從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實驗方案

1、土壤中產(chǎn)淀粉酶芽胞桿菌的篩選及其淀粉酶活力的測定設(shè)計性實驗方案一、綜述： 淀粉酶是淀粉降解酶。它們廣泛存在于微生物、植物和動物體中。它們將淀粉及相關(guān)的聚合物分解為帶有具體淀粉分解酶特征的產(chǎn)品。淀粉酶廣泛存在于動植物和微生物中,是最早用于工業(yè)生產(chǎn)并且迄今仍是用途最廣、產(chǎn)量最大的酶制劑產(chǎn)品之一。淀粉酶種類繁多,特點(diǎn)各異,可應(yīng)用于造紙、印染、釀造、果汁和食品加工、醫(yī)藥、洗滌劑、工業(yè)副產(chǎn)品及廢料的處理、青貯飼料及微生態(tài)制劑等多種領(lǐng)域。在釀造發(fā)酵工業(yè)如酒精生產(chǎn)、啤酒制造、發(fā)酵原料液化及糖化工藝過程中均有重要價值,如添加淀粉酶分布非常廣泛，是人們經(jīng)常研究的一種酶。從紡織工業(yè)到廢水處理，這些酶都有不同規(guī)模的

2、應(yīng)用【1】。常見產(chǎn)淀粉酶的主要為芽孢桿菌屬。其中的常見產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌菌種有：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和納豆芽孢桿菌【2】、凝結(jié)芽孢【3】。由于芽孢桿菌屬是一類好氧或兼性厭氧、產(chǎn)生抗逆性內(nèi)生抱子的桿狀細(xì)菌，許多為腐生菌，主要分布于土壤和植物體表面及水體中【4】。所以此次實驗從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌。二、實驗?zāi)康囊?了解生物分離提純的原理和方法技術(shù)2掌握從土壤中篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的原理和方法3.掌握微生物搖瓶培養(yǎng)方法及淀粉酶活力測定的原理和方法4.培養(yǎng)學(xué)生的綜合應(yīng)用微生物實驗方法的能力5.培養(yǎng)學(xué)生自行設(shè)計實驗流程、綜合分析問題解決問題和判斷實驗結(jié)果的能力。三、實驗原理自然

3、界中，土壤是微生物生活最適宜的環(huán)境。土壤具有微生物進(jìn)行生長繁殖和生命活動中所需的各種條件。土壤中微生物的數(shù)量因土壤類型、季節(jié)、土層深度與層次等不同而異。一般地說，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影響，微生物不易生存，離地表10 cm30 cm的土層中菌數(shù)最多，隨土層加深，菌的數(shù)量減少【5】。從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。平板分離法普遍用于微生物的分離與純化。其基本原理是選擇適合與待分離微生物的生長條件，如營養(yǎng)成分、酸堿度、溫度和氧等要求，或加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長，而抑制其他微生物生長的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物。值得指出的

4、是，從微生物群體中經(jīng)分離生長在平板上的單個菌落并不一定保證是純培養(yǎng)。因此，純培養(yǎng)的確定除觀察其菌落特征外，還要結(jié)合顯微鏡檢測個體形態(tài)特征后才能確定，有些微生物的純培養(yǎng)要經(jīng)過一系列分離與純化過程和多種特征鑒定才能得到。芽孢桿菌屬的共同特征是：革蘭氏陽性；接觸酶陽性；水解淀粉；VP試驗陽性；不產(chǎn)生吲哚；苯甲氨酸不脫氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不產(chǎn)生二羥丙酮；營養(yǎng)體的最高生長溫度大約從25到75以上；最低生長溫度大約5到45；生長最低pH值，從7.58到2左右；耐鹽范圍從低于2%的NaCl到25%NaCl；營養(yǎng)明膠（22）7天內(nèi)液化1厘米或1厘米以上。枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌在糖發(fā)酵試驗用阿拉伯糖

5、，木糖和甘露糖代替葡萄糖可產(chǎn)酸；作為營養(yǎng)生長的最低限培養(yǎng)基是無維生素的，但含有葡萄糖、檸檬酸鹽和一個氨態(tài)鹽作為唯一的碳源和氮源【6】。細(xì)菌特性1. 繁殖快速:代謝快、繁殖快，四小時增殖10萬倍，標(biāo)準(zhǔn)菌四小時僅可繁殖6倍。2. 生命力強(qiáng):無濕狀態(tài)可耐低溫-60、耐高溫+280，耐強(qiáng)酸、耐強(qiáng)堿、抗菌消毒、耐高氧(嗜氧繁殖)、耐低氧(厭氧繁殖)。3.體積大:體積比一般病源菌分子大四倍數(shù)，占據(jù)空間優(yōu)勢，抑制有害菌的生長繁殖。四、實驗材料和用具4.1 土樣采集：采集廣大植物園內(nèi)的有機(jī)土壤，和生化樓下花壇的有機(jī)土壤4.2 營養(yǎng)瓊脂(%)：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉0.5 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 將

6、除瓊脂以外的各成分溶解于蒸餾水內(nèi)，加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.27.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.3 淀粉牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(%)：可溶性淀粉0.2 牛肉0.3 蛋白1.0 氯化鈉0.5 瓊脂1.52.0 校正pH至7.27.44.4 發(fā)酵培養(yǎng)基(%)：玉米粉 2 黃豆餅粉 1.5 CaCl 0.02 MgSO4 0.02 NaCl 0.25 K2HPO4 0.2 檸檬酸鈉 0.2 硫酸氨0.075(溶解后加) Na2HPO40.2 校正pH值7.04.5 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基（V.P試驗用）（%）：葡萄糖0.5 蛋白胨0.5 K2HPO4 0.2 校正pH 7.27

7、.44.6 蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗用）（%）：蛋白胨1% 氯化鈉0.5% 校正pH 7.27.44.7 西蒙氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基（%）：氯化鈉0.5 硫酸鎂(MgSO47H2O)0.02 磷酸二氫銨0.1 磷酸氫二鉀0.1 檸檬酸0.5 瓊脂2 溴麝香草酚藍(lán)溶液4 酚紅試劑 校正pH6.8 先將鹽類溶解于水中，校正pH，再加入瓊脂，加熱融化，然后加入指示劑，混勻后分裝試管，121高溫滅菌15min。4.8 配制營養(yǎng)明膠培養(yǎng)基（%）：蛋白胨 0.5、牛肉膏0.3、明膠1.2，調(diào)pH 6.87.04.9耐鹽培養(yǎng)基（%）：蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉2 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0

8、.3 氯化鈉10 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉20 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 蛋白胨1 牛肉膏0.3 氯化鈉25 瓊脂1.5 2.0 蒸餾水 加入15%氫氧化鈉溶液約2mL，校正pH至7.27.4。加入瓊脂,加熱煮沸，使瓊脂溶化。4.10 溶液或試劑染料革蘭氏染色：草酸銨結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇;芽孢染色：5%孔雀綠溶液, 石炭酸復(fù)紅液; 香柏油、二甲苯吲哚試驗：乙醚、吲哚試劑V.P.試驗：40NaOH溶液、-奈酚，淀粉酶活力測定：1%3, 5- 二硝基水楊酸試劑4.11 儀器或其它用具無菌玻璃涂棒 無菌吸管 接種環(huán) 無菌培養(yǎng)皿 土樣 三角瓶 燒杯

9、洗瓶 玻棒 試管 酒精燈 擦鏡紙 接種環(huán) 酒精燈 載玻片 吸水紙等。恒溫?fù)u床 恒溫培養(yǎng)箱 高壓蒸汽滅菌箱 超凈工作臺 水浴箱 紫外燈照射箱 磁力攪拌器 玻璃珠 移液管 涂布器 顯微鏡五、實驗方法及步驟1、初篩方法制菌懸液：兩個土樣分別取5g，放入各自裝有45mL無菌水的三角瓶，振蕩10min,即為稀釋10-1的土壤懸浮液。每個環(huán)境的土樣裝1個錐形瓶，共2個，同時將其分為4組，編號AB。加熱篩選有芽孢的菌：將2個錐形瓶加塞、包扎、搖勻（無菌室里），利用恒溫水浴裝置100左右水浴，水浴鍋溫度恒定后維持15min（制懸液時就應(yīng)先開始加熱），制成10-1 g/ml的土壤懸液梯度稀釋菌懸液：再分別另取裝

10、有9mL無菌水試管5支，用記號筆編上10-2、10-3、10-4、10-5。取已稀釋成10-1土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌的移液器吸取1mL土壤懸液加入10-2的無菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕反復(fù)吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10-2土壤稀釋液。同法從10-2的試管中吸取1mL稀釋液加入編號為10-3的無菌水試管中，混勻后即為10-3土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為10-4、10-5土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來稀釋。涂布平板 用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后

11、的無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做3個平板（重復(fù)）。37下恒溫培養(yǎng)24h。2、復(fù)篩方法【1】劃線接種（分區(qū)劃線法）：在上述不同稀釋度培養(yǎng)基中挑取不同形態(tài)的單菌落進(jìn)行分區(qū)劃線，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約60角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用同法通過第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過第3次平行劃線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于2829C溫室中培養(yǎng)約20h.。再繼續(xù)分區(qū)劃線2-3次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種，另一部分用來做染色實驗。3、

12、獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點(diǎn)接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中，一個土樣取8個平板兩兩標(biāo)記同一位置同序號標(biāo)記，一平板分5個區(qū)域，點(diǎn)接重復(fù)兩次，在37培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。上述點(diǎn)接后的平板中取出一組四個分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實驗室，其他置于無菌室。實驗室里，四個平板均加入碘液，立即觀察記錄陽性和陰性菌落所在位置，并可同時記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽性菌的編號，利用另一組中的營養(yǎng)瓊脂平板上其對應(yīng)的菌落繼續(xù)劃線接種，培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài)特征不一致的菌落進(jìn)行編號，然后挑取部分出來進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)、大小、顏色一致且為桿菌的菌體，則將

13、其對應(yīng)的菌種劃線接種到新的營養(yǎng)瓊脂平板上，標(biāo)記，37下培養(yǎng)24h。否則繼續(xù)進(jìn)行劃線分離，培養(yǎng)后再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進(jìn)行芽孢染色。篩選出芽孢純種后進(jìn)行斜面接種。革蘭氏染色步驟：涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進(jìn)行脫色約1520秒，后立即用流水沖洗。復(fù)染：滴加番紅染色液，染35分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 鏡檢：油鏡觀察染色結(jié)果。芽孢染色染色鏡檢：取37培養(yǎng)1824h的枯草芽孢桿菌涂片，干燥，固定。于涂片上滴人35滴5%孔

14、雀綠水溶液。用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計算時間約45min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染l min，水洗。制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。（注：觀察芽孢的形狀和位置，查伯杰細(xì)菌手冊）4.斜面保存菌種貼標(biāo)簽 取各種無菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標(biāo)簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口23cm處。（每種菌接3管，標(biāo)上相同編號也要與平板上菌落編號相對應(yīng)）。進(jìn)行斜面接種操作，加塞、包扎好到37培養(yǎng)箱里培養(yǎng)24h。5、菌種的鑒定5.1所得的斜面菌種接種

15、到新的平板上培養(yǎng)以觀察篩選出的產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌菌落的大小、顏色、干濕情況、形態(tài) 、高度 、透明程度、邊緣、是否易被挑起、氣味等。然后進(jìn)行一系列的鏡檢革蘭氏染色、芽孢染色（具體步驟同上）觀察是否符合附表中芽孢桿菌的指標(biāo)5.2生理生化試驗溫度對菌種培養(yǎng)的影響；淀粉水解試驗；溫度對菌種的影響；明膠液化試驗；糖發(fā)酵試驗；乙酰甲基甲醇試驗(V.P試驗)；吲哚試驗；耐鹽性試驗；檸檬酸鹽利用試驗。溫度對微生物生長的影響 將牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基熔化倒平板。（培養(yǎng)基厚度為一般培養(yǎng)基的1.5 到2倍） 取30 套牛肉膏蛋白胨平板，分別進(jìn)行標(biāo)號。 在上述各平板中分別劃線接種不同的菌種，每個菌種重復(fù)接種六個平板。各取每

16、個菌種兩套平板倒置于4 （冰箱）、37（或者室溫），60下保溫培養(yǎng)24 小時，觀察細(xì)菌的生長狀況。（“”不生長，“+”生長較差 ， “+”生長一般，“+”生長良好。淀粉水解實驗以18-24h的純培養(yǎng)物，涂布接種于淀粉瓊脂斜面或平板（一個平板可分區(qū)劃“+“字接種，）或直接移種于淀粉肉湯中，于361培養(yǎng)24-48h，或于20培養(yǎng)5天。然后將碘試劑直接滴浸于培養(yǎng)表面，若為液體培養(yǎng)物，則加數(shù)滴碘試劑于試管中。立即檢視結(jié)果，陽性反應(yīng)（淀粉被分解）為瓊脂培養(yǎng)基呈深藍(lán)色、菌落或培養(yǎng)物周圍出現(xiàn)無色透明環(huán)、或肉湯顏色無變化。陰性反應(yīng)則無透明環(huán)或肉湯呈深藍(lán)色。淀粉水解系逐步進(jìn)行的過程，因而試驗結(jié)果與菌種產(chǎn)生淀粉酶

17、的能力、培養(yǎng)時間，培養(yǎng)基含有淀粉量和pH等均有一定關(guān)系。培養(yǎng)基pH必須為中性或微酸性，以pH7.2最適。淀粉瓊脂平板不宜保存于冰箱，因而以臨用時制備為妥。糖類發(fā)酵試驗（葡萄糖、木糖和乳糖發(fā)酵）用小砂輪輕輕切割發(fā)酵管沒有標(biāo)簽和標(biāo)識的另外一端，注意保留標(biāo)簽和糖的名稱。用接種針將各種桿菌分別接種于兩種發(fā)酵管內(nèi)，每種發(fā)酵管重復(fù)兩次，標(biāo)記，要與斜面菌種標(biāo)記相對應(yīng)。兩種發(fā)酵管各設(shè)一支不接種，作為空白對照。注意接種的整個過程中，不能人為的制造氣泡，若發(fā)酵管內(nèi)有氣泡，則輕輕甩動發(fā)酵管直至氣泡消失。若氣泡不能退去，則該管作廢應(yīng)重做一管。接種后，每一管外包一層無菌紙，以防污染。接種完畢后，將全部發(fā)酵管倒置于干凈小

18、燒杯內(nèi)，37培養(yǎng)24h。觀察記錄：與對照管比較，若接種培養(yǎng)液保持原有顏色，其反應(yīng)結(jié)果為陰性，表明該菌不能利用該種糖，記錄用“”表示；如培養(yǎng)液呈黃色，反應(yīng)結(jié)果為陽性，表明該菌能分解該種糖產(chǎn)酸，記錄用“”表示。培養(yǎng)液中的杜氏小管內(nèi)有氣泡為陽性反應(yīng)，表明該菌分解糖能產(chǎn)酸并產(chǎn)氣，記錄用“”表示；如杜氏小管內(nèi)沒有氣泡為陰性反應(yīng)，記錄用“”。乙酰甲基甲醇試驗(VP試驗) 標(biāo)記試管 ：取裝有葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)液的試管，編號。接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔至以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接菌，置37恒溫箱中，培養(yǎng)24h。 觀察記錄 取出以上試管，充分振蕩2min。每管分別加入40NaOH溶液1020滴，并加

19、等量-奈酚，振蕩試管，以使空氣中的氧溶入，置37恒溫箱中保溫1530min后，若培養(yǎng)液呈紅色，記錄為V.P.試驗陽性反應(yīng)（用“”表示）；若不呈紅色，記錄為V.P.試驗陰性反應(yīng)（用“”表示）。 吲哚試驗 試管標(biāo)記 取裝有蛋白胨水培養(yǎng)液的試管，編號。接種培養(yǎng) 以無菌操作分別接種少量菌苔到以上相應(yīng)試管中，空白對照管不接種，置37恒溫箱中培養(yǎng)24h。 觀察記錄 在培養(yǎng)液中加入乙醚12ml，經(jīng)充分振蕩使吲哚萃取至乙醚中，靜置片刻后乙醚層浮于培養(yǎng)液的上面，此時沿管壁緩慢加入510滴吲哚試劑（加入吲哚試劑后切勿搖動試管，以防破壞乙醚層影響結(jié)果觀察），如有吲哚存在，乙醚層呈現(xiàn)玫瑰紅色，此為吲哚試驗陽性反應(yīng)，否

20、則為陰性反應(yīng)，陽性用“”、陰性用“”表示。 耐鹽性試驗將分離獲得的細(xì)菌分別接種在NaCl濃度為2%，10%，20%，25%，的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,置37下培養(yǎng),觀察生長情況 7。檸檬酸鹽試驗取裝有西蒙斯氏檸檬酸鹽培養(yǎng)基的試管分別標(biāo)記待測菌種的編號和空白對照以無菌操作分別將少量菌苔接種于各支相應(yīng)的管中，然后置于37恒溫箱中培養(yǎng)24h。觀察結(jié)果，若培養(yǎng)基變藍(lán)色，則表明該菌能利用檸檬酸鹽作為碳源而生長，即為陽性反應(yīng)，以“”表示。若培養(yǎng)基仍為綠色則為陰性反應(yīng)，以“”表示【8】。6、產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌產(chǎn)淀粉酶活性的測定發(fā)酵：將初篩純菌種接種于30/250mL 種子培養(yǎng)基,37 、250r/min搖床培養(yǎng)過夜。種子液以2 %接種量接種于產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基50/500mL ,相同條件培養(yǎng)72h ,發(fā)酵8000r/min，離心10min