植物基因組DNA的提取.ppt

1、植物基因組DNA的提取及純度與含量的測定,實(shí)驗(yàn)八,第一部分,植物基因組DNA的提取,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、學(xué)習(xí)并掌握植物基因組DNA的提取原理和方法； 2、了解瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸的原理和操作； 3、學(xué)習(xí)并掌握對電泳檢測基因組DNA結(jié)果的初步分析。,二、實(shí)驗(yàn)基本原理 植物基因組DNA的提取方法就其提取原理主要有二種：十六烷基三乙基溴化銨（CTAB)法、十二烷基硫酸鈉 (SDS)法。十六烷基三甲基溴化銨和十二烷基硫酸鈉等離子型表面活性劑，能溶解細(xì)胞膜和核膜蛋白，使核蛋白解聚，從而使DNA得以游離出來。再加入苯酚和氯仿等有機(jī)溶劑，能使蛋白質(zhì)變性，并使抽提液分相，因核酸(DNA、RNA)水溶性很

2、強(qiáng)，經(jīng)離心后即可從抽提液中除去細(xì)胞碎片和大部分蛋白質(zhì)。上清液中加入無水乙醇使DNA沉淀，沉淀DNA溶于TE溶液中，即得植物基因組 DNA溶液。 由于植物中的次生代謝產(chǎn)物多酚類化合物可介導(dǎo)DNA降解，而多糖的污染也是影響植物核酸純度最常見的問題，這些多糖能抑制限制酶、連接酶及DNA聚合酶等分子生物學(xué)酶類的生物活性。傳統(tǒng)的CTAB-DNA提取法步驟多，較煩瑣，DNA產(chǎn)率低，而且由于酚很難完全去除，容易影響以后的酶切等工作的效率。SDS法操作簡單，溫和,也可提取到較高分子量DNA，但所得產(chǎn)物含糖類雜質(zhì)較多,這將直接影響DNA的限制性核酸內(nèi)切酶酶切效果。由于植物細(xì)胞勻漿含有多種酶類(尤其是氧化酶類)對

3、DNA的抽提產(chǎn)生不利的影響，在抽提緩沖液中需加入抗氧化劑或強(qiáng)還原劑(如巰基乙醇)以降低這些酶類的活性。 本實(shí)驗(yàn)采用十二烷基硫酸鈉 (SDS)法提取植物基因組DNA，基因組DNA提取后， 通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定基因組DNA分子量大小、純度；用紫外吸收法測定基因組DNA純度與含量。,DNA的瓊脂糖凝膠電泳鑒定: DNA分子在瓊脂糖凝膠中有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。DNA分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，它在電場中向正極移動(dòng)。在一定的電場強(qiáng)度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng)，即具有不同的相對分子量的DNA片段泳動(dòng)速度不同。DNA片斷在凝膠中當(dāng)用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙錠（EB）染色后，在紫外光

4、下可見橙紅色帶，并可確定DNA片斷在凝膠中的位置。,影響DNA泳動(dòng)速率（遷移率）的因素有： DNA分子質(zhì)量的影響：雙鏈DNA分子遷移的速率與DNA分子量對數(shù)成反比。分 子量越大，遷移率越小。 DNA構(gòu)型的影響：超螺旋DNA線狀DNA開環(huán)DNA 膠濃度的影響： 濃度越低，相同核酸分子遷移越快，一般常用的凝膠濃度 為12； 電場強(qiáng)度的影響：電場強(qiáng)度愈大，帶點(diǎn)顆粒的泳動(dòng)越快。但凝膠的有效分 離范圍隨著電壓增大而減小，所以電泳時(shí)一般采用低電壓，（一般5V/cm） （電場強(qiáng)度） 。而對于大片段電泳，甚至用0.51.0V/cm電泳過夜。進(jìn)行 高壓電泳時(shí)，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。 EB的影響：溴化乙錠（EB

5、）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增 加。 電泳緩沖液的影響:核酸電泳常采用TAE、TBE、TPE三種緩沖系統(tǒng)，但它們 各有利弊。TAE價(jià)格低廉，但緩沖能力低，必須進(jìn)行兩極緩沖液的循環(huán)。 TPE在進(jìn)行DNA回收時(shí)，會(huì)使DNA污染磷酸鹽，影響后續(xù)反應(yīng)。所以多采用 TBE緩沖液。在緩沖液中加入EDTA，可以鰲合二價(jià)離子，抑制DNase，保護(hù) DNA。緩沖液pH常偏堿性或中性，此時(shí)核酸分子帶負(fù)電，向正極移動(dòng)。 堿基組成與電泳溫度的影響: 一般影響不大,在DNA提取過程中必須始終注意以下幾個(gè)關(guān)鍵問題： （1）DNA的二級結(jié)構(gòu)和雙鏈易受多種因素（如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、加熱、低鹽濃度、有機(jī)溶劑、酰胺類、

6、尿素等）的影響引起雙鏈解開，即“變性”，因此抽提時(shí)避免使用變性的條件。 （2）抑制內(nèi)外源DNase的活力。DNase就象一把刀，它能把大分子的DNA切成碎片，所以要加以杜絕，現(xiàn)可以通過多種途徑來做到這一點(diǎn)：a、低溫操作；b、調(diào)節(jié)pH，使偏堿（pH8.0）；c、抽提液中加表面活性劑；d、加螯合劑（EDTA）除去酶的鋪助因子（Mg2+），使酶活性喪失。 （3）防止化學(xué)降解。如過酸或過堿以及其它化學(xué)因素，會(huì)使DNA降解，一般綜合考慮，取pH8.0左右為宜。 （4）防止物理因素降解。如溫度太高或機(jī)械張力剪切等，DNA分子特別大，極易被機(jī)械張力拉斷，甚至在細(xì)管中稍急一些的流動(dòng)也會(huì)使DNA斷裂，所以在抽提

7、過程中要特別注意這一點(diǎn)，操作過程要盡量簡便、溫和、減少攪拌次數(shù)，也不要?jiǎng)×覔u動(dòng)。 （5）植物的次生代謝物（主要是胞質(zhì)內(nèi)的多酚類或色素類化合物）對核酸提取有干擾作用。因此，一般盡可能選幼嫩的、代謝旺盛的新生組織作為提取DNA的材料，這是因幼嫩的新生組織次生代謝物較少，DNA含量高，且易于破碎，植物材料最好是新鮮的。,三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑 1、實(shí)驗(yàn)材料：植物幼嫩葉子 2、實(shí)驗(yàn)試劑 （1）基因組DNA提取緩沖液 （2）氯仿:異戊醇:乙醇抽提液 （3）TE緩沖液 （4）平衡酚： （5）RNA酶A （6）酚/氯仿 （7）氯仿/異戊醇 （8）異丙醇、無水乙醇、70%乙醇。 （9） 3mol/L NaAc （

8、10） 5TBE緩沖液 （11） 6電泳上樣緩沖液 （12） 1.0%瓊脂糖凝膠 （13） EB,（14） DNA分子量Markers： 125，564，2027，2322，4361，6557，9416，23130bp.,四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器 1、研體 2、離心機(jī)、離心管（7ml）及離心管架； 3、微量移液器：10ul、1000ul； 4、恒溫水浴箱65 5、制冰機(jī)； 6、冰箱； 7、恒溫水浴箱 37； 8、微波爐； 9、電泳儀及電泳槽； 10、紫外檢測儀。,五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟,置于預(yù)熱到65的研體中，加少許石英砂；加入預(yù)熱到65的核酸提取緩沖液3ml,稱取植物幼嫩葉子0.5g,迅速研成勻漿

9、,轉(zhuǎn)移到7ml帶蓋離心管中,65水浴保溫1hr，其間經(jīng)常輕柔搖動(dòng),加入3ml氯仿-異戊醇-乙醇溶液,輕柔顛倒混勻后， 室溫靜置分層5min,離心5,000g5min,上清液轉(zhuǎn)移到干凈7ml離心管中， 記錄體積，棄沉淀，*,加入等體積異丙醇試劑， 混和后靜置20min沉淀DNA,4離心5,000g3 min收集絮狀沉淀,加入3mlTE，65水浴中助溶15min，使之完全溶解,加入等體積的平衡酚，輕柔顛倒混勻，室靜置10min,4離心12,000g10min,轉(zhuǎn)移上清于新7ml離心管中，記錄體積*,加入1/2體積的平衡酚與1/2體積的氯仿，輕柔顛倒混勻，室溫放置15min,4離心（12,000g，

10、5min）,吸取上清轉(zhuǎn)移到一新7ml離心管中，記錄體積*,加入等體積的氯仿，顛倒混勻，室溫放置5min,4離心（12,000g，10min）,吸取上清轉(zhuǎn)移到一新7ml離心管中，記錄體積*,加入5l RNase（5g/l），37 保溫10min,加入1/10體積3mol/L NaAC和2體積20預(yù)冷的無水乙醇20放置20min *,4離心（5,000g，3min）收集沉淀*,用70%乙醇洗滌沉淀，傾倒掉乙醇溶液，干燥，讓酒精完全揮發(fā),用1mlTE溶解沉淀，即為植物基因組DNA溶液*,凝膠電泳檢測基因組DNA（分子量大小、純度）,4保存?zhèn)溆?說明：如果蛋白質(zhì)和RNA未去除干凈，重復(fù)酚，酚/氯仿，氯

11、仿抽提步驟，繼續(xù)用RNase處理，乙醇沉淀和洗滌，重溶于TE中，直至基因組DNA純度和質(zhì)量符合要求。,（一） 植物基因組DNA的提取,紫外吸收法測定基因組DNA純度與含量,*植物基因組DNA的提取操作過程現(xiàn)象,*植物基因組DNA的提取操作過程現(xiàn)象,1、制膠（1瓊脂糖凝膠） 在膠模上架好梳子。稱取01g瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加100ml 0.5TBE電泳緩沖液，加熱熔化至無顆粒狀瓊脂糖，待其冷卻至5060后，加入EB，使其終濃度為0.5mg/L，搖勻后立即倒入準(zhǔn)備好的膠模中，待膠凝固后，放入電泳槽中，倒入適量0.5TBE（剛好淹過膠面），拔去梳子備用。（注：EB為誘變劑、致癌物，接觸凝

12、膠必須戴手套操作） 2、加樣 取5ul純化的DNA原溶液樣品，與1ul 6電泳加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中（注：勿劃破或戳穿加樣孔，勿帶入氣泡）。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個(gè)樣品要換槍頭以防互相污染。注意上樣時(shí)要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。 3、電泳 加完樣后，蓋上電泳槽蓋，立即接通電源，使電壓調(diào)到100V，恒壓電泳。當(dāng)溴酚藍(lán)條帶移動(dòng)到距凝膠前緣約2cm時(shí)，停止電泳（約需3060min）。 4、觀察和拍照 取出膠塊置于紫外燈下觀察，DNA存在處可顯示出肉眼可辨的橘紅色熒光帶，再用成像儀進(jìn)行拍照，以便于分析。

13、（注：紫外光對眼睛有害，觀察時(shí)戴上防護(hù)鏡或眼鏡，或隔著玻璃或有機(jī)玻璃觀察）。,（二）瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA,第二部分,基因組DNA純度與含量的測定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?1、學(xué)習(xí)紫外吸收法測定核酸基本原理和方法； 2、學(xué)習(xí)并掌握紫外吸收法測定基因組DNA純度與含量的方法。,二、實(shí)驗(yàn)基本原理 核酸DNA和RNA所含堿基的苯環(huán)結(jié)構(gòu)（嘌呤環(huán)和嘧啶環(huán)）的共軛雙鍵具有紫外吸收的性質(zhì)，它們在260nm處有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波長進(jìn)行核酸含量的測定。 波長為260nm時(shí)，DNA或RNA的光密度的大小不僅與總含量有關(guān)，也與它們的不同構(gòu)型而有差異。 對標(biāo)準(zhǔn)樣品來說，濃度為1g / ml時(shí)，

14、DNA鈉鹽的OD2600.02。 當(dāng)OD2601時(shí)，雙鏈DNA含量約為50g / ml 單鏈DNA含量約為37g / ml RNA含量約為40g / ml 寡核苷酸含量約為30g / ml（由于底物不同有差異） 1、核酸樣品DNA、RNA含量的測定： 如用1cm光徑石英比色皿，用 H2O稀釋DNA或RNA樣品n倍并以H2O為空白對照，根據(jù)此時(shí)讀出的OD260值即可計(jì)算出樣品稀釋前DNA的含量： DNA（g/l）=50OD260讀數(shù) DNA樣品稀釋倍數(shù)/1000 RNA（g/l）=40OD260讀數(shù) RNA樣品稀釋倍數(shù)/1000 若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無法用分光光度法對核酸進(jìn)行定量，可

15、使用溴化乙錠法或其他方法進(jìn)行估算。,當(dāng)DNA樣品中含有蛋白質(zhì)、酚或其他小分子污染物時(shí)，會(huì)影響DNA吸光度的準(zhǔn)確測定。由于 DNA在260nm處有最大的吸收峰，蛋白質(zhì)在280nm處有最大的吸收峰，鹽和小分子則集中在230nm處。所以，一般情況下同時(shí)檢測同一樣品的OD260、OD280和OD230，計(jì)算它們的比值來判斷核酸樣品的純度。 2、核酸樣品純度判斷的一般標(biāo)準(zhǔn)： DNA純度：OD260/OD2801.8，表示為純的DNA； OD260/OD280 1.9，表示有RNA污染； OD260/OD280 1.6，表示有蛋白質(zhì)、酚等污染。 RNA純度：1.7 OD260/OD2802.0，表示為純的

16、RNA； OD260/OD280 1.7時(shí)，表示有蛋白質(zhì)或酚污染； OD260/OD280 2.0時(shí)，表示可能有異硫氰酸殘存。 OD230/OD260的比值應(yīng)在0.4-0.5之間，若比值較高說明有殘余的鹽和小分子如核苷酸、氨基酸、酚等的存在。 若樣品不純，則比值發(fā)生變化，此時(shí)無法用分光光度法對核酸進(jìn)行定量；同時(shí)也會(huì)影響酶切和PCR的效果。,三、實(shí)驗(yàn)材料與試劑 1、實(shí)驗(yàn)材料 植物基因組DNA樣品 2、實(shí)驗(yàn)試劑 ddH2O； TE緩沖液（pH 8.0）。 四、實(shí)驗(yàn)器材與儀器 1、離心機(jī)、離心管（5ml）及離心管架； 2、微量移液器10ul、200ul、1000ul及槍頭； 3、紫外分光光度計(jì)； 4

17、、石英比色皿（0.5cm光徑）或1cm光徑的微量石英比色皿（50ul、100ul）。,五、實(shí)驗(yàn)操作方法和步驟 方法1： 將提取的植物基因組DNA樣品吸取20ul，加到新的5ml離心管中，再加一定量的ddH2O 或TE緩沖液（pH 8.0）稀釋100倍，用0.5cm光徑石英比色皿（約需1.6ml樣品溶液）或微量石英比色皿在紫外分光光度計(jì)上測定230nm、260nm、280nm處的吸光度。計(jì)算植物基因組DNA樣品溶液的DNA的含量以及DNA樣品的純度。 方法2： 直接取植物基因組DNA樣品微量原液（12ul)，用分光光度計(jì)進(jìn)行自動(dòng)測定出230nm、260nm、280nm處的吸光度值，計(jì)算植物基因組DNA樣品溶液的DNA的含量以及DNA樣品的純度。, 用TE調(diào)0（空白）：, 取植物基因組DNA樣品原液12ul，進(jìn)行自動(dòng)測定230nm、260nm、280nm處的吸光度值：,六、計(jì)算 1、植物基因組DNA樣品溶液的DNA的含量： DNA（g/