SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離大腸桿菌全蛋白.ppt

1、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離大腸桿菌全蛋白,實驗六,LOGO,Your site here,實驗目的,學習SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理； 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質的操作技術（基礎性很強，使用范圍廣泛）； 學習蛋白質的考馬斯亮藍染色鑒定。,LOGO,Your site here,實驗原理,聚丙烯酰胺凝膠: 是由單體丙烯酰胺(Acr)和交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑N，N，N，N四甲基乙二胺(TEMED)和過硫酸銨(AP)或核黃素的作用下聚合交聯(lián)成三維網(wǎng)狀結構的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。 AP提供自由基，TEMED是催化劑

2、，催化自由基引起的聚合反應進行。,LOGO,Your site here,實驗原理,（聚丙烯酰胺）,LOGO,Your site here,實驗原理,LOGO,Your site here,聚丙烯酰胺凝膠有下列特性：,凝膠透明，有彈性，機械性能好； 化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應； 對pH和溫度變化較穩(wěn)定,幾乎無吸附和電滲作用； 樣品用量少，靈敏度可達10-6g; 凝膠孔徑可調節(jié)； 分辨率高。,LOGO,Your site here,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進SDS（十二烷基磺酸鈉）； 蛋白質在一定濃度的含有強還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結合，形

3、成帶負電荷的SDS-蛋白質復合物。,LOGO,Your site here,由于十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了原蛋白質分子的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別，SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改變，蛋白質SDS復合物形成近似“雪茄煙”形的長橢圓棒。 因此在進行電泳時，蛋白質分子的電泳遷移率主要取決于它的分子量，而與所帶電荷和形狀無關。因此，可以利用SDS-PAGE測定蛋白質分子量。,LOGO,Your site here,凝膠系統(tǒng)的分類,連續(xù)性凝膠電泳,不連續(xù)凝膠電泳,連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒

4、在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。,不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應。,LOGO,Your site here,實驗原理,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的三種效應,濃縮效應 電荷效應 分子篩效應,LOGO,Your site here,濃縮效應,不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠組成: 濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.8的Tris-HC1; 分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.8的Tris-HC1; 電極緩沖液是pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液。,

5、LOGO,Your site here,濃縮效應-1（凝膠孔徑的不連續(xù)性）,濃縮膠的凝膠濃度較小，孔徑較大，把較稀的樣品加在濃縮膠上，樣品的移動速度較快，最終使樣品“堆積”在濃縮膠和分離膠之間而被濃縮至一個狹窄的區(qū)帶，大大提高了電泳的靈敏度。,LOGO,Your site here,在pH6.8的凝膠緩沖體系中： 前導離子或快離子：HCl (解離）Cl，Cl泳動速度最快; 尾隨離子(trailing ion)或慢離子： CH2(NH2)COOH CH2(NH2)COO，泳動速度最慢; 蛋白質（P）泳動速度介于快慢離子之間； 電泳時，Cl超過P走在最前面，其后形成一個離子濃度較低的低電導區(qū)較高電

6、位梯度P和慢離子加速移動P壓縮成層； mclclmppmGG(Cl代表氯離子，P代表蛋白質，G代表甘氨酸根離子)，有效遷移率=m，m為遷移率，為解離度。 當進入pH8.8的分離膠時 甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質時，不再形成高電壓。,濃縮效應-2（緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性 ）,LOGO,Your site here,實驗原理,考馬斯亮藍是一種染料，和蛋白質結合呈藍色。 G250用來測定蛋白質含量；R250用來對電泳條帶染色。,LOGO,Your site here,SDS-PAGE,LOGO,Your site here,實驗方法,分離膠的制備,濃縮膠的制備,加樣,待分離樣

7、品的準備,電泳,染色,脫色,LOGO,Your site here,分離膠的制備,置小燒杯中,混勻,迅速用移液器滴入二塊玻璃板之間(短玻璃朝外),凝膠加至橫板的2/3； 用滴管加少許水，在室溫中聚合20-30分鐘。 注意：acr/bis有神經毒/制膠時避免產生氣泡,LOGO,Your site here,濃縮膠的制備,將分離膠上層的水倒去，并用濾紙擦干 置小燒杯中，混勻，迅速加入配制好的濃縮膠溶液至接近短玻璃的頂端，插入加樣梳, 聚合30分鐘；,LOGO,Your site here,加樣,樣品制備：取大腸桿菌培養(yǎng)物1ml，6000rpm離心5分鐘，棄上清，用100ul蒸餾水重懸，加25ull

8、oading buffer沸水煮沸5分鐘，10000rpm離心5min； 聚合后，將凝膠板取出，置于電泳槽中，短玻璃朝內，加入電泳緩沖液，小心拔去加樣梳，用微量進樣器吸取10ul樣品，加入凝膠的每個凹槽中。 注意：加樣前先倒入電泳緩沖液，沒過短玻璃；上樣時不要扎破加樣孔，也要避免樣品溢出。,LOGO,Your site here,電泳,在電泳槽中注入Tris-甘氨酸緩沖液，樣品端接負極(短玻璃的一邊)，電壓控制在180V，電泳約11.5小時,溴酚藍距離分離膠底端1cm。,LOGO,Your site here,染色和脫色,染色：電泳結束后，撬開玻璃板，將凝膠板做好標記后放在大培養(yǎng)皿內，加入染色液，染色30min； 脫色：染色后的凝膠板用蒸餾水漂洗數(shù)次，再用脫色液脫色20min，更換脫色液過夜 。 剝膠時要小心，保持膠完好無