副溶血性弧菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序

1、副溶血性弧菌檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序,概況,副溶血性弧菌于1950年從日 本一次暴發(fā)性食物中毒中分離 發(fā)現(xiàn)。該菌存在于近海的海水、 海底沉積物和魚類、貝殼等海 產(chǎn)品中。在37、pH7.7、含 氯化鈉34%的環(huán)境中生長(zhǎng)最 好。主要引起食物中毒，尤以 日本、東南亞、美國(guó)及我國(guó)臺(tái) 北地區(qū)多見，也是我國(guó)大陸沿 海地區(qū)食物中毒中最常見的一 種病原菌。,范圍,本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的檢驗(yàn)方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于水產(chǎn)品及食物中毒樣品中副溶血性弧菌的檢驗(yàn)，其他食品可參照使用。,食品種類,動(dòng)物性水產(chǎn)品： 鮮凍水產(chǎn)品（定性檢測(cè)）：新鮮水產(chǎn)品和冷凍水產(chǎn)品； 生食水產(chǎn)品（

2、定性、定量檢測(cè)）：新鮮的、冷藏、冷凍的海水或淡水魚類、甲殼類、貝殼類和軟體動(dòng)物等，未經(jīng)腌制、加熱，可以直接食用的。,設(shè)備和材料,除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他 設(shè)備和材料如下： 恒溫培養(yǎng)箱：36 1。 冰箱：2 5 。 均質(zhì)器及無菌均質(zhì)袋、均質(zhì)杯或滅菌乳缽。 天平： 感量0.1 g。 無菌試管：18 mm180mm、15 mm100 mm。 無菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸頭。 無菌錐形瓶：500 mL、250 mL。 無菌培養(yǎng)皿：直徑90mm。 VITEK全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)1。 滅菌手術(shù)剪、鑷子。,樣品制備, 非冷凍樣品

3、采集后應(yīng)立即置710冰箱保存，盡可能及早檢驗(yàn)； 冷凍樣品應(yīng)在45 以下不超過15 min或在25不超過18 h解凍； 如果樣品需要冷凍貯存，應(yīng)在樣品中加等量緩沖甘油-氯化鈉溶液（液體樣品應(yīng)加雙料），推薦貯存溫度為-70 以下。,樣品制備,魚類和頭足 類動(dòng)物取表 面組織、腸 或鰓。貝類 取全部?jī)?nèi)容 物，包括貝 肉和體液；,樣品制備,甲殼類取整個(gè)動(dòng)物，或者動(dòng)物的中心部分，包括腸和鰓。,樣品制備,如為帶殼貝類或 甲殼類，則應(yīng)先在 符合生活飲用水衛(wèi) 生標(biāo)準(zhǔn)的流水中洗 刷外殼并甩干表面 水分，然后以無菌 操作打開外殼，按 上述要求取相應(yīng)部 分。,樣品制備,以無菌操作取檢樣25 g（mL），加入3氯化鈉堿

4、性蛋白胨水225 mL，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8 000 r/min均質(zhì)1 min，或拍擊式均質(zhì)器拍擊2 min，制備成1:10的均勻稀釋液。如無均質(zhì)器，則將樣品放入無菌乳缽中磨碎，然后放在500 mL的滅菌容器內(nèi)，加225 mL 3氯化鈉堿性蛋白胨水，并充分振蕩。,增菌,定性檢測(cè) 將上述1:10稀釋液于36 1 培養(yǎng)8 h18 h。,增菌,定量檢測(cè) 用滅菌吸管吸取1:10稀釋液1 mL，注入含有9 mL 3氯化鈉堿性蛋白胨水的試管內(nèi)，振搖試管混勻，制備1:100的稀釋液。 另取1 mL滅菌吸管，按上條操作依次制備10倍遞增稀釋液，每遞增稀釋一次，換用1支1mL滅菌吸管。 根據(jù)食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)要求或

5、對(duì)檢樣污染情況的估計(jì)，選擇三個(gè)連續(xù)的適宜稀釋度，每個(gè)稀釋度接種3支含有9 mL 3氯化鈉堿性蛋白胨水的試管，每管接種1 mL。置36 1 恒溫箱內(nèi)，培養(yǎng)8 h18 h。,分離,在所有顯示生長(zhǎng)的試管或增菌液中用接種環(huán)沾取一環(huán)，于TCBS平板或科瑪嘉弧菌顯色培養(yǎng)基平板上劃線分離。一支試管劃線一塊平板。于36 1 培養(yǎng)18 h24 h。,使用TCBS瓊脂劃線不可密集,分離,典型的副溶血性弧菌在TCBS上呈現(xiàn)為圓的、半透明的、表面光滑的綠色菌落，用接種環(huán)輕觸，有類似口香糖的質(zhì)感，直徑2 mm3 mm。從培養(yǎng)箱取出TCBS平板后，應(yīng)盡快（不超過1 h）挑取菌落或標(biāo)記要挑取的菌落。典型的副溶血性弧菌在科瑪

6、嘉弧菌顯色培養(yǎng)基上呈現(xiàn)為圓的、半透明的、表面光滑的粉紫色菌落，直徑2 mm3 mm。,TCBS瓊脂上面的副溶血性弧菌,四種顯色培養(yǎng)基,純培養(yǎng),挑取3個(gè)或 以上的可疑 菌落，劃線 3氯化鈉 胰蛋白胨大 豆瓊脂平板， 36 1 培養(yǎng)18 h 24 h。,初步鑒定,氧化酶試驗(yàn)：挑選純培養(yǎng)的單個(gè)菌落進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，副溶血性弧菌為氧化酶陽(yáng)性。,初步鑒定,涂片鏡檢：將可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。副溶血性弧菌為革蘭氏陰性，呈棒狀、弧狀、卵圓狀等多形態(tài)，無芽胞，有鞭毛。,初步鑒定,挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，轉(zhuǎn)種3氯化鈉三糖鐵瓊脂斜面并穿刺底層，361培養(yǎng)24h觀察結(jié)果。副溶血性弧菌在3氯化鈉三

7、糖鐵瓊脂中的反應(yīng)為底層變黃不變黑，無氣泡，斜面顏色不變或紅色加深，有動(dòng)力。,TSATTC可以方便觀察副溶血性弧菌動(dòng)力,初步鑒定,嗜鹽性試驗(yàn)：挑取純培 養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落，分別 接種于不同氯化鈉濃度的 胰胨水中，361培 養(yǎng)24h，觀察液體混濁情 況。副溶血性弧菌在無氯 化鈉和10氯化鈉的胰胨 水中不生長(zhǎng)或微弱生長(zhǎng)， 在7氯化鈉的胰胨水中 生長(zhǎng)旺盛。,確定鑒定,生化試驗(yàn)：分別接種含3氯化鈉 的甘露醇、賴氨酸、MR-VP培養(yǎng)基， 361培養(yǎng)24h48h后觀察結(jié) 果。隔夜培養(yǎng)物進(jìn)行ONPG試驗(yàn)。,MR-VP試驗(yàn),ONPG試驗(yàn),確定鑒定,API20E生化鑒定試劑盒或VITEK：刮取3氯化鈉胰蛋白胨大豆瓊脂平板上的單個(gè)菌落，用生理鹽水制備成濁度適當(dāng)?shù)募?xì)胞懸浮液，使用API20E生化鑒定試劑盒或VITEK鑒定。,生化特性,分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，不分解乳糖、蔗糖。 H2S、V-P、動(dòng)力（）。 甘露醇（）、賴氨酸（）、ONPG（）。,報(bào)告,當(dāng)檢出的可疑菌落生化學(xué)性狀符合表1要求時(shí)，可以報(bào)告檢出副溶血性弧菌。如果進(jìn)行定量檢測(cè)，