，則不用再加第二抗體，稱作直接免疫熒光法。, 特點, 需要在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果； 無法檢測目的蛋白的大?。?操作簡便，但需設(shè)立必要的對照；,免疫熒光法(immunofluorescence),例 1,例 2,免疫沉淀(i

6、mmunoprecipitation)技術(shù), 將抗體加入蛋白混合溶液，使之與相應(yīng)抗原結(jié)合； 加入固定的抗體結(jié)合蛋白 (如: Protein A-瓊脂糖珠)； 經(jīng)離心后，與Protein A結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物便可沉淀 ； 將樣品變性后即可獲得游離的抗原蛋白 ；, 基本步驟, 基本原理,利用一種可離心沉淀的抗體結(jié)合蛋白(如Protein A, Protein G等)，將抗原-抗體復(fù)合物從蛋白混合溶液中分離，進行定量或定性研究。,為方便后續(xù)分析，在免疫沉淀前，常會對抗原進行標(biāo)記。,免疫共沉淀 (co-IP)技術(shù),基于與蛋白質(zhì)X的生理性相互作用，如果用蛋白X的抗體免疫沉淀X，則蛋白質(zhì)Y也可能沉淀下

7、來。Y的這種免疫沉淀被稱為免疫共沉淀(co-immunocipitation, Co-IP)，此法最常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)在體內(nèi)的結(jié)合。,Y,裂解細胞 免疫共沉淀蛋白質(zhì)X,（二）二維凝膠電泳（2-DE),是目前蛋白質(zhì)組研究中最有效的分析鑒定技術(shù)之一 由兩相組成： 第一相：等電聚焦凝膠電泳 根據(jù)蛋白質(zhì)電荷差異 第二相：SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 根據(jù)蛋白質(zhì)分子量差異,二、分析鑒定,二維雙向電泳(2D electrophoresis), 基本原理,基于等電點與分子量分離蛋白質(zhì),IEF-focused proteins,SDS-charged proteins in IPG strip,SDS-ch

8、arged proteins resolved according to sizes in SDS-PAGE gel,2-DE原理示意圖,二、分析鑒定,2-DE分析的基本步驟,蛋白質(zhì) 溶解 變性 還原 去除蛋白 質(zhì)雜志,利用不同 pK固定化 電解質(zhì)可 配置不同 pH范圍的 凝膠或利 用商業(yè)化 軟件設(shè)計,第一相電泳： IPGIFE 平衡 第二相電泳： SDSPAGE,考馬斯亮 藍染色、 銀染色、 銅染色,樣品制備,IPG膠制備,雙相電泳,染色,二、分析鑒定,2-DE獲得的蛋白質(zhì)圖譜,二、分析鑒定,優(yōu)點：可以同時直觀顯示數(shù)千個蛋白質(zhì)點； 缺點：耗時，耗力，目前無法自動化；難以分離疏水、具極端分子量

9、 或等電點的蛋白質(zhì)（如膜受體蛋白、組蛋白等）。,二維雙向電泳(2D electrophoresis),silver staining (3000 spots),蛋白質(zhì)染色,考馬斯亮藍染色 銀染：靈敏度高；“雪崩”效應(yīng)；末端封閉 銅染,通過2-DE得到的蛋白質(zhì)分離圖譜，需要經(jīng)過攝像或掃描轉(zhuǎn)換為以像素為基礎(chǔ)的、具有不同灰度強弱和一定邊界方向的斑點電腦信號。,(三)圖像分析技術(shù),二、分析鑒定,2-DE圖像分析軟件包操作過程：,圖像采集,斑點檢測,背景消減,獲得蛋白質(zhì)相關(guān)信息,圖像內(nèi)及圖像間的比較,二、分析鑒定,放射性核素標(biāo)記親和標(biāo)簽法,正常細胞 D0親和標(biāo)簽,病理細胞 D8親和標(biāo)簽,混合并消化,生物

10、素親和純化,液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析,測量兩個不同樣品中蛋白質(zhì)的相對豐度,二、分析鑒定,蛋白芯片(protein chip)技術(shù),將一系列“誘餌”蛋白以陣列方式固定在經(jīng)過特殊處理的底板上，然后將其與待分析的樣品雜交，只有那些和“誘餌”結(jié)合的蛋白才被保留在芯片上。其實質(zhì)是酶聯(lián)免疫吸附測定。,基于蛋白質(zhì)表面化學(xué)及質(zhì)譜檢測的高通量蛋白質(zhì)分析技術(shù),蛋白芯片(protein chip)技術(shù), 基本方法, 蛋白質(zhì)的結(jié)合：未經(jīng)處理的樣品(如血清，尿液等)直接點在芯片 上，根據(jù)芯片表面不同的化學(xué)或生物特性結(jié)合相應(yīng)的蛋白質(zhì)； 清洗減少非特異性蛋白(如鹽及其它污染物)的結(jié)合； 加能量吸收分子(EAM)：EAM能有效的

11、吸收激光的能量，使樣品 分子進入氣相并得到電離； 用表面增強的激光解吸電離法(SELDI)將保留在芯片上的蛋白質(zhì) 洗脫下來； 電離的蛋白質(zhì)可以通過飛行時間質(zhì)譜儀精確地測定它們的質(zhì)量；,蛋白芯片(protein chip) 技術(shù),從未經(jīng)提純的生物或臨床樣品中直接捕獲、檢測 和分析蛋白質(zhì)不需任何標(biāo)記或加尾 超高的檢測靈敏度 (1-50 fmole的蛋白質(zhì)) 從超小樣品體積(0.5 l)到大體積(400l) 快速獲取實驗結(jié)果,蛋白芯片(protein chip) 技術(shù), ProteinChip的應(yīng)用,蛋白質(zhì)芯片,原理 樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間的質(zhì)量和 電荷比值（質(zhì)荷比，m/e）的差異確定分子

12、量。 應(yīng)用 蛋白質(zhì)的序列分析 研究蛋白質(zhì)的修飾,（五）質(zhì)譜技術(shù),二、分析鑒定,（六） 其它方法,Edman降解法測定蛋白質(zhì)多肽的排列順序。 核磁共振（NMR）、熒光光譜法測定溶液中蛋白質(zhì) 分子的結(jié)構(gòu)。 X射線衍射分析法、小角中子衍射法測定晶體蛋白 質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)等。,二、分析鑒定,第三節(jié)蛋白質(zhì)相互作用的研究,二、蛋白質(zhì)核酸間相互作用研究,一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì),一、蛋白質(zhì)蛋白質(zhì),（二）蛋白質(zhì)之間的相互作用力,（三）蛋白質(zhì)相互作用的研究作用,（一）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形式,（一）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的形式 1、蛋白質(zhì)亞基的聚合 2、交叉聚合 3、分子識別 4、分子的自我裝配 5、多酶復(fù)合體,一、蛋

13、白質(zhì)蛋白質(zhì),（二）蛋白質(zhì)之間的相互作用力,氫鍵 范德華力 疏水鍵 離子鍵,（三）蛋白質(zhì)相互作用的研究方法,1、酵母雙雜交系統(tǒng),2、噬菌體展示,3、生物傳感芯片質(zhì)譜,4、定點誘變技術(shù),蛋白質(zhì)親和層析 親和印跡 免疫沉淀 交聯(lián) 酵母雙雜交 噬菌體展示 生物傳感芯片質(zhì)譜 蛋白質(zhì)工程中的定點誘變技術(shù),研究方法,傳統(tǒng)技術(shù),新技術(shù),1、酵母雙雜交系統(tǒng),DNA-BD具有與報告基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)特異結(jié)合的功能，DNA-AD則具有活化轉(zhuǎn)錄的功能。,報告基因,酵母雙雜交原理示意圖,DNA-BD和DNA-AD分開時不能激活轉(zhuǎn)錄，只有當(dāng)兩者在空間上接近時，才能呈現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子的活性。 只有當(dāng)proteinX與proteinY

14、間發(fā)生相互作用時，才能激活報告基因的轉(zhuǎn)錄，而當(dāng)兩者單獨作用時均無此功能 。,酵母雙雜交原理示意圖,酵母雙雜交(yeast two hybrid), 雙雜交系統(tǒng)基本原理, 雙雜交系統(tǒng)應(yīng)用,篩選cDNA文庫中編碼域已知蛋白特異相互作用的成分。,2、噬菌體展示（phage display）,研究基因工程產(chǎn)品蛋白質(zhì)間 相互作用的方法。主要采用 抗體基因文庫的構(gòu)建及隨機 多肽基因文庫的構(gòu)建和篩選。 前者主要篩選基因工程抗體， 后者篩選隨機多肽藥物。,圖：噬菌體展示原理示意圖,3、生物傳感芯片質(zhì)譜,以表面等離子激原共振（SPR）為基礎(chǔ)的生物分子相互作用的分析技術(shù)（BIA）與MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)有機結(jié)

15、合的方法。 能定性和定量檢測蛋白質(zhì)間相互作用并對其進行鑒定。,4、蛋白質(zhì)工程中的定點誘變技術(shù),通過對蛋白質(zhì)的編碼基因進行特定位點誘變；改變蛋白質(zhì)的特定功能結(jié)構(gòu)域，然后鑒定特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)對功能的影響。 通過比較研究發(fā)現(xiàn)某些疾病相關(guān)或特異的蛋白質(zhì)，即疾病的比較蛋白質(zhì)組學(xué)。對臨床疾病診斷與藥物開發(fā)具有重要意義。,二、蛋白質(zhì)-核酸,（二）濾膜結(jié)合,（三）甲基化干擾,（四）DNase足紋,（五）核酸-蛋白質(zhì)雜交,（一）凝膠滯后試驗,二、蛋白質(zhì)-核酸,（一）凝膠滯后試驗 蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)記的核酸探針特異性結(jié)合，電泳時復(fù)合物較無蛋白結(jié)合的探針在凝膠中的泳動速度要慢，即表現(xiàn)為相對滯后。 該實驗可以評價蛋白

16、與核酸結(jié)合的特異性。,圖：凝膠滯后實驗結(jié)果示意圖,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物鑒定,延遲膠實驗 (gel retardation),蛋白質(zhì)可以與末端標(biāo)記的核酸探針結(jié)合，這種復(fù)合物較無蛋白質(zhì)結(jié)合的探針在非變性聚丙烯酰胺凝膠中的泳動速度要慢，即表現(xiàn)為相對滯后。而且根據(jù)復(fù)合物分子量的不同在凝膠中表現(xiàn)為不同的帶型，每一條帶即代表一種核酸結(jié)合蛋白。,也稱作Band shift assay或Gel shift assay等, 基本原理, 對含有特異結(jié)合位點的DNA片段進行末端標(biāo)記； 進行DNA和蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)； 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、干膠及放射自顯影；,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物鑒定, 特點,簡單、快速、具有高靈

17、敏度和高分辨率 可以在DNA片段混合物中鑒別出特定DNA結(jié)合蛋白的靶序列 可以反映結(jié)合蛋白有否不同的亞基組合、幾種不同的蛋白 之間有否相互作用以及多個蛋白競爭同一位點 通過加入競爭性抑制劑可以評價蛋白與DNA結(jié)合的特異性,DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物鑒定,（二）濾膜結(jié)合法,利用硝酸纖維素濾膜不能結(jié)合雙鏈DNA，但可與蛋白質(zhì)結(jié)合的特性，將與蛋白質(zhì)結(jié)合的DNA片段與游離DNA片段分離開。,二、蛋白質(zhì)-核酸,（三）甲基化干擾,經(jīng)甲基化修飾的DNA探針可以干擾蛋白質(zhì)的結(jié)合。將DNA甲基化后與結(jié)合蛋白進行結(jié)合反應(yīng)，只有在結(jié)合位點上未被修飾的DNA片段才能與蛋白結(jié)合。,DNA探針的末端標(biāo)記 及探針的甲基化,蛋白質(zhì)

18、與甲基化探針的結(jié)合 及DNA蛋白質(zhì) 結(jié)合探針的分離,結(jié)合物及對照探針 的化學(xué)切割,DNA片段的序列測定,甲基化干擾實驗的基本步驟,二、蛋白質(zhì)-核酸,甲基化干擾實驗 (methylation interference assay),利用硫酸二甲酯(DMS)使DNA分子中的嘌呤堿基G與A發(fā)生甲基化，被甲基化修飾的G和A，會干擾DNA結(jié)合蛋白與所在部位的DNA結(jié)合；甲基化的探針可被化學(xué)試劑哌啶特異地切割，從而得到不同分子量的DNA探針片段。而與蛋白質(zhì)結(jié)合著的DNA位點則不會被切割。, 基本原理,用特殊方法將DNA從被修飾的堿基處進行切割，并經(jīng)電泳分離，由于未結(jié)合蛋白的DNA可在隨機修飾的位點被切割，

19、而有結(jié)合蛋白的DNA在結(jié)合位點上未被修飾而不能被切割，由此可獲得蛋白質(zhì)與核酸定位結(jié)合的信息。,將待測雙鏈DNA片段中的一條單鏈的一端用放射性核素標(biāo)記 甲基化修飾DNA探針，并使之與DNA結(jié)合蛋白反應(yīng)； 按電泳遷移率將游離DNA探針和DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物分開，并回收 分別用哌啶切割后在測序聚丙烯酰胺凝膠中電泳，放射自顯影, 基本步驟,哌啶切割,DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合位點的檢測,DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合位點的檢測,DNase I足跡分析 (DNase I footprint analysis),DNA分子上的特定序列與DNA結(jié)合蛋白結(jié)合后，后者可保護該部位的DNA序列不受DNaseI的攻擊。, 基本原理,

20、基本步驟, 將待測雙鏈DNA片段中的一條單鏈的一端用放射性核素標(biāo)記； 加入待測蛋白質(zhì)，使之與末端標(biāo)記的DNA形成復(fù)合物； 加入適量的DNaseI進行部分消化，使DNA斷裂為相差一個核苷酸的不同片段； 標(biāo)本經(jīng)變性后在測序聚丙烯酰胺凝膠中電泳，放射自顯影，使之出現(xiàn)以相差一個核苷酸為梯度的DNA條帶。,也稱作DNase I 保護實驗，是體外鑒定DNA結(jié)合蛋白在DNA分子上的結(jié)合位點的實驗方法。,DNase 足紋分析是目前廣泛用于蛋白質(zhì)精確結(jié)合位點的研究方法。 原理：DNase 可以隨機水解核苷酸中的磷酸二酯鍵，將DNA切成單核苷酸，而結(jié)合有蛋白質(zhì)的DNA免于DNase的水解。,DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合位點

21、的檢測,DNA結(jié)合蛋白,有,無,DNA探針測序反應(yīng),DNase足紋分析原理示意圖,（五）核酸-蛋白質(zhì)雜交實驗,蛋白質(zhì)雜交,SDS-PAGE,TBE緩沖液中DNA蛋白質(zhì)雜交,緩慢復(fù)性、封閉、預(yù)雜交,加入同位素標(biāo)記的DNA片段作探針,多次洗膜,放射自顯影,用于鑒定蛋白質(zhì)與DNA的特異性結(jié)合和確定集合蛋白質(zhì)的分子量。 基本步驟：,蛋白質(zhì)雜交,SDS-PAGE,轉(zhuǎn)移至NC膜或Nylon膜,緩慢復(fù)性、封閉、預(yù)雜交,加入同位素標(biāo)記的DNA片段作探針,多次洗膜,二、蛋白質(zhì)-核酸,Southwestern 印跡,一種核酸-蛋白質(zhì)雜交實驗，能夠快速鑒定蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合并測算所結(jié)合蛋白的分子量。, 基本原理,待測的蛋白質(zhì)樣品經(jīng)S