Bio-rad-MicroPulser電穿孔儀中文說明書

1、MicroPulser電穿孔儀操作手冊(cè)2018年12月27日1、 介紹（1）基本原理MicroPulser電穿孔儀用于細(xì)菌、酵母和其他眾多微生物的電擊轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)，高壓電脈沖作用于懸浮在小體積高阻介質(zhì)中的樣品。本系統(tǒng)由一個(gè)脈沖發(fā)生器（pulse generator）模塊、一個(gè)電擊腔（shocking chamber）和一個(gè)裝有電極的電擊杯（cuvette）組成。樣本放置于電擊杯的電極之間。MicroPulser模塊包含一個(gè)電容器，將電容器充電至高電壓，然后模塊將電容器中的電流放電到試管中的樣品中。MicroPulser的電容放電電路產(chǎn)生具有指數(shù)衰減波形的電脈沖，如下圖。當(dāng)電容器放電至樣品時(shí)，跨

2、越電極的電壓迅速上升至最大電壓（or峰值電壓，peak voltage；也稱為初始電壓，Vo），并隨時(shí)間（t）減小，如下式：其中=RC，為時(shí)間常數(shù)，是脈沖長度的簡(jiǎn)便表達(dá)式。 R為電路電阻，單位為ohms（歐姆）。 C為電容，單位為microfarad（微法拉）。根據(jù)方程1，是電壓下降至峰值電壓1/e（37%）的時(shí)間。MicroPulser的內(nèi)部電路被設(shè)計(jì)以使E.coli、釀酒酵母及其他許多微生物可以得到最佳電穿孔，最佳轉(zhuǎn)化效率發(fā)生在大約5ms的時(shí)間常數(shù)內(nèi)。這些電穿孔條件是通過使用10微法拉電容器和將600歐姆電阻與樣品池并聯(lián)以及將30歐姆電阻與樣品池串聯(lián)來實(shí)現(xiàn)的。除時(shí)間常數(shù)外，電場(chǎng)強(qiáng)度是另一個(gè)

3、決定轉(zhuǎn)化效率的重要參數(shù)。電場(chǎng)強(qiáng)度E，是施加于電極間的電壓，公式為：其中，V為施加的電壓，d為電極間的距離，單位為cm。電場(chǎng)強(qiáng)度和細(xì)胞的尺寸（size）決定了橫貫每個(gè)細(xì)胞的電壓降，正是電壓降可能是電穿孔中電壓效應(yīng)的重要表現(xiàn)。30歐姆串聯(lián)電阻的目的是在發(fā)生電弧的情況下保護(hù)設(shè)備電路。在正常操作條件下，當(dāng)樣本在高電阻介質(zhì)中，電阻不會(huì)影響施加在樣本上的電壓。但是，當(dāng)樣本的電阻較低時(shí)，電阻將極大地降低施加在樣品上的電壓。施加在樣品上的電壓的分壓降（fractional drop）由下式得到：當(dāng)Rsample為600歐姆，對(duì)于樣品就會(huì)有5%的電壓降（30/（30+600）=0.048）?；谶@個(gè)原因，當(dāng)樣品

4、溶液的電阻低于600歐姆時(shí)，不應(yīng)進(jìn)行電穿孔試驗(yàn)。這包括培養(yǎng)基未徹底從細(xì)胞中去除的樣本，殘留有NaCl的DNA樣本或連接混合物。MicroPulser能夠測(cè)量樣本的電阻，若樣本介質(zhì)電阻過低則不會(huì)進(jìn)行操作。（2）儀器參數(shù)操作（Manipulation of instrument parameters）MicroPulser儀器的一些參數(shù)可以進(jìn)行設(shè)置以達(dá)到最大轉(zhuǎn)化效率，包括場(chǎng)強(qiáng)E，時(shí)間常數(shù)，截?cái)嘀笖?shù)衰減脈沖的寬度。場(chǎng)強(qiáng)的設(shè)置可以有兩種方式進(jìn)行操作。一是，介于200-3000V電壓可以直接在儀器上設(shè)置，這是最容易控制的。改變電壓而保持其他條件不變是大多數(shù)電穿孔優(yōu)化程序的基礎(chǔ)。第二，使用不同電極間隙寬度

5、的電轉(zhuǎn)杯也是改變場(chǎng)強(qiáng)的一種方法。對(duì)于微生物的電穿孔，0.1和0.2cm間隙的電轉(zhuǎn)杯最常被使用。E.coli的電穿孔當(dāng)使用0.1cm電轉(zhuǎn)杯時(shí)通常使用1.8kV電壓（E=18kV/cm），而使用0.2cm電轉(zhuǎn)杯時(shí)使用2.5kV電壓（E=12.5kV/cm）。這些電穿孔條件作為預(yù)設(shè)程序內(nèi)置于MicroPulser中，分別位于細(xì)菌設(shè)置菜單中的Ec1（V=1.8kV）和Ec2（V=2.5kV）。另外，細(xì)菌設(shè)備菜單中的第三個(gè)程序Ec3的電壓為3.0kV（當(dāng)電轉(zhuǎn)杯為0.2cm時(shí)E=15kV/cm），我們發(fā)現(xiàn)可以得到比2.5kV更高的轉(zhuǎn)化效率。時(shí)間常數(shù)可以通過改變樣品的電阻而改變。樣品電阻的改變可以通過兩種方

6、式。一是，增加電穿孔介質(zhì)的鹽濃度或緩沖濃度會(huì)降低樣品的電導(dǎo)，反之亦然，結(jié)果導(dǎo)致時(shí)間常數(shù)的改變。第二，電轉(zhuǎn)杯中樣品體積與樣品電阻呈反比，降低樣品體積會(huì)增加樣品電導(dǎo)。樣品體積對(duì)電導(dǎo)的影響在低電阻介質(zhì)中是最顯著的。這些影響因素將會(huì)在后面部分進(jìn)一步介紹。MicroPulser還包括一種在電壓大于600V時(shí)比預(yù)期時(shí)間常數(shù)更快截?cái)嘀笖?shù)衰減脈沖的方法。當(dāng)脈沖被MicroPulser終止時(shí)，電壓只在樣品上作用指定長度的時(shí)間，可能在1.0 4.0 ms之間。下圖顯示了這種波形和真正的指數(shù)衰減脈沖的差異。2、 影響電穿孔的因素通過多年的研究，證實(shí)了微生物電穿孔的電條件（see Chang, et al., 199

7、2, and Nickoloff, 1995, for overviews as well as for protocols on electroporation of numerous species）。對(duì)大多數(shù)微生物而言，最佳電轉(zhuǎn)化發(fā)生在與E.coli和釀酒酵母所使用的電轉(zhuǎn)化條件相似的條件下，E.coli和釀酒酵母是當(dāng)今研究中最常使用的兩個(gè)物種。對(duì)于E.coli的電穿孔，文獻(xiàn)報(bào)道最常使用的條件是0.2cm電轉(zhuǎn)杯，40l細(xì)胞樣本，電壓2.5kV，時(shí)間5ms。對(duì)釀酒酵母，報(bào)告中最常使用的條件是0.2cm電轉(zhuǎn)杯，40l細(xì)胞樣品，1.5kV電壓和時(shí)間常數(shù)5ms。對(duì)許多細(xì)菌而言，如沙門氏菌屬（Sal

8、monella）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、幽門螺桿菌（Helicobacter）、包柔式螺旋體屬（Borrelia）、鏈球菌屬（Streptococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）和腸球菌屬（Enterococcus），電穿孔條件與E.coli一樣。而對(duì)于其他的細(xì)菌，改變電場(chǎng)強(qiáng)度可以得到更高的電轉(zhuǎn)化效率。一個(gè)相似的案例可見于其他種屬的酵母。MicroPulser的設(shè)計(jì)可以精確施加E.coli和釀酒酵母獲得最佳轉(zhuǎn)化效率所需的脈沖參數(shù)。當(dāng)使用高阻樣本時(shí)，時(shí)間常數(shù)被設(shè)置為5ms。對(duì)于這些微生物，MicroPulser預(yù)先設(shè)定了在0.1或0.2 cm的電擊杯中電穿孔大腸桿菌，

9、或在0.2或0.4 cm的電擊杯中電穿孔釀酒酵母時(shí)輸送正確電壓的程序。（1） 細(xì)胞生長（Cell Growth）對(duì)于大多數(shù)細(xì)菌而言，在對(duì)數(shù)生長期的早期或中期收獲細(xì)胞，可以得到最高的轉(zhuǎn)化效率。對(duì)于E.coli，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定期，轉(zhuǎn)化效率劇烈下降（Dower，1990）。相反，大多數(shù)酵母通常在對(duì)數(shù)生長的中期至晚期收獲細(xì)胞。對(duì)于釀酒酵母（S.cerevisiae），對(duì)數(shù)生長晚期的培養(yǎng)物相比早期的培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)化效率提高了60倍（Becker and Guarente，1991）。獲取細(xì)胞的最佳生長期通常隨細(xì)胞種類而異。當(dāng)制備一種新的物種的感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，最好使用為同種屬而制定的程序。對(duì)所需考慮因素的建議和

10、常用的制備感受態(tài)細(xì)胞的方法在Dower et al（1992）和Trevors et al（1992）的文章中被詳細(xì)討論。（2） DNA大多數(shù)的電穿孔應(yīng)用是將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，需要提及的是，幾乎任何形式的分子都可以通過電穿孔被導(dǎo)入細(xì)胞中，包括DNA、蛋白、糖類、小分子等。除了少數(shù)例外，當(dāng)導(dǎo)入自主復(fù)制質(zhì)粒時(shí)，使用超螺旋質(zhì)粒進(jìn)行電穿孔可以提高轉(zhuǎn)化效率。但是，將整合入宿主基因組的質(zhì)粒當(dāng)使用線性化質(zhì)粒時(shí)，轉(zhuǎn)化效率較高。例如，假絲酵母、畢赤酵母和四膜蟲使用線性質(zhì)粒比超螺旋質(zhì)粒效率更高。在E.coli和單核細(xì)胞增多性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）電穿孔轉(zhuǎn)化時(shí)，使用松弛型環(huán)狀

11、質(zhì)粒（relaxed circular plasmid）僅比使用超螺旋質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率略低（Leonardo and Sedivy，1990，Park and Stewart，1990）。但是，在E.coli和Streptococcus pyogenes（釀膿鏈球菌）的電穿孔轉(zhuǎn)化時(shí)，線性質(zhì)粒比環(huán)狀質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化效率低103-104倍（Shigekawa and Dower, 1988, Simon and Ferretti, 1991）。在大多數(shù)物種中，每mol數(shù)量的質(zhì)粒的電穿孔效率隨著質(zhì)粒大小的增加而降低，包括E. coli （Leonardo and Sedivy, 1990, Siguret

12、et al., 1994），Pseudomonas aeruginosa（假單胞菌屬）（Dennis and Sokol, 1995），和Streptococcus thermophilus（嗜熱鏈球菌屬）（Somkuti and Steinberg，1988）。但是，有些物種，包括Lactococcus lactis（乳球菌屬）（Holo and Nes，1995），Enterococcus faecalis（腸球菌屬）（Cruz-Rodz and Gilmore，1990）和Clostridium perfringens（產(chǎn)氣莢膜梭菌）（Allen and Blaschek，1990），轉(zhuǎn)

13、化效率似乎與質(zhì)粒大?。词垢哌_(dá)20-30Kb）無關(guān)。盡管微生物的轉(zhuǎn)化使用各種方法提取的質(zhì)粒都可以完成，但質(zhì)粒的純度是影響轉(zhuǎn)化效率的一個(gè)因素。未純化的小量制備的質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化效率明顯低于經(jīng)過各種方法純化的質(zhì)粒DNA。利用Bio-Rad Quantum matrix制備的質(zhì)粒與CsCl純化質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率相當(dāng)。 通常，對(duì)于所有種類的微生物，轉(zhuǎn)化頻率隨著DNA濃度的增加而增加。對(duì)于E.coli，轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子/活細(xì)胞）受DNA濃度影響的范圍在106（10 pg/ml to 7.5 g/ml），在這個(gè)范圍內(nèi)，DNA濃度決定了細(xì)胞被轉(zhuǎn)化的概率。在較高的DNA濃度，高達(dá)80%的活細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化（Dower

14、et al，1988）。因?yàn)楂@得的轉(zhuǎn)化子的數(shù)量是轉(zhuǎn)化頻率和細(xì)胞數(shù)量的產(chǎn)物，轉(zhuǎn)化效率（轉(zhuǎn)化子/ug DNA）在109-31010細(xì)胞/ml范圍內(nèi)隨細(xì)胞濃度增加而增加。因此，為了獲得高的轉(zhuǎn)化頻率（transformation frequency），請(qǐng)使用高的DNA濃度。為了獲得高的轉(zhuǎn)化效率（transformation efficiency），請(qǐng)使用高的細(xì)胞濃度（和低的DNA濃度以防止共轉(zhuǎn)化cotransformation）。在每個(gè)實(shí)例中，小的樣本體積（20-50l）允許經(jīng)濟(jì)地使用DNA和細(xì)胞（see Dower et al., 1988, for a detailed discussion of

15、 these factors）。（3） 電穿孔介質(zhì)（Electroporation Media）MicroPulser被設(shè)計(jì)以使用具有高阻介質(zhì)的樣本?；诖?，當(dāng)制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)，洗滌以徹底去除培養(yǎng)基是非常重要的。若未徹底去除細(xì)胞中的培養(yǎng)基將導(dǎo)致電穿孔時(shí)在樣本中產(chǎn)生電弧。細(xì)胞應(yīng)該用水或低離子強(qiáng)度的溶液如蔗糖、甘油、葡萄糖、山梨醇或PEG洗滌至少3次。對(duì)許多微生物而言，甘油是一種方便的電穿孔介質(zhì)，因甘油通常被用于細(xì)胞保存的冷凍保存液。下圖展示了幾種不同生物學(xué)上的重要離子溶液對(duì)樣品電阻的濃度效應(yīng)。注意幾點(diǎn)： 體積對(duì)樣品的電阻有重要影響對(duì)離子溶液，樣品電阻和電轉(zhuǎn)杯中樣品的體積呈反比； 含有二價(jià)離子的溶

16、液的電阻比含有相同濃度單價(jià)離子的溶液電阻低； 緩沖溶液的電阻受pH值影響。即使極低濃度的離子化合物的加入都可以顯著降低樣品的電導(dǎo)，進(jìn)而引發(fā)電弧作用。通過乙醇沉淀法制備的DNA中殘留的鹽應(yīng)該在用水或TE buffer溶解DNA前洗滌DNA以降低鹽濃度。表1表明，雖然將含有10mM Tris，1mM EDTA，pH8.0溶液的質(zhì)粒加入水中，確實(shí)會(huì)降低樣品的電導(dǎo)，但這應(yīng)該不會(huì)導(dǎo)致不能使用MicroPulser進(jìn)行電穿孔試驗(yàn)。可以直接使用酶反應(yīng)的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化，但進(jìn)行高壓脈沖操作時(shí)，最終電穿孔樣品中的鹽濃度應(yīng)該保持在低于5meq的水平。最后，連接混合物可能可以用于轉(zhuǎn)化，但DNA加入量必須極低或者通過稀

17、釋（Willson and Gough，1988）、透析（Heery and Dunican，1989；Jacobs et al., 1990）或乙醇沉淀（Bttger, 1988；Zabarovsky and Winberg，1990）降低離子強(qiáng)度。3、 MicroPulser操作說明參見圖1了解MicroPulser的各個(gè)組件，圖5標(biāo)注了各個(gè)按鈕和LED的名稱。3.1 設(shè)置MicroPulser系統(tǒng) 將黑色電源線連接到MicroPulser脈沖發(fā)生器模塊的后面板。將電源線插入墻上的插座或電源線。 拉下MicroPulser底部的折疊腳。將該腳插入電擊腔底部的軌道中。將電擊腔滑塊滑入電擊腔。

18、 將從電擊腔引出的導(dǎo)線連接到MicroPulser前面板上的輸出接口上；極性對(duì)電穿孔過程并不重要。 打開電源開關(guān)。LED燈應(yīng)亮起并且顯示為“Ec1”，隨后LED指示細(xì)菌設(shè)置狀態(tài)（Bacteria Setteing）。3.2 MicroPulser的操作（1）選擇預(yù)設(shè)的程序MicroPulser預(yù)設(shè)了數(shù)種常見的微生物的電擊程序如下:循環(huán)按“Settings”鍵選擇“Bacteria”、“Fungi”和“Manual”。當(dāng)“Fungi”旁的LED燈亮?xí)r，預(yù)存儲(chǔ)的真菌轉(zhuǎn)化程序即被調(diào)出。按“上”和“下”鍵可在不同的真菌轉(zhuǎn)化程序間切換。電擊的參數(shù)自動(dòng)按顯示的程序設(shè)定。同樣的，選擇“Bacteria”程序

19、相同。不管是選擇“Bacteria”，還是“Fungi”程序，同時(shí)按住“上”“下”鍵可以在LED屏上顯示選定程序的參數(shù)。顯示屏上首先顯示的是電壓值，然后是“t”。如果一個(gè)程序的時(shí)間和多次脈沖相關(guān)，則顯示“P”，然后顯示“2”，表示將會(huì)進(jìn)行兩次連續(xù)的脈沖。如果沒有給定“t”，則脈沖是非截短的（not truncated），而如果沒有“P”被給定，則是單次脈沖。（2）使用MicroPulser的手動(dòng)模式A. 改變電壓按“Settings”鍵，當(dāng)“Manual”旁的LED燈亮?xí)r，顯示屏顯示電壓值（單位kV）。按“上”和 下鍵在0.20 kV-3.00kV之間改變電壓。如果儀器剛剛打開，顯示值為“0.

20、00”。B. 截短脈沖.當(dāng)“Manual”旁的LED燈亮?xí)r，同時(shí)按“上”和 下鍵LED屏顯示“t-”，表示為脈沖選擇了時(shí)間。開機(jī)時(shí)的默認(rèn)設(shè)置為標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)衰減脈沖，或衰減過程不被截短，顯示為“-”。同時(shí)按“上”和 下鍵后只松開“下”鍵，顯示數(shù)字為截短的脈沖持續(xù)時(shí)間，單位為毫秒，從1毫秒“t1.0”開始以0.1毫秒為增量一直到4毫秒“t4.0”。這將限定脈沖時(shí)間在1-4毫秒之間。同時(shí)按“上”和 下鍵后只松開“上”鍵，可以調(diào)整指定的脈沖截短時(shí)間到更短。（3）脈沖功能按“Pulse”鍵到電容充電至設(shè)定電壓；顯示屏上顯示“PLS”。當(dāng)脈沖完成后會(huì)發(fā)出一次響聲，如果是一次設(shè)置好的多重脈沖則在整個(gè)脈沖過程中

21、每次脈沖后均會(huì)發(fā)出一次響聲，“PLS”則一直在顯示屏上顯示。要想手動(dòng)進(jìn)行多重脈沖，則可以在一次脈沖完成且響聲停止后，再次按“Pulse”鍵。如果發(fā)出比較低程度的響聲，伴隨著“Arc”在顯示器上顯示，則表明系統(tǒng)預(yù)防和淬滅（ARQ）系統(tǒng)被啟動(dòng)，脈沖被中止。這通常是電擊杯被擊穿的跡象，如果樣品電阻太小，電擊杯仍可能被擊穿。因?yàn)樵凇癆RQ”事件中釋放的能量很低，重新設(shè)置一個(gè)不會(huì)產(chǎn)生電弧的參數(shù)對(duì)樣品重新電擊也可能會(huì)得到可接受的結(jié)果。但是，不建議使用經(jīng)歷了兩次電弧事件的樣品。（4）測(cè)量按“Measurements”鍵可以點(diǎn)亮Actual kV LED. 顯示最后一次脈沖試驗(yàn)的實(shí)際電壓（單位kV），如果儀器

22、剛剛開機(jī)并且沒有使用過，顯示器顯示0.00。再次按“Measurements”鍵可以點(diǎn)亮“Time ms”LED，顯示上次脈沖持續(xù)時(shí)間。按住“測(cè)量”按鈕，LED顯示屏將在實(shí)際電壓和時(shí)間常數(shù)之間切換。3.3 使用MicroPulser進(jìn)行電穿孔 將細(xì)胞懸液移入電轉(zhuǎn)杯中，輕敲液體使之落入電轉(zhuǎn)杯底部。0.2cm電轉(zhuǎn)杯最多可裝0.4ml溶液，0.1cm電轉(zhuǎn)杯最多可裝80l溶液。注意，溫度會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)化頻率產(chǎn)生重要影響。某些微生物的電轉(zhuǎn)，包括E.coli和釀酒酵母，在冷的電轉(zhuǎn)杯中轉(zhuǎn)化效率更高。 將電轉(zhuǎn)杯插入電擊腔的滑槽中。將滑槽推入電擊腔使電轉(zhuǎn)杯與電擊腔的電極緊密接觸。 按黃色“Pulse”按鈕，給電容器充電

23、并發(fā)出脈沖；LED顯示屏將顯示“PLS”，直到一個(gè)聲響結(jié)束表明脈沖已經(jīng)給出。LED顯示屏將顯示程序，時(shí)間常數(shù)，或?qū)嶋H輸出的電壓，這取決于選擇的LED。 從電擊腔取出滑槽，并取出電擊杯，處理電擊好的樣品細(xì)胞。 按下“測(cè)量”按鈕，在顯示屏LED上顯示發(fā)送到樣品的時(shí)間常數(shù)和實(shí)際電壓。當(dāng)“Actual kV”旁的LED亮起時(shí)，電壓顯示為“kV”。再次按下“measurement”按鈕即可顯示時(shí)間常數(shù)?！癟ime ms”旁邊的LED燈亮；時(shí)間常數(shù)以“ms”為單位。 按下電源按鈕關(guān)閉儀器。如果需要，樣品電擊腔現(xiàn)在可以安全地?cái)嚅_。在導(dǎo)線斷開之前，不要拆卸電擊腔蓋。4、 E.coli的高效電轉(zhuǎn)化E.coli電

24、轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化效率可達(dá)109-1010轉(zhuǎn)化子/g，這比最好的化學(xué)轉(zhuǎn)化法的轉(zhuǎn)化效率都要高。下面的protocol描述了一種用于高效電轉(zhuǎn)化的E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備方法。我們也對(duì)通過電穿孔轉(zhuǎn)化的其他菌株感興趣，并將此信息收錄在我們的電轉(zhuǎn)化手冊(cè)的后續(xù)版本中。4.1 制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞參考Ausubel et al.（1987）、Miller和Nickoloff（1995）的文章獲得更詳細(xì)信息。 向500ml LB培養(yǎng)基中按1%接種量接種新鮮的過夜E.coli菌液。 37、300rpm培養(yǎng)至OD600約為0.5-0.7（對(duì)數(shù)生長早期至中期收獲的細(xì)胞可獲得最佳的轉(zhuǎn)化結(jié)果，因此，適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度取決于菌株

25、和生長條件）。 將菌液在冰上放置20min。隨后的步驟中，盡可能保持細(xì)胞接近0（置于冰/水浴中），在加入細(xì)胞之前，在冰上預(yù)冷所有的容器。轉(zhuǎn)移細(xì)胞至預(yù)冷的離心管中，4、4000g離心15min。 小心倒去上清液。為了徹底去除培養(yǎng)基，寧可倒去部分細(xì)胞、犧牲收率。 用500ml冰預(yù)冷的10%甘油溶液輕柔重懸細(xì)胞沉淀。4、4000g離心15min，小心倒去上清液。 用250ml冰預(yù)冷的10%甘油溶液輕柔重懸細(xì)胞沉淀。4、4000g離心15min，小心倒去上清液。 用20ml冰預(yù)冷的10%甘油溶液輕柔重懸細(xì)胞沉淀。轉(zhuǎn)移至一個(gè)30ml無菌Oakridge管中。4、4000g離心15min。小心倒去上清液。

26、 用1-2ml冰預(yù)冷的10%甘油溶液輕柔重懸細(xì)胞沉淀。細(xì)胞濃度應(yīng)在1-31010 cells/ml范圍內(nèi)。本懸液可以冷凍在干冰或-70冰箱中，在該條件下，細(xì)胞可以穩(wěn)定保存至少6個(gè)月。4.2 電轉(zhuǎn)化 冰上解凍感受態(tài)細(xì)胞。對(duì)將要電轉(zhuǎn)的每個(gè)樣品，預(yù)先準(zhǔn)備一個(gè)1.5ml EP管和0.1或0.2cm電轉(zhuǎn)杯冰上預(yù)冷。 在預(yù)冷的1.5ml PP管內(nèi)，混合40l細(xì)胞懸液和1-2l DNA（DNA應(yīng)該為低離子強(qiáng)度溶液，如TE）。混勻，冰上孵育1min。注意：最好是在一個(gè)微量離心管中混合質(zhì)粒和細(xì)胞，因電擊杯的小槽不利于樣品的均勻混合。 若選擇0.1cm電擊杯，請(qǐng)?jiān)O(shè)置MicroPulser程序?yàn)椤癊c1”，若選擇0

27、.2cm電擊杯，則選擇程序“Ec2”或“Ec3”。具體儀器操作可見操作說明部分。 轉(zhuǎn)移DNA和細(xì)胞的混合物至預(yù)冷的電擊杯中，輕彈懸液使其落入電擊杯底部。將電擊杯放入電擊腔滑槽。將滑槽推入電擊腔，直至電擊杯固定于電擊腔的接觸電極間。電擊一次。 從電擊腔中移出電擊杯，立即加入1ml SOC培養(yǎng)基。用移液器迅速而輕柔地懸浮細(xì)胞。電擊后至將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至生長培養(yǎng)基的時(shí)間間隔對(duì)E.coli轉(zhuǎn)化子恢復(fù)生長是非常關(guān)鍵的（Dower et al，1988）。這一過程即使只延遲1min，都會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率3倍的降低。延遲10min則降低20倍。 轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至17100mm PP管，37、225rpm振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。

28、 檢查和記錄脈沖參數(shù)。時(shí)間常數(shù)應(yīng)接近5ms。電場(chǎng)強(qiáng)度可以通過實(shí)際電壓（kV）/電擊杯間隙寬度（cm）獲得。 在篩選平板上涂平板。4.3 電轉(zhuǎn)化所需溶液和試劑 LB：10g Bacto tryptone，5g Bacto yeast extract，5g NaCl；溶于1L水，高壓滅菌。 10%（v/v）甘油：12.6g甘油（密度為1.26g/cc）于90ml水。高壓或無菌過濾。 TE：10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA。 SOC：2% Bacto tryptone，0.5% Bacto yeast extract，10mM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCl

29、2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖。5、 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisciae）的電轉(zhuǎn)化5.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備參考Becker & Guarantee（1991）和Ausubel et al.（1987）的文獻(xiàn)獲取更多信息。 用2.8L三角培養(yǎng)瓶裝500ml YPD培養(yǎng)基，向其中接種0.1-0.5ml（原文為an aliquot一小份，未規(guī)定具體接種量）過夜菌液。釀酒酵母在30條件下的的倍增時(shí)間大約為2小時(shí)。 30過夜培養(yǎng)，250rpm，至細(xì)胞密度為1108cells/ml（OD600=？）。 于冰水浴中迅速冷卻以停止生長。 將細(xì)胞倒入2個(gè)250ml離心瓶中，4

30、、3000g離心5min。 小心倒掉上清液。將有細(xì)胞沉淀的離心瓶置冰上。 向每個(gè)離心瓶中加入50ml無菌、冰預(yù)冷的水，斡旋以重懸細(xì)胞沉淀。調(diào)整瓶內(nèi)液體的體積至250ml。4、3000g離心5min。倒去上清液。 用250ml無菌、冰預(yù)冷的水按上一步驟重復(fù)洗滌細(xì)胞一次。 用20ml無菌、冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至一個(gè)預(yù)冷的30ml Oakridge管。4、3000g離心5min。小心倒去上清液。 用0.5ml無菌、冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液重懸細(xì)胞沉淀。最終的細(xì)胞體積約1.3ml，細(xì)胞濃度約11010cells/ml。將細(xì)胞置于冰上并盡快使用。5.2 電轉(zhuǎn) 吸取待轉(zhuǎn)化的DNA樣品

31、（5-100ng/5l）至一個(gè)1.5ml無菌EP管，置于冰上預(yù)冷。 如果使用0.2cm電擊杯，向每個(gè)DNA樣品加入40l感受態(tài)細(xì)胞；如果使用0.4cm電擊杯，則加入80l感受態(tài)細(xì)胞。輕柔混勻，冰上孵育5min。 若使用0.2cm電擊杯，則設(shè)置MicroPulser程序?yàn)椤癝c2”；若使用0.4cm電擊杯，則設(shè)置程序?yàn)椤癝c4”。 轉(zhuǎn)移DNA-細(xì)胞混合物樣本至選定的且用冰預(yù)冷的電擊杯中，輕彈電擊杯使樣本落于電擊杯底部。將電擊杯放入電擊腔滑槽。將滑槽推入電擊腔直至電擊杯固定于電擊腔的接觸電極間。電擊一次。 從電擊腔中移出電擊杯，立即加入1ml冰預(yù)冷的1M山梨醇。輕柔轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至一個(gè)無菌管中。 檢

32、查和記錄脈沖參數(shù)。時(shí)間常數(shù)應(yīng)接近5ms。電場(chǎng)強(qiáng)度可以通過實(shí)際電壓（kV）/電擊杯間隙寬度（cm）獲得。 在含有1M山梨醇的篩選平板上涂平板。30培養(yǎng)48-72小時(shí)。5.3 電轉(zhuǎn)化所需溶液和試劑 YPD：10g yeast extract，20g peptone，溶于900ml水，高壓滅菌。使用前加入100ml無菌葡萄糖。 1M山梨醇：182.2g山梨醇，溶于800ml水，定容至1L。高壓滅菌。 20%葡萄糖：20g葡萄糖，溶于60ml水。定容至100ml。0.22m濾膜過濾除菌。6、 畢赤酵母（Pichia pastoris）的電轉(zhuǎn)化6.1 感受態(tài)細(xì)胞的制備參考Cregg & Russell（

33、1998）的文獻(xiàn)獲取更多信息。 用2.8L三角培養(yǎng)瓶裝500ml YPD培養(yǎng)基，向其中接種0.1-0.5ml（原文為an aliquot一小份，未規(guī)定具體接種量）過夜菌液。畢赤酵母在30條件下的的倍增時(shí)間大約為2小時(shí)。 30過夜培養(yǎng)，300rpm，至細(xì)胞密度為5-7107cells/ml（OD600=？）。 將細(xì)胞倒入2個(gè)250ml無菌離心瓶中，4、3000g離心5min。 小心倒掉上清液。 向每個(gè)離心瓶中加入50ml無菌YPD/HEPES，斡旋以重懸細(xì)胞沉淀；加入1.25ml 1M DTT至每個(gè)離心瓶中，輕柔混勻。30孵育15min。 用200ml無菌、冰預(yù)冷的1M山梨醇重懸細(xì)胞沉淀。4、3

34、000g離心5min。倒去上清。 用50ml無菌、冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液斡旋重懸細(xì)胞，用無菌、冰預(yù)冷的1M山梨醇調(diào)節(jié)溶液體積至250ml。4、3000g離心5min。倒去上清液。 用10ml無菌、冰預(yù)冷的1M山梨醇重懸細(xì)胞，匯總轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至一個(gè)預(yù)冷的30ml Oakridge管。4、3000g離心5min。小心倒去上清液。 用0.5ml無菌、冰預(yù)冷的1M山梨醇溶液重懸細(xì)胞沉淀。最終的細(xì)胞體積約1.3ml，細(xì)胞濃度約1109cells/ml。將細(xì)胞置于冰上并盡快使用。5.2 電轉(zhuǎn) 吸取待轉(zhuǎn)化的DNA樣品（可多達(dá)10ug）至一個(gè)1.5ml無菌EP管，置于冰上預(yù)冷。 加入40l感受態(tài)細(xì)胞每個(gè)DNA

35、樣本，輕柔混勻。 設(shè)置MicroPulser程序?yàn)椤癙ic”。 轉(zhuǎn)移DNA-細(xì)胞混合物樣本至冰預(yù)冷的0.2cm電擊杯中，輕彈電擊杯使樣本落于電擊杯底部。將電擊杯放入電擊腔滑槽。將滑槽推入電擊腔直至電擊杯固定于電擊腔的接觸電極間。電擊一次。 從電擊腔中移出電擊杯。當(dāng)用營養(yǎng)缺陷突變株進(jìn)行互補(bǔ)篩選時(shí)，立即加入1ml冰預(yù)冷的1M山梨醇。若用抗性篩選方法，則立即加入1ml冰預(yù)冷的YPD/山梨醇。輕柔轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至一個(gè)無菌管中。 檢查和記錄脈沖參數(shù)。時(shí)間常數(shù)應(yīng)接近5ms。電場(chǎng)強(qiáng)度可以通過實(shí)際電壓（kV）/電擊杯間隙寬度（cm）獲得。 用營養(yǎng)缺陷突變株進(jìn)行互補(bǔ)篩選時(shí)，細(xì)胞應(yīng)立即涂布至含有1M山梨醇的限定瓊脂

36、平板（minimal agar plate）上。當(dāng)用抗性篩選方法時(shí)，電轉(zhuǎn)后的細(xì)胞在30振蕩培養(yǎng)1-2小時(shí)；在含有1M山梨醇的YPD瓊脂平板上，用適當(dāng)?shù)目股剡M(jìn)行電穿孔細(xì)胞的培養(yǎng)。30培養(yǎng)72-96小時(shí)。5.3 電轉(zhuǎn)化所需溶液和試劑 YPD/HEPES：100ml YPD培養(yǎng)基，20ml 1M HEPES，pH8.0。 1M DTT：1.55g DTT，溶于8ml水，定容至10ml，過濾除菌。 YPD/山梨醇：10g yeast extract，20g peptone，182.2g山梨醇，溶于700ml水，定容至900ml。高壓滅菌。臨用前加入100ml無菌20%葡萄糖。References1.

37、 Allen, S.P. and Blaschek, H.P., Factors involved in the electroporation- induced transformation of Clostridium perfringens, Appl. Environ. Microbiol., 54, 2322 (1990).2. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith, J.A., and Struhl, K.(eds.) Current Protocols in Mole

38、cular Biology, John Wiley & Sons, NY (1987).3. Becker, D.M. and Guarente, L., High-efficiency transformation of yeast by electroporation, Methods Enzymol., 194, 182 (1991).4. Bttger, E. C., High-efficiency generation of plasmid cDNA libraries using electro-transformation, BioTechniques, 6, 878 (1988

39、).5. Chang, D.C., Chassy, B.M., Saunders, J.A., and Sowers, A.E. (eds.) Guide to Electroporation and Electrofusion, Academic Press, Inc., San Diego (1992).6. Cregg, J.M. and Russell, K.A., Transformation, in Methods in Molecular Biology, 103, Higgins, D.R. and Cregg, J.M. (eds.), Humana Press, Totow

40、a, NJ, 27 (1998).7. Cruz-Rodz, A.L. and Gilmore, M.S., High efficiency introduction of plasmid DNA into glycine treated Enterococcus faecalis by electroporation, Mol. Gen. Genet., 224, 152 (1990).8. Dennis, J.J. and Sokol, P.A., Electrotransformation of Pseudomonas, in Methods in Molecular Biology,

41、47, Nickoloff, J.A., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 125 (1995).9. Dower, W. J., Electroporation of bacteria: a general approach to genetic transformation, in Genetic EngineeringPrinciples and Methods, 12, Plenum Publishing Corp., NY, 275 (1990).10. Dower, W. J., Miller, J. F., and Ragsdale, C. W., H

42、igh efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation, Nuc. Acids Res., 16, 6127 (1988).11. Dower, W.J., Chassy, B.M., Trevors, J.T., and Blaschek, H.P., Protocols for the transformation of bacteria by electroporation, in Guide to Electroporation and Electrofusion, Chang, D. C., C

43、hassy, B. M., Saunders, J. A., and Sowers, A. E. (eds.), Academic Press Inc., 485, San Diego (1992).12. Heery, D. M., and Dunican, L. K., Improved efficiency M13 cloning using electroporation, Nuc. Acids Res., 17, 8006 (1989).13. Holo, H. and Nes, I.F., Transformation of Lactococcus by electroporati

44、on, in Methods in Molecular Biology, 47, Nickoloff, J.A. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ, 195 (1995).14. Howard, P.K., Ahern, K.G., and Firtel, R.A., Establishment of a transient expression system for Dictyostelium discoideum, Nuc. Acids Res., 16, 2613 (1988).15. Jacobs, M., Wnendt, S., and Stahl, U

45、., High-efficiency electro-transformation of Escherichia coli with DNA from ligation mixtures, Nuc. Acids Res., 18, 1653 (1990).16. Knecht, D. and Pang, K.M., Electroporation of Dictyostelium discoideum, in Methods in Molecular Biology, 47, Nickoloff, J.A., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 321 (1995).

46、17. Lee, J.C., Electrotransformation of Staphylococci, in Methods in Molecular Biology, 47, Nickoloff, J.A., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 209 (1995).18. Leonardo, E. D., and Sedivy, J. M., A new vector for cloning large eukaryotic DNA segments in Escherichia coli, Bio/Technol., 8, 841 (1990).19. L

47、in, J.-J., Electrotransformation of Agrobacterium, in Methods in Molecular Biology, 47, Nickoloff, J.A., ed., Humana Press, Totowa, NJ, 171 (1995).20. Miller, E.M. and Nickoloff, J.A., Escherichia coli electrotransformation, in Methods in Molecular Biology, 47, Nickoloff, J.A., ed., Humana Press, To

48、towa, NJ, 105 (1995).21. Nickoloff, J.A. (ed.) Methods in Molecular Biology, 47, Humana Press, Totowa, NJ, (1995). 22. Park, S.F. and Stewart, G.S.A.B., High efficiency transformation of Listeria monocytogenes by23. electroporation of penicillin-treated cells, Gene, 94, 129 (1990).24. Prentice, H.L.

49、, High efficiency transformation of Schizosaccharomyces pombe by electroporation, Nuc. Acids Res., 20, 621 (1991).25. Shigekawa, K. and Dower, W.J., Electroporation of eukaryotes and prokaryotes: A general approach to the introduction of macromolecules into cells, Biotechniques, 6, 742 (1988).26. Siguret, V., Ribba, A.-S., Cherel, G., Meyer, D., and Pieru, G., Effect of plasmid size on transformation efficiency by electrtoporation of Escherichia coli DH5, Biotechniques, 16, 4