第11章-動物細胞培養(yǎng)與表達制備藥用

1、皮膚燒傷，如果創(chuàng)面很小（不大于硬幣）只要保持清潔，甚至深度燒傷，也可能自愈。如果下層真皮受損面積較大，常常需要植皮。植皮需要的健康皮片。植皮需要的健康皮片，可以取自燒傷病人自身未燒傷的部位（自體植皮），也可取自其他活人或尸體（異體植皮）等。自體植皮是永久性的，取自其他人或動物的植皮是暫時性的，是在創(chuàng)面愈合過程中為保護創(chuàng)面而采取的措施，1014天后就要被身體排斥。,思考如果一個大面積燒傷的病人來說，自體皮膚有限，其他渠道的皮膚來源不足。如何才能獲得大量的自體健康皮膚？,第11章 動物細胞培養(yǎng)與表達制備藥用蛋白,下篇 動物細胞工程,本章主要內容,1. 動物細胞培養(yǎng)的概念、歷史 2. 動物細胞培養(yǎng)的

2、特點 3. 動物細胞培養(yǎng)工具與條件 4. 體外培養(yǎng)細胞生長與增殖過程 5. 細胞株與保存 6. 動物細胞小規(guī)模培養(yǎng) 7. 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng) 8. 動物細胞培養(yǎng)生物反應器 9. 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)影響因素 10. 動物細胞表達制備藥用蛋白,離體植物器官、組織或細胞,植物細胞工程常用的技術:,植物組織培養(yǎng)、植物細胞培養(yǎng) 、植物體細胞雜交,溫故而知新,細胞次生 代謝產物,植物體細胞雜交,植物細胞A,植物細胞B,去細胞壁,原生質體融合,雜種細胞,植物細胞融合,這個過程中涉及的原理是？,細胞膜的流動性 植物細胞的全能性,動物細胞培養(yǎng)過程：,動物胚胎或幼齡動物的組織、器官,細胞懸浮液,10代細胞,無限傳

3、代,單個細胞,加培養(yǎng)液,剪碎,胰蛋白酶,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,11-1 動物細胞培養(yǎng)概念與歷史,1、動物細胞培養(yǎng)（Animal cell culture）：是模擬動物體內生理環(huán)境使細胞在體外分裂增殖的一種技術。包括： 原代培養(yǎng)：動物細胞進行首次傳代前的培養(yǎng)過程。 傳代培養(yǎng)：將原代培養(yǎng)細胞繼續(xù)轉接培養(yǎng)的過程。,11-1 動物細胞培養(yǎng)概念與歷史,2、歷史： 1907年,哈里森（Harrison）采用蓋玻片覆蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法將蛙胚的神經組織培養(yǎng)在淋巴液中，存活了幾周時間，并觀察到細胞突起的生長過程，開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。 法國學者卡雷爾（Carrell）設計的卡氏培養(yǎng)瓶1923年用于培養(yǎng)雞胚

4、的心肌組織取得成功，極大推動了動物細胞培養(yǎng)技術的建立。,11-1 動物細胞培養(yǎng)概念與歷史,1951年，厄爾利（Earle）等人開發(fā)了動物細胞體外培養(yǎng)的培養(yǎng)基。伴隨著培養(yǎng)工具與培養(yǎng)基的不斷完善，動物細胞體外培養(yǎng)技術日益成熟。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,（一）動物細胞培養(yǎng)特點 1、動物細胞無細胞壁，比微生物細胞大 2、動物細胞倍增時間長，生長緩慢 3、培養(yǎng)過程需氧量少，對機械攪拌或剪切力敏感。 4、動物細胞間主要以聚集體形式存在。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,5、原代細胞培養(yǎng)繁殖50代左右即退化死亡。 6、對營養(yǎng)需求更加苛刻，除常規(guī)營養(yǎng)外還需血清等。 7、對培養(yǎng)條件或環(huán)境極其敏感。 8、容易

5、受污染。 9、大多需要貼附在固體或半固體表面才能生長。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,（二）動物細胞培養(yǎng)類型與形態(tài) 體外生長的動物細胞一般具有貼附性、細胞接觸抑制性、密度抑制性的特點。 1、類型： 貼附型細胞：大多數(shù)哺乳動物細胞必須附著在固體或半固體表面才能生長，另外也包括細胞間相互接觸。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,懸浮型細胞：與微生物、植物細胞不同，動物細胞中只有極少數(shù)細胞體外生長可在培養(yǎng)液中懸浮生長，培養(yǎng)密度高、效率高。血液白細胞、淋巴細胞、某些腫瘤細胞等屬于此類細胞。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,接觸抑制性 (Contact inhibition) 是指由于動物細胞相互接觸而抑制細

6、胞運動性的現(xiàn)象（圖）。由于這個特性，正常細胞并不會相互重疊，而是呈單層細胞生長。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,密度抑制(Density inhibition) 細胞接觸匯合成片后，細胞仍能進行增殖分裂。但是當細胞密度達到一定程度后，營養(yǎng)相對缺乏，代謝產物增多，發(fā)生密度抑制生長現(xiàn)象。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,2、貼附型細胞四種形態(tài) （1）成纖維型細胞 外形與體內成纖維細胞形狀相似，細胞大致呈梭形或不規(guī)則形，中央有圓形核，胞質向外伸出23個長短不同的突起，成群細胞呈現(xiàn)放射狀、旋渦狀等形式。多數(shù)細胞之間排列疏散，有較大的細胞間隙。除成纖維細胞外，心肌、成骨肌細胞等起源于中胚層細胞培養(yǎng)時均屬這

7、一類型。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,（2）上皮型細胞 類似上皮細胞的細胞，特點是：扁平狀，形態(tài)較為規(guī)則，細胞貼壁后呈三角形及不規(guī)則扁平的多角形，中央有扁圓形核，生長時彼此緊密連接成單層細胞。因為相互擁擠而呈現(xiàn)“鋪路石狀”。,包括：皮膚的表皮細胞、消化管與呼吸道的上皮細胞、肺泡上皮細胞、消化腺上皮細胞、血管內皮細胞等起源于內或外胚層細胞。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,（3）游走型細胞 細胞呈分散生長，一般不連接成片，胞質常伸出偽足和突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則，在器皿上生長位置不固定。此型細胞不穩(wěn)定，外形不斷變化，密度大時難以和成纖維、上皮細胞相區(qū)別。 包括單核巨噬細胞系統(tǒng)：白細

8、胞、淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞等。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,（4）多形型細胞 多形型細胞是一些形態(tài)上不規(guī)則的細胞，包括細長型胞突和多角形胞體。 多形型細胞不常見，體外培養(yǎng)呈現(xiàn)多形型細胞的細胞最常見的是神經原和神經膠質細胞。,11-2 動物細胞培養(yǎng)的特點,實際上，體外培養(yǎng)的動物細胞形態(tài)常受培養(yǎng)條件影響，呈現(xiàn)過渡形態(tài)。 影響細胞形態(tài)學特征的主要因素包括： 血清成分 培養(yǎng)基成分及添加成分 培養(yǎng)基的酸堿度 氣相環(huán)境 溫度等,11-3 動物細胞培養(yǎng)工具與條件,1、培養(yǎng)工具 多為玻璃或無毒塑料制成的： 培養(yǎng)瓶的形狀主要是適合細胞貼壁生長顯 微鏡觀察的扁平形狀。 培養(yǎng)皿 培養(yǎng)管 儀器包括：CO2培養(yǎng)

9、箱、相差顯微鏡等。 目前大多采用微載體(多孔塑料培養(yǎng)板)作為 介質培養(yǎng)貼附型細胞生長，類似懸浮培養(yǎng)效 果。,11-3 動物細胞培養(yǎng)工具與條件,另外，同微生物、植物細胞培養(yǎng)不同，動 物細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基與其他溶液不能經受高溫滅菌，多采用40nm過濾除菌（例如支原體污染。,11-3 動物細胞培養(yǎng)工具與條件,2、培養(yǎng)條件 溫度：人類和哺乳類動物細胞培養(yǎng)適宜溫度37。細胞對低溫耐受性更強， 40高溫數(shù)小時可使細胞死亡。 pH：哺乳動物細胞為7.2-7.4，耐酸不耐堿。 氣體：細胞的生長代謝離不開O2和CO2 。二氧化碳培養(yǎng)箱供應CO2 ，還可調節(jié)pH值 。 滲透壓：細胞在高滲透壓或低滲透壓溶液中會發(fā)生皺

10、縮或腫脹，甚至破裂。 BSS溶液。,11-3 動物細胞培養(yǎng)工具與條件,3、培養(yǎng)基 動物細胞對營養(yǎng)要求較高，包括必需氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽、輔酶、激素、生長因子、血清（多數(shù)情況下需加入10%的胎牛或小牛血清）等。 分類：天然、合成、無血清培養(yǎng)基三種。,（1）天然培養(yǎng)基,直接采用取自動物體液或是從組織中提取的成分做培養(yǎng)液。常用動物血清（胎牛血清、小牛血清）、組織提取液、雞胚胎汁等。 優(yōu)點：營養(yǎng)價值高，培養(yǎng)效果好 缺點：成分復雜、來源有限、成本較高 血清（serum）：纖維蛋白已被除去(如通過血凝或去纖維蛋白法)的血漿。,11-3 動物細胞培養(yǎng)工具與條件,血清的生物功能 1.提供基本營養(yǎng)

11、物質：氨基酸、維生素、無機物、脂類物質、核酸衍生物等，是細胞生長必須的物質。 2.提供激素和各種生長因子：胰島素、腎上腺皮質激素、類固醇激素（雌二醇、睪酮、孕酮）等。生長因子如成纖維細胞生長因子、表皮生長因子、血小板生長因子等。 3.提供結合蛋白：結合蛋白作用是攜帶重要的低分子量物質，如白蛋白攜帶維生素、脂肪、以及激素等，轉鐵蛋白攜帶鐵。結合蛋白在細胞代謝過程中起重要作用。,11-3 動物細胞培養(yǎng)工具與條件,血清對培養(yǎng)中的細胞起到某些保護作用： 提供促接觸和伸展因子，使細胞貼壁免受機械損傷。血清蛋白形成的粘度，可以保護細胞攪拌時免受機械損傷。 血清中含有抗蛋白酶成分，可以使用血清來終止內皮 細

12、胞、骨髓樣細胞釋放胰蛋白酶的消化作用。 血清還含有一些微量元素和離子，他們在代謝解毒中起重要作用，如硒等。,（2）合成培養(yǎng)基,優(yōu)點：成分已知，便于對培養(yǎng)條件進行控制。 缺點：無法替代天然培養(yǎng)基中一些未知成分 解決途徑合成培養(yǎng)基中添加小牛血清，彼此互補 目前常用的合成培養(yǎng)基包括：MEM、DMEM、RPMI1640、F12、M199等，具體配方參見本章附錄（P123）,（2）合成培養(yǎng)基,例如 MEM培養(yǎng)基：厄爾利（Earle）于1951年開發(fā)成功。含有少量氨基酸、維生素、谷氨酰胺以及必須的無機鹽，組成簡單。 DMEM培養(yǎng)基：由杜爾貝科（Dulbecco）等在MEM培養(yǎng)基基礎上研制而成，增加了各已有

13、成分的含量，同時又根據(jù)葡萄糖高低分為高糖型（4,500mg/L）和低糖型（1,000mg/L），高糖型適合生長較快、貼附性差的細胞（例如腫瘤細胞）培養(yǎng)。,（3）無血清培養(yǎng)基,血清培養(yǎng)基的優(yōu)點：含有豐富的利于細胞生長的成分 血清培養(yǎng)基缺點： （1）動物血清來源有限，價格高，不宜大量使用 （2）動物血清成分復雜且成分不穩(wěn)定，使生長過程不易檢測控制。 （3）雖然血清對細胞生長有效，但會對后期培養(yǎng)產物的分離、提純以及檢測造成一定困難。,（3）無血清培養(yǎng)基,無血清培養(yǎng)基(Serum free medium,SFM)是不含血清的動物細胞培養(yǎng)基，由基礎培養(yǎng)基和添加已知組分組成。試圖全部替代血清成分。 基礎培

14、養(yǎng)基較常用的是DMEM、F12培養(yǎng)基。 添加組分主要包括：生長因子、激素（胰島素、胰高血糖素等）、結合蛋白與轉鐵蛋白、細胞外基質、酶抑制劑、氫化考地松等。,11-3 動物細胞培養(yǎng)工具與條件,4、動物細胞培養(yǎng)常用溶液 （1）平衡鹽溶液（Balanced salt solution，BSS ）主要由生理鹽水和葡萄糖組成，具有維持細胞滲透壓、調控培養(yǎng)液酸、堿度平衡的功能。 例如：Hanks液、Earle液（緩沖能力強） 注：酚紅在培養(yǎng)基中被用來作為pH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。,4、動物細胞培養(yǎng)常用溶液,（2）培養(yǎng)基pH調整液 動物細胞對酸堿度要求十分嚴格，大部分合成培養(yǎng)

15、液都呈微酸性，若滅菌前調整到標準值，滅菌后又會降低，因此pH調整液應單獨配制和滅菌，在培養(yǎng)液滅菌后再加入調整pH值最好。 常用pH調整液有：3.7%、5.6%、7.4%的NaHCO3溶液、HEPES液等。 注：HEPES （4-羥乙基哌嗪乙硫磺酸）是一種非離子兩性緩沖液，其在pH 7.2 - 7.4范圍內具有較好的緩沖能力：,4、動物細胞培養(yǎng)常用溶液,（3）細胞消化液 使用目的：培養(yǎng)前讓組織塊消化解離成分散細胞，或傳代培養(yǎng)時使細胞脫離器皿表面并分散解離。 胰蛋白酶溶液：水解細胞間的蛋白質，使細胞分散，使用濃度0.125或0.25%，用無 Ca2+、 Mg2+的 Hanks或PBS緩沖液配制，p

16、H值6.8-7.2，2-10分鐘消化完后加血清終止反應。 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）消化液：非酶性解離細胞，毒性小、經濟、操作方便，使用濃度0.02%。 注：若將兩者結合使用，解離效果更好： EDTA：胰蛋白酶體積比=1：1或2：1,4、動物細胞培養(yǎng)常用溶液,（4）抗生素溶液 作用：防止微生物污染。 常用抗生素有青霉素、鏈霉素、卡那霉素、制霉菌素等。 通常是青霉素和鏈霉素聯(lián)合使用：培養(yǎng)基內最終使用濃度 為 青霉素100U/ml、鏈霉素100微克/ml（雙抗）。,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,1、動物細胞體外培養(yǎng)的一般過程 一般經過：組織獲得與消化、接種、原代培養(yǎng)、傳代培養(yǎng)幾個環(huán)節(jié) 原

17、代培養(yǎng)期 傳代期 衰退期,圖11-8 動物細胞培養(yǎng)過程生長曲線,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,2、動物細胞原代培養(yǎng) 原代培養(yǎng)（Primary culture）：從體內取出組織接種直接長出單層細胞到第一次傳代培養(yǎng)前的階段（一般持續(xù)1-4周）。 原代（初代）培養(yǎng)期特點：在這個階段，細胞有分裂但不旺盛，細胞多呈二倍體核型。這樣的細胞稱為原代細胞。 優(yōu)點：細胞生物性狀尚未發(fā)生很大變化，在一定程度上能反映體內的形態(tài)學特征，是藥物測試、研究細胞分化等很好的實驗材料。,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,傳代期 原代細胞一經傳代后便稱為細胞系。在此期間，細胞增殖旺盛，并維持二倍體核型。一般當傳代1

18、0-50次后，細胞增殖逐漸減慢，以致完全停止。 衰退期 該階段細胞仍然生存，但是增殖很慢或不增殖。細胞形態(tài)輪廓增強，最后開始凋亡。,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,2.1 組織塊原代培養(yǎng)法 比較常用早期簡易的原代培養(yǎng)方法： （1）組織塊的分離：將組織塊剪碎成1mm3大小，加Hanks緩沖液，用吸管吸打，低速離心，收集沉淀即為組織塊。也可用注射器擠壓，或用網篩分離得到細小的組織塊。,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,（2）接種與培養(yǎng)：用吸管吸出組織塊，放入培養(yǎng)瓶內，每小塊間隔0.5厘米，使其均勻貼在培養(yǎng)瓶的壁上（可涂血清）。然后將貼有組織塊的瓶壁朝上，加入培養(yǎng)液，塞上瓶塞，將培養(yǎng)瓶緩慢

19、翻轉使培養(yǎng)液覆蓋組織塊，傾斜置于37的CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)。,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,（3）生長周期：一般情況下，組織塊貼壁后24小時細胞就從組織塊四周長出，24小時后可再補充培養(yǎng)液，3-5天即可形成單層細胞再更換培養(yǎng)液即首次傳代培養(yǎng) ，若5-7天組織塊中央的組織細胞逐漸壞死脫落。,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,2.2 組織消化原代培養(yǎng)法 （1）取材與消化酶解法制備單細胞 根據(jù)不同的組織對象采用適當?shù)拿赶韩@得動物細胞團或單個細胞，然后進行培養(yǎng)。 最常用的有胰蛋白酶和膠原酶，此外鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶等也可用于動物細胞的消化。 消化傳代細胞常用EDTA與胰蛋白酶

20、一起使用。,組織消化原代培養(yǎng)法,胰蛋白酶法適用消化細胞間質較少的軟組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、肝、腎等 膠原酶解：適用于結締、上皮、癌組織等，使膠原酶最終濃度為200u/ml，36.5，靜置448小時，上面懸液經離心獲得或纖維細胞沉淀，沉淀重置于生理鹽水，去掉未解向組織塊后沉淀得到上皮樣細胞。,組織消化原代培養(yǎng)示意圖,組織消化原代培養(yǎng)法,（2）原代培養(yǎng)期檢查 1.檢查細胞形態(tài)及活力：倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中原代細胞，生長良好者輪廓不清晰，較透明；生長不良者反而輪廓清晰，形態(tài)不規(guī)則，胞內有空泡、顆粒等。 四唑氮藍法(MTT)法可以檢測細胞活力：活細胞的線粒體脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶于水的藍紫

21、色產物甲暨（Formazan)并沉淀在細胞中。,組織消化原代培養(yǎng)法,2.培養(yǎng)液pH及污染檢查：含血清的新鮮培養(yǎng)液呈桃紅色，pH在7.27.4之間。CO2的積累使培養(yǎng)液pH下降，當超出緩沖范圍時，培養(yǎng)液變黃，需要34天更換一次培養(yǎng)液。CO2培養(yǎng)箱能自動控制5%的CO2含量。 細菌污染時培養(yǎng)液變渾濁；支原體易透過 濾器，污染不易被發(fā)現(xiàn)。,倒置顯微鏡：組成和普通顯微鏡一樣，只不過物鏡與照明系統(tǒng)顛倒，前者在載物臺之下，后者在載物臺之上，用于觀察培養(yǎng)的活細胞，具有相差物鏡。,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,3、動物細胞傳代培養(yǎng) 傳代培養(yǎng)（Passage culture/Subculturing）是

22、指將原代培養(yǎng)的細胞繼續(xù)轉接培養(yǎng)的過程，一般可傳代50代左右。傳代培養(yǎng)期間的細胞稱為細胞系。 注意：每進行一次分離再培養(yǎng)稱為傳一代，即從細胞接種培養(yǎng)到分離再培養(yǎng)期間的一段時間。在細胞的一代中，細胞約能倍增36次。,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,傳代培養(yǎng)方法 懸浮生長的細胞可以采用加入新鮮培養(yǎng)基后直接吹打分散傳代，或者采用自然沉降法加入新鮮培養(yǎng)基后再吹打分散進行傳代。 貼壁生長的動物細胞，原代培養(yǎng)細胞分裂增殖擴展成片后需要進行細胞分離重新接種培養(yǎng)。一般采用酶消化法進行傳代培養(yǎng)。 視頻：動物細胞培養(yǎng)技術: ,11-4 動物細胞培養(yǎng)生長和增殖過程,酶消化傳代過程 1、吸出或者倒掉培養(yǎng)瓶內的舊培

23、養(yǎng)液。 2、加入胰蛋白酶和EDTA混合液蓋滿瓶底， 輕輕搖動培養(yǎng)瓶 3、25分鐘后檢查，有細胞間隙變大、細胞 質回縮現(xiàn)象時添加培養(yǎng)液終止消化。 4、吸出消化液，加入Hanks液輕輕轉動，洗 去殘留消化液。 5、加入培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打瓶壁，使細 胞脫落制成懸液。 6、計數(shù)，接種進行傳代培養(yǎng)。,動物細胞的傳代培養(yǎng),問題：,1.為何要定期用胰蛋白酶使細胞從瓶壁上脫離下來？ 2.比較動物細胞培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基的成分. 3.動物細胞培養(yǎng)是否能像植物細胞一樣 最終培養(yǎng)成新個體？,獲得細胞,細胞的全能性,細胞株、細胞系,植物體,培養(yǎng)結果,或細胞分泌蛋白,快速繁殖、培育無病毒植株等,培養(yǎng)目的,

24、葡萄糖、動物血清,蔗糖、植物激素,培養(yǎng)基特有成分,液體培養(yǎng)基,固體培養(yǎng)基,培養(yǎng)基性質,細胞增殖,原理,動物細胞培養(yǎng),植物組織培養(yǎng),比較項目,2、植物組織培養(yǎng)和動物細胞培養(yǎng)的比較,動物細胞培養(yǎng)過程：,動物胚胎或幼齡動物的組織、器官,細胞懸浮液,胰蛋白酶或膠原蛋白酶,10代細胞,原代培養(yǎng),無限傳代,單個細胞,加培養(yǎng)液,遺傳物質未改變,遺傳物質改變,剪碎,胰蛋白酶,11-5 細胞株與保存,1.細胞系(Cell line) 是由原代培養(yǎng)經傳代培養(yǎng)純化，獲得的以一種細胞為主的、能在體外長期生存的不均一的細胞群體。第一次傳代培養(yǎng)后的細胞即稱之為細胞系。 不能連續(xù)培養(yǎng)的為有限細胞系(Finite cell

25、line)，能連續(xù)培養(yǎng)下去的為連續(xù)細胞系(Infinite cell line)。,11-5 細胞株與保存,2.細胞株(Cell strain) 指從一個經過生物學鑒定的細胞系用單細胞分離培養(yǎng)或通過篩選的方法，由單細胞增殖形成的細胞群，稱細胞株。 細胞株的建立需要從細胞系群體中分離出一個細胞，并使其在體外繁殖成為新細胞群體。,11-5 細胞株與保存,3. 動物細胞株類型 包括： 原代細胞、傳代細胞 有限細胞系、無限細胞系（不具有接觸抑制現(xiàn)象；理想的藥物生產細胞） 二倍體細胞、異倍體細胞 融合細胞、轉化細胞、基因工程細胞,11-5 細胞株與保存,（1）原代細胞 常用有：雞胚細胞、原代兔腎細胞或鼠

26、腎細胞、血液淋巴細胞 1949年，恩德斯（Enders）利用人胚胎組織細胞生產脊髓灰質滅活疫苗，開創(chuàng)了動物細胞培養(yǎng)進行生物制藥的先河。 缺點：具有需要大量動物組織、成本高、費時費力等。 藥物篩選、藥理研究。,11-5 細胞株與保存,（2）二倍體傳代細胞 二倍體細胞具有正常細胞的特點：二倍體染色體、具有貼壁和接觸抑制特性、無致瘤性。 有限細胞系（傳代次數(shù)一般都不超過50代）。 WI-38： 1961年Wister 38研究所從女性高加索人的正常胚肺組織中獲得的一株人2倍體細胞系WI-38。培增時間24h；貼壁生長；第一批獲得批準用于生產的二倍體細胞有對病毒敏感，第一個用于疫苗（脊髓灰質滅活疫苗）

27、生產。 MRC-5：二倍體，成纖維，生長比WI-38快。,11-5 細胞株與保存,（3）融合細胞 通過細胞融合技術可得到具有兩親本特征 的細胞，如雜交瘤細胞：脾臟B淋巴細胞與 骨髓瘤細胞的融合細胞。用于抗體藥物生產。 （4）基因工程細胞 將藥用蛋白基因轉化入動物細胞培養(yǎng)，多用于大量生產藥物。,11-5 細胞株與保存,（5）轉化細胞 細胞轉化是指細胞發(fā)生遺傳改變而產生永生化，即由限定性細胞系轉化為連續(xù)性細胞系，可以在體外進行無限傳代和生長繁殖。 不同于癌細胞，沒有致瘤性。 倍增時間短，對培養(yǎng)條件與生長因子要求低。 由于轉化細胞常常由于染色體斷裂而變成異倍體，失去正常細胞的特點。轉化細胞于20世紀

28、80年代獲得批準用于生產。,11-5 細胞株與保存,轉化方法 1.細胞自轉化 體外培養(yǎng)的細胞自發(fā)出現(xiàn)的轉化現(xiàn)象。這種現(xiàn)象在許多正常二倍體長期傳代過程中出現(xiàn)?？赡艿囊蛩匕ǎ貉遒|量、溫度或pH不穩(wěn)定、病毒污染等。 2.人工誘發(fā)轉化 采用誘導劑使正常細胞發(fā)生轉化。凡是可以改變DNA結構的因素都可以稱為誘導劑，包括化學、物理和病毒誘導劑。,常用細胞株,CHO細胞(Chinese hamster ovary cell)：從中國倉鼠卵巢分離的細胞，亞二倍體，有多種突變株。貼壁生長，也可以懸浮培養(yǎng)，對剪切力和滲透壓改變有較高的忍受能力。 CHO細胞能表達糖基化蛋白藥物：組織纖維蛋白溶酶原激活劑(Tiss

29、ue plasminogen activator，tPA)、促紅細胞生成素（Erythropoiefin，EPO）、乙型肝炎病毒表面抗原（Hepatitis B virussurface antigen, HBsAg）、粒細胞集落刺激因子（Granulocyte colony stimulating factor,G-CSF）、DNA酶I、凝血因子VIII等。 比二倍體減少1條(2n-1)或幾條染色體的細胞稱亞二倍體,常用細胞株,Vero細胞（Vero cell）:是1962年日本從非洲綠猴腎中分離的細胞。成上皮型，異倍體，貼壁型，是最常用的大規(guī)模培養(yǎng)的動物細胞之一。,常用細胞株,BHK-21

30、細胞（Baby hamster kidney cell）：是1961年英國從幼地鼠的腎臟分離的細胞。成纖維樣，異倍體。常用于增殖病毒制備疫苗和重組蛋白(例如重組凝血因子VIII)。,11-5 細胞株與保存,4 .動物細胞冷凍保存 （1）先酶消化分散成單個細胞，用冷凍保護液（含10%血清的培養(yǎng)液+10%甘油或二甲基砜DMSO）冷卻，同時將細胞稀釋成2-5*106個/ml。 （2）分裝： 1ml /安瓶 （3）冷凍機內冷凍至-25 （4）液氮罐長期冷凍保存。 （5）細胞復蘇： 37水浴快速融化,11-6 動物細胞小規(guī)模培養(yǎng),1、懸滴培養(yǎng) 是最早建立的體外培養(yǎng)技術，是組織和器官培養(yǎng)的經典方法。 將培

31、養(yǎng)液滴于蓋玻片上并鋪展開，將待培養(yǎng)的組 織或器官植塊放于鋪展開的培養(yǎng)液中央部位，然后將蓋玻片翻轉放于凹載玻片上，密封后進行培養(yǎng)。,11-6 動物細胞小規(guī)模培養(yǎng),2、灌注小室培養(yǎng) 是在懸滴法基礎上的改進，實現(xiàn)營養(yǎng)液的循環(huán)供應與流出。 3.培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法 1923年，卡雷爾（Carrel）設計成功卡氏瓶，可以保證動物細胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境和生長空間。 培養(yǎng)瓶培養(yǎng)法是目前動物細胞小規(guī)模培養(yǎng)的主要方法之一。,11-6 動物細胞小規(guī)模培養(yǎng),培養(yǎng)對象直接接種于培養(yǎng)瓶內再放入培養(yǎng)箱,11-6 動物細胞小規(guī)模培養(yǎng),4 培養(yǎng)板培養(yǎng)法 接種在培養(yǎng)板孔（48、96）內，然后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 目前常規(guī)方法之一,11-

32、6 動物細胞小規(guī)模培養(yǎng),5 轉管培養(yǎng)法 1933-1934年，蓋爾（Gey）和劉易（Lewis）建立了旋轉管培養(yǎng)方法，將培養(yǎng)物接種于一管狀培養(yǎng)器皿中，再將其固定在一可以旋轉的裝置上旋轉培養(yǎng)。 旋轉管培養(yǎng)方法克服了靜置培養(yǎng)的不足，例如：細胞生長環(huán)境不均勻、不利于營養(yǎng)的吸收等，培養(yǎng)物可以交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境，利于細胞或組織生長。,11-6 動物細胞小規(guī)模培養(yǎng),6 轉瓶培養(yǎng)法 將轉管換成培養(yǎng)瓶，增加了培養(yǎng)液與空氣接觸面積,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),1 懸浮培養(yǎng) 是指細胞在反應器培養(yǎng)液中自由懸浮生長。 主要用于非貼壁依賴型的少數(shù)細胞培養(yǎng)：雜交瘤細胞、血液白細胞、淋巴細胞，某些腫瘤細胞等。 優(yōu)

33、點：細胞呈單個游離態(tài)存在，傳代時無需再消化分散；增殖快，產量高，培養(yǎng)過程簡單。 貼壁型細胞貼附在微載體上或者包裹在微囊中后可以接種在適當生物反應器中實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)。,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),2. 微載體培養(yǎng) 微載體（Microcarrier）：是直徑60-250m的帶正電荷微粒（葡聚糖聚合物），適于貼壁型細胞生長。 1967年，維茨爾（Van Wezel）開發(fā)了微載體系統(tǒng)。,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),微載體培養(yǎng)成既能滿足動物細胞的貼壁要求，又能使微珠懸浮起來，實現(xiàn)3D培養(yǎng)，擺脫了傳統(tǒng)的培養(yǎng)瓶（管）培養(yǎng)限制（面積有限，占用空間大，細胞產率低，監(jiān)控不便，勞動強度大） 。,11-7 動物細胞

34、大規(guī)模培養(yǎng),2.1 微載體特點 1.良好的生物相容性、無毒無害 2.有好的黏附性，一般帶正電荷 3.大的比表面積：顆粒均勻，孔徑均一 4.良好的傳質性能 5.強的機械性能：重復利用、保護細胞 6.好的熱穩(wěn)定性：能高壓滅菌,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),2.2 微載體分類 1.實心微載體 優(yōu)點：易于細胞在表面貼壁，機械強度高，容易接種操作 缺點：細胞濃度低；細胞容易受剪切力、攪拌、碰撞等影響；細胞易老化脫落。,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),2.多孔微載體 優(yōu)點：比表面積更大生長空間大；內部生長可使 細胞免受機械損傷；易固定化培養(yǎng)，可以采用高 的攪拌速度和通氣量，強化傳質。 缺點：容易產生營養(yǎng)傳遞

35、障礙，積聚代謝副產物。,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),2.3 微載體培養(yǎng)細胞方法 1、選擇合適的微載體類型：細胞貼壁率高、細胞容納量大等 2、浸泡水化及消毒：用含Ca2+、Mg2+的PBS浸泡微載體3h，洗滌1次，高壓滅菌。,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),3、接種：根據(jù)不同細胞類型決定接種濃度。 細胞在微載體表面的貼附是關鍵，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和親和性，也與培養(yǎng)基組成（血清提供促接觸和伸展因子）、要慢速攪拌等相關。多數(shù)細胞都可在24小時內貼壁。 4、培養(yǎng)與觀察、細胞計數(shù)：觀察形態(tài)是否正常，并計數(shù)控制密度。,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),微載體細胞培養(yǎng)生長過程 1.游離期：接種的細

36、胞在培養(yǎng)液中呈懸浮態(tài)。 2.吸附期：不同類型的細胞的貼壁時間有所差異，多數(shù)細胞都可在24小時內貼壁。 3.繁殖期：懸浮細胞貼壁后經過一段停滯后開始分裂。隨著細胞數(shù)量的增多，細胞間開始接觸并連接成片。出現(xiàn)接觸性抑制。 4.退化期：細胞長滿載體表面，隨著營養(yǎng)物的消耗和代謝物的積累，密度抑制現(xiàn)象出現(xiàn)，細胞開始退化。如不及時傳代培養(yǎng)，細胞脫落死亡。,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),2.3 微載體培養(yǎng)細胞方法 5、消化與細胞回收：細胞貼壁率高、細胞容納量大等。 酶消化法：碳酸氫鈉堿性溶液浸泡，貼壁性差，使細胞脫落；用含EDTA的PBS緩沖液洗滌微球，胰蛋白酶-EDTA 37浸泡攪動消化15min后，血清終

37、止 6、細胞收獲：離心沉降法(400r/min,2min)或100um過濾法。 7、傳代培養(yǎng)：“球傳球”傳代培養(yǎng)技術,11-7 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng),球傳球接種技術 將貼滿細胞的微載體與新鮮微載體混合，實現(xiàn)細胞因隨機碰撞而實現(xiàn)轉移貼附在新載體表面的技術。 優(yōu)點： （1）避免了細胞收獲與微載體再生過程，方便、高效。 （2）防止細胞調亡：通過定期更換微載體也能為細胞的分裂生長提供了新的生長空間，在長期培養(yǎng)過程中保持細胞活力，延長了細胞壽命，提高了細胞分泌物的產量。,11-8 動物細胞培養(yǎng)生物反應器,機械攪拌式：漿葉改造 充氣攪拌式：需要改造 微載體培養(yǎng)：解決空間分布與貼壁，連續(xù)灌注培養(yǎng) 中空纖維式：

38、解決貼壁、營養(yǎng)氣體有效吸收交換、連續(xù)灌注培養(yǎng),柱式中空纖維生物反應器,中空纖維是一種細微的管狀結構，管壁為極薄的半透膜。 主體是由微孔中空纖維管束制成的中空絲，纖維束由外殼包裹，因此可分為中空內腔與中空外腔兩部分，每部分各有其進出口。新鮮培養(yǎng)液從中空內腔導入。氣體在管體部分通過，其中一部分則均勻地擴散至殼體內部。,中空纖維反應器,板框式：平行排列的中空纖維床,優(yōu)點：克服了纖維軸向流動時營養(yǎng)供應與產物積累存在的濃度梯度,中心灌流式,柱式中空纖維生物反應器評價,模擬細胞在體內生長的三維狀態(tài)。 既可用于懸浮細胞的培養(yǎng)，又可用于貼壁細胞的培養(yǎng)。細胞如果是附壁性的，則附著在纖維外殼表面，在培養(yǎng)結束后用胰

39、蛋白酶消化液將其消化沖出；若是非附壁性的，應采用微濾材料將其截留在反應器內而讓培養(yǎng)液排出。 優(yōu)點：無剪切力影響，高密度培養(yǎng)，傳質效率高。 缺點：容易堵塞，價錢昂貴。,11-9 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素,1、有毒物質或抑制因子產生 氨：來自培養(yǎng)基+代謝，積聚影響細胞生長和蛋白糖基化。 乳酸：來自細胞的糖代謝，抑制乳酸脫氫酶，抑 制糖酵解，能量產生減少，抑制細胞生長。 甲基乙二醛：脂類、氨基酸的代謝產物，對細胞 有潛在的損傷作用，改變有機物-NH3和-SH2。 CO2：毒害細胞或改變代謝水平、增大細胞滲透壓。,11-9 動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)的影響因素,2、物理因素 滲透壓：影響細胞生長、死亡速度

40、，影響產物積累； 載體：空間大小、孔隙大小，貼壁性、細胞移動性 細胞死亡與凋亡：凋亡基因bcl-2 原因：營養(yǎng)成分耗盡、有毒產物積累 如谷氨酰胺的耗竭是最常見的凋亡原因，而且凋亡一旦發(fā)生，補加谷氨酰胺已不能逆轉凋亡。另外，動物細胞在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)時，細胞變得更為脆弱，更容易發(fā)生凋亡。 參數(shù)控制：在線監(jiān)控 pH、溫度、氧氣、攪拌等,采取怎樣的工藝操作才可以消除細胞凋亡，保證高的細胞濃度？,1.減少細胞調亡 （1）可以去除氨、乳酸、甲基乙二醛等代謝 物質。 （2）保證營養(yǎng)供給。 2.連續(xù)性收獲產品,11-10 動物細胞表達制備藥用蛋白,轉基因微生物在生產分子量較小、結構較為簡單的異

41、源蛋白方面具有優(yōu)越性，微生物表達系統(tǒng)合成的復雜真核蛋白存在折疊方式不正確、缺乏翻譯后加工修飾等缺陷，動物細胞蛋白質表達系統(tǒng)可以較好地解決這些問題。 大多數(shù)哺乳動物蛋白翻譯后的修飾，例如：糖基化、磷酸化和乙?；?，是保持生物學活性、穩(wěn)定性及抗原性的前提。,11-10 動物細胞表達制備藥用蛋白,1. 動物轉基因方法 （1）物理法-電穿孔法 利用脈沖電場提高細胞膜的通透性，在細胞膜上形成納米級的微孔，達到增加通透性的效果，從而使外源DNA轉移至細胞中。 簡單、效率較高。,11-10 動物細胞表達制備藥用蛋白,（2）化學方法 DEAE-萄聚糖法 早期使用轉基因法，效率低。 原理：帶負電的DNA吸附在帶

42、正電荷的DEAE（二乙氨乙基）表面形成顆粒，通過胞飲作用進入胞內。,11-10 動物細胞表達制備藥用蛋白,磷酸鈣-DNA共沉法： 比前者高，但轉基因效率還較低。 原理：形成磷酸鈣-DNA沉淀顆粒，Ca2+能促使細胞膜脂裂開形成孔隙，使DNA進入，也可通過胞飲作用進入胞內。,11-10 動物細胞表達制備藥用蛋白,脂質體載體包埋法 將需轉移的外源DNA或RNA與脂質體混合帶負電的DNA自動結合到帶正電的脂質體內形成DNA-陽離子脂質體復合物。由于脂質體具有磷脂雙層結構，與細胞膜類似，因此可以與受體細胞膜融合，從而將外源DNA轉入宿主細胞。效率高。,11-10 動物細胞表達制備藥用蛋白,（3）生物學

43、方法 逆轉錄病毒法 逆轉錄病毒是一種整合型的單鏈RNA病毒。 將目的基因重組到反轉錄病毒載體上，感染細胞。 病毒進入細胞后，利用宿主細胞編碼出反轉錄酶， 將病毒RNA反轉錄成dsDNA，再自行和復制，再整 合到宿主細胞DNA上，但機制不明確。 如牛乳頭瘤病毒BPV，載體容量小（8KB）可表達干擾素、生長素等基因。,11-10 動物細胞表達制備藥用蛋白,2. 轉染細胞與篩選 需選用在體外能無限生長的細胞作為受體細胞。采異用特性選擇標記用于快速有效地篩選轉染細胞。 例如：胸腺嘧啶核苷激酶(Thymidine kinase,TK)： 當轉入TK-細胞時，其基因產物可使宿主細胞獲得對HAT培養(yǎng)液的抗性。,11-