常見的生物化學與分子生物學實驗

1、.一動物組織蛋白質的提取【目的要求】1掌握動物組織蛋白質的提取方法。2了解動物組織蛋白質提取的原理?！緦嶒炘怼坑捎诘鞍踪|種類很多，性質上的差異很大，即或是同類蛋白質因選用材料不同使用方法差別也很大，且又處于不同的體系中，因此不可能有一個固定的程序適用各類蛋白質的分離。但多數(shù)分離工作中的關鍵部分基本手段還是共同的，大部分蛋白質均可溶于水、稀鹽、稀酸或稀堿溶液中，少數(shù)與脂類結合的蛋白質溶于乙醇、丙酮及丁醇等有機溶劑中。因此可采用不同溶劑提取、分離及純化蛋白質。蛋白質在不同溶劑中溶解度的差異主要取決于蛋白分子中非極性疏水基團與極性親水基團的比例，其次取決于這些基團的排列和偶極矩。故分子結構性質是不

2、同蛋白質溶解差異的內(nèi)因。溫度、ph、離子強度等是影響蛋白質溶解度的外界條件。提取蛋白質時常根據(jù)這些內(nèi)外因素綜合加以利用將細胞內(nèi)蛋白質提取出來，并與其它不需要的物質分開。但動物材料中的蛋白質有些以可溶性的形式存在于體液如血漿、消化液等中可以不必經(jīng)過提取直接進行分離。蛋白質中的角蛋白、膠原及絲蛋白等不溶性蛋白質，只需要適當?shù)娜軇┫慈タ扇苄缘陌殡S物，如脂類、糖類以及其他可溶性蛋白質，最后剩下的就是不溶性蛋白質。蛋白質經(jīng)細胞破碎后用水、稀鹽酸及緩沖液等適當溶劑將蛋白質溶解出來，再用離心法除去不溶物即得粗提取液?！驹噭┢鞑摹?實驗小鼠20.9nacl3動物組織蛋白裂解緩沖液tris 50mm，nac11

3、50mm ，edta 0.5mm ，dtt 1mm ，triton x-1001，去氧膽酸鈉0.5，sds 0.14，pmsf/異丙醇儲備液100mm，174mg/10ml于-20儲存5-20儲存的冰塊。精品.【操作步驟】1.頸椎脫白處死小鼠75酒精擦拭皮膚剪開腹部剪切肝臟組織稱取0.6g置于含預冷0.9nac16ml的平皿中。2.在平皿中剪碎肝臟組織并轉移到勻漿器中。3.在預冷的裂解緩沖液中添加pmsf/異丙醇儲備液20？l/2ml。4.迅速將2ml預冷的裂解緩沖液加入勻漿器中冰浴條件下充分研磨。5.將組織研磨液轉移到1.5ml的離心管中于4離心14000rpml0min。26.離心完畢吸取

4、上清液轉移至一新的1.5ml離心管中即為組織蛋白粗提取液。7.所獲蛋白提取液可保存于-20用于后續(xù)實驗或用考馬斯亮藍等方法進行蛋白質濃度測定后保存?zhèn)溆?。【注意事項】在整個制備過程中使組織始終處于冰浴狀態(tài)以防蛋白質的降解。實驗二蛋白質的定量bradford法【目的要求】掌握考馬斯亮藍coomassie brilliant blue法測定蛋白質含量的原理和方法?！緦嶒炘怼靠捡R斯亮藍法測定蛋白質濃度是利用蛋白質與染料結合的原理定量測定微量蛋白質濃度具有快速、靈敏的特點?？捡R斯亮藍g-250存在兩種不同的顏色形式紅色和藍色。當染料與蛋白質結合后由紅色轉變成藍色形式。蛋白質與g250的結合是通過范德華

5、力實現(xiàn)的，并且在一定濃度范圍內(nèi)二者的結合顯色符合朗伯-比爾定律。結合后的產(chǎn)物在595nm處具有最大吸收峰，通過對溶液的光吸收測定，可獲得與其結合蛋白質的量?！驹噭┢鞑摹?.考馬斯亮藍試劑考馬斯亮藍g-250100mg溶于25ml甲醇中加入800ml蒸餾水再加入100ml85磷酸精品.，用蒸餾水稀釋至1000ml濾紙過濾。2.標準蛋白質溶液1mg/ml牛血清白蛋白100mg加0.9nacl至100ml。3.試管及試管架吸管。4.比色計?！静僮鞑襟E】一、標準曲線的制備取5支試管編號按下表操作編號1號液、2號液、3號液、4號液、5號液、標準蛋白質溶液、0ml、0.20、40.60.81.01mg/m

6、l、0.9naclml、0.80.60.40.2蛋白質濃度200、400、600、800、1000ug/ml。另取6支試管編號為05按下表操作編號012345，1號液2號液3號液4號液5號液不同濃度蛋白質溶液ml 0.10.10.10.10.1 0.9naciml0.1考馬斯亮藍試劑ml555555蛋白質含量ug0204060801003混勻各管室溫下靜置10分鐘，于595nm處進行比色。二、繪制標準曲線以a595nm為縱坐標，標準蛋白質含量為橫坐標，在坐標紙上繪制標準曲線。三、測定未知樣品蛋白質濃度測定方法同上取適量未知樣品使其測定值在標準曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測定的a595nm值在標準曲

7、線上查出其相當于標準蛋白質的量從而計算出未知樣品的蛋白質濃度?！咀⒁馐马棥?在考馬斯亮藍試劑加入后的520分鐘內(nèi)測定光吸收因為在此段時間內(nèi)顏色最穩(wěn)定。2測定中蛋白一染料復合物會有少量吸附于比色杯壁上實驗證明此復合物的吸附量是可以忽略的測定后可用乙醇將比色杯洗干凈。實驗三sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳【目的要求】1.了解并掌握sds-page電泳原理及方法。2.掌握垂直板電泳的操作方法。【實驗原理】十二烷基硫酸鈉sds-聚丙烯酰胺凝膠page電泳，可根據(jù)蛋白質分子大小的差別分離蛋白質精品.，并可測定蛋白質的相對分子量，其原理主要與電泳過程中存在的特殊物理效應有關1凝膠的分子篩效應，聚丙烯酰胺凝膠是在

8、催化劑的作用下聚合而成的具有網(wǎng)狀立體結構的微孔凝膠蛋白質顆粒，在電場中通過此凝膠時會受到阻礙。大分子蛋白質受到的阻力大，電泳速度小，而小分子蛋白質受到的阻力小，移動快。因而最終在凝膠中得以分離。2電荷效應，sds是一種表面活性劑，在蛋白樣品和page凝膠中加入sds則能與蛋白質分子上的疏水基團結合，使蛋白質表面覆蓋一層sds分子。由于十二烷基硫酸根帶有大量負電荷，且電荷量遠遠超過蛋白質分子原有的帶電量，因而掩蓋了蛋白質分子本身的電荷差別，使各種sds-蛋白質復合物都帶有均等密度的負電荷，分子之間的電荷差異消失。3變性效應，sds同時還破壞了蛋白質中的非共價鍵，導致蛋白質變性，使sds-蛋白質復

9、合物在溶液中呈現(xiàn)相似的形狀。因此蛋白質在sds-page凝膠中的電泳遷移率不再受蛋白質原有電荷和形狀的影響，而主要取決于分子量的大小。在進行sds-page電泳時同時使用蛋白質分子量標準樣品，則可以在電泳完畢后根據(jù)標準分子量大小得知樣品蛋白質的相對分子量。4凝膠對樣品的濃縮效應sds-page使用一種不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)即分為低濃度的濃縮膠和較高濃度的分離膠，配制這兩種凝膠所用緩沖液的ph值和離子強度也不相同。電泳時樣品中的sds-蛋白質復合物首先經(jīng)過濃縮膠，體積得到極大的濃縮，然后再經(jīng)過分離膠被分離。sds-page凝膠已經(jīng)成為實驗室常用的蛋白質分離方法，通常被用于蛋白質制品純度的鑒定和蛋白質分

10、子量的測定。精品.【試劑器材】1，30凝膠貯備液，稱取30g丙烯酰胺和nnv-亞甲雙丙烯酰胺0.8g，用去離子水配制成100ml的溶液，過濾貯存于棕色瓶中，4冰箱保存。2，10凝膠貯備液，稱取10g丙烯酰胺和nn-亞甲雙丙烯酰胺0.5g，用去離子水配制成100ml的溶液，過濾貯存于棕色瓶中4冰箱保存。3，10sds用去離子水配制貯存于室溫中。4，1temed，nnnn-四甲基乙二胺。5，10過硫酸銨用去離子水在臨用前配制。6，tris-甘氨酸電泳緩沖液ph8.3tris 6.0g甘氨酸28.8g10sds溶液10ml用蒸餾水定容至1000ml 。7，1.5mol/l ph8.8 tris-hc

11、1緩沖液稱取tris 1。8，1.5g加適量蒸餾水溶解用濃hci調節(jié)ph值至8.8，加蒸餾水至1000ml。0.5mol/l、ph6.8 tris-hc1緩沖液，稱取tris 60.6g加500ml蒸餾水溶解用濃hcl調節(jié)ph值至6.8加蒸餾水至1000ml。9，0.05mol/l ph8.0 tris-hcl 緩沖液稱取tris 6.1g加500ml蒸餾水溶解用濃hcl調節(jié)ph值至8.0加蒸餾水至1000ml。10，2樣品緩沖液蔗糖4g溴酚藍2mg10sds溶液2ml5巰基乙醇0.5ml 0.05mol/l tris-hclph8.02ml用蒸餾水定容至10.0ml11，0.25考馬斯亮藍r

12、250將2.5g考馬斯亮藍r250溶解于450ml甲醇中再加入450ml蒸餾水和100ml冰乙酸混勻過濾除去顆粒物質。12，洗脫液將50ml甲醇和75ml冰乙酸溶解于875ml蒸餾水中混勻。13，預染蛋白質分子量標準：117kd、90kd、49kd、35kd、26kd、19kd共6種蛋白質精品.14，電泳槽、電泳儀、掃描儀、染色缸、搖床、一次性手套、微量加樣器等?！静僮鞑襟E】1制備凝膠1準備玻璃板洗凈、晾干。按電泳槽使用說明裝好按下表配制12分離膠溶液5和5濃縮膠溶液表3-1濃縮膠與分離膠的配制溶液成分12分離膠溶液ml5濃縮膠溶液ml30凝膠貯備液4.010凝膠貯備液2.51.5mol/l

13、ph8.8 tris-hc12.5 ，0.5 mo/l ph6.8 tris-hcl 1.25，10sds 0.1，0.051temed0.8，0.4蒸餾水2.50.7510過硫酸銨0.10.05總體積10.05.02小心將分離膠注入準備好的玻璃間隙中并為濃縮膠留有空間。輕輕在頂層加入幾毫升去離子水以阻止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。3凝膠聚合后倒掉上層水用濾紙吸干凝膠頂端的水。4按表3-1配制濃縮膠注入分離膠上端插入梳子應小心避免產(chǎn)生氣泡。2點樣1待測蛋白樣品的制備若樣品為水溶液且蛋白質含量大于10mg/ml可將待測液與樣品緩沖液等體積混勻100加熱3min。2濃縮膠聚合后拔去梳子將凝膠放

14、入電泳槽中在上、下槽中加入電泳緩沖液。3將樣品混合液、標準蛋白按次序加入梳孔中。3電泳起始電壓為8v/cm當染料進入分離膠后將電壓調至15v/cm繼續(xù)電泳至溴酚藍到達分離膠底部關閉電源。4染色取下凝膠將凝膠浸泡于考馬斯亮藍染色液中在搖床上室溫緩慢搖動30-60min。5脫色換洗脫液于搖床上室溫緩慢搖動12小時其間更換12次洗脫液。洗脫后的凝膠可以照像或干燥也可置于含有20甘油的水中密閉保存。精品.【注意事項】1sds-page電泳要求樣品的離子強度盡量要低如果離子強度過高應經(jīng)透析或離子交換除鹽后再進行電泳。2丙烯酰胺試劑是一種神經(jīng)毒素可通過皮膚吸收會因多次積蓄而中毒。操作時應極其小心需要帶一次

15、性手套。3上樣量以1015ul為宜如果樣品蛋白含量過少為保證區(qū)帶清晰可增加上樣量6同時應將樣品緩沖液濃度提高二倍或更高。4溴酚藍染料是指示劑為電泳時可見的遷移標志物。5凝膠聚合的時間與溫度有關夏天聚合快可置于冰浴中減慢聚合冬天室溫低可放入溫箱中加快聚合。實驗四蛋白質轉印實驗半干式【目的要求】1掌握半干式蛋白質轉印技術的基本操作。2掌握蛋白質轉印后的檢測方法。【實驗原理】蛋白質印跡western blotting是將蛋白質電泳分離技術與免疫標記技術結合所形成的一種鑒定特異性抗原的方法。蛋白質轉印應先將含某抗原的蛋白混合物進行sds-聚丙烯酰胺凝膠sds-page電泳使各種蛋白成分根據(jù)分子量的不同

16、分離開來再通過電轉移將各種蛋白成分轉印到硝酸纖維素膜nc或pvdf膜上通過特異試劑抗體作為探針與膜上的相應抗原發(fā)生結合再與酶標記的抗ig抗體結合洗滌后加入底物進行顯色。根據(jù)顯色條帶的位置和深淺可以對抗原及其分子量或相對含量進行檢測。蛋白質的western印跡技術結合了凝膠電泳的高分辨率和固相免疫測定的特異敏感等多種優(yōu)點可檢測到低至1-5ng的靶蛋白。本實驗的主要目的是采用半干式電轉移將sds-page凝膠電泳分離后的蛋白質從凝膠轉移至固相支持材料上。裁剪與凝膠一樣大小的硝酸纖維素膜用去離子水浸濕后再浸入轉移緩沖液內(nèi)隨后取出進行轉移半干式電轉移在室溫操作所需時間較短將凝膠及與之相貼的硝酸纖維素膜

17、夾于事先用轉移緩沖液浸泡過的濾紙之間平放在電轉儀上負極在上正極在下凝膠在陰極端薄膜在陽極端轉移方向從陰極到陽極根據(jù)凝膠面積設置電流室溫下進行轉移轉移結束取出薄膜麗春紅染色檢測轉印效果。精品.【試劑器材】1半干式電泳轉印槽2硝酸纖維素膜3濾紙4轉移電泳儀5培養(yǎng)皿6萬向旋轉搖床7轉印緩沖液【操作步驟】1將電泳后的sds-page凝膠浸在轉印緩沖液中洗10min。2去掉濃縮膠測量剩余膠的尺寸大小。3剪1張和膠大小一致的硝酸纖維素膜，用鉛筆在膜的右下角做一個標記用于定位。剪6張和膠大小一致的濾紙，尺寸一定不能大于膠的尺寸，否則多出的部分會在膠的邊緣接觸形成短路導致轉移不充分。4將膜及濾紙在轉印緩沖液中

18、浸潤10min。5將3張濕濾紙放到半干電轉儀的底部平板電極上負極，然后依次放置膠、硝酸纖維素膜、濾紙3張注意堆放整齊同時注意每層之間避免氣泡存在，一般可用試管碾壓趕走氣泡，注意一旦膠和膜接觸位于膠表面的蛋白就會結合到膜上，所以膠一定要一次成功，不要試圖調整膠的位置，否則蛋白質色帶可能會印上去最后產(chǎn)生重迭影像。6待所有的膜和膠都放好后，蓋上轉印儀的上蓋，讓上部的平板電極壓緊由濾紙、膜、膠形成的三明治結構，注意正負極，轉印結束后才可以打開上蓋。精品.7連接轉移電泳儀電流通常設為1ma/cm2左右。8cmx7cm的膠通常使用100ma恒流轉移。大膠必須限制電流在0.8ma/cm2防止電流過大產(chǎn)生過多

19、熱量影響轉印。轉印時間如下表所示。8轉印結束取出轉印三明治打開后依次取出轉印膜及凝膠。9將轉印膜浸入麗春紅染色液中觀察是否有紅色蛋白條帶出現(xiàn)轉印后的凝膠可以進行考馬斯亮藍染色看有無蛋白質殘留若電泳時加有預染標準蛋白質marker則可在轉印膜上看到相應色帶幫助確定轉印成功并可評估轉印效率。10若繼續(xù)進行免疫雜交實驗則用去離子水漂洗轉印膜后可進行封閉。【注意事項】1.不要切去膠的一角以作標記因為這樣容易導致短路或轉移不充分。盡可能在電泳結束后就進行轉印防止樣品在膠內(nèi)彌散開來。2.丙烯酰胺濃度越低蛋白越容易轉移下來。所以應選擇可以分離蛋白最低濃度的凝膠進行電泳。梯度膠適用于轉印一系列不同大小的蛋白因

20、為凝膠的孔與不同大小的蛋白匹配良好。3.蛋白質結合到硝酸纖維素膜上主要是通過疏水鍵對于常規(guī)使用效果非常好。但對于小的多肽建議使用小孔徑0.2um的膜。表4-1轉印時間和蛋白分子量的關系分子量mw轉印時間1t20kda30分鐘20kda80kda60分鐘gt80kda90分鐘以8x7cm的迷你膠在100ma恒流的條件為例84.pvdf膜比硝酸纖維素膜更疏水在轉印過程中結合蛋白更緊密可以耐受更多的sds。目前pvdf膜一般比硝酸纖維素膜需要更嚴謹?shù)姆忾]條件適用于蛋白測序。尼龍膜通過疏水和靜電相互作用結合其sds耐受度甚至高于pvdf膜但也需要更嚴謹?shù)姆忾]條件主要建議用于northern和south

21、ern雜交。實驗五 質粒dna的提取堿裂解法精品.【目的要求】1掌握堿裂解法制備質粒dna的原理和方法進一步認識質粒dna的性質。2初步掌握分子克隆基本操作技術?！緦嶒炘怼抠|粒plasmid是能在染色體外自我復制的穩(wěn)定共生型遺傳單位主要存在于細菌、放線菌、真菌和某些動植物細胞中。它能在細菌中垂直遺傳且保持穩(wěn)定的拷貝數(shù)賦予宿主細胞某些特殊的表型。迄今為止從細菌中分離得到的質粒都是雙鏈閉合環(huán)狀dna分子大小為1kb200kb。在基因工程研究中質粒是最常用的一種基因克隆載體用于運載外源基因進入宿主細胞。因此質粒dna的提取和純化是分子生物學技術中的一項基礎工作。質粒dna提取的關鍵是要與細菌染色質

22、dna分開。常用的提取方法有煮沸法、堿裂解法、去污劑法、有機溶劑法和溶菌酶法等不同方法各有利弊應根據(jù)不同質粒的性質、不同宿主菌的特性及后繼的純化方法等多種因素綜合加以選擇。一般以堿裂解法最為常用因為它對細菌的裂解完全對染色質dna和蛋白質的變性充分因而所提取的質粒dna產(chǎn)量高、純度高。但如果堿變性時間過長有可能會導致質粒dna變性導致隨后的內(nèi)切酶酶切困難。堿裂解法提取質粒dna的主要原理和步驟是1接種含質粒的單個菌落到培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。隨著細菌的生長質粒dna也隨之自主復制。必要時可以在細菌生長后期在培養(yǎng)基中適量加入氯霉素以抑制宿主細胞的蛋白質合成和染色質dna的復制細菌的數(shù)量不再增加而質粒d

23、na的復制基本不受影響從而大量擴增質粒dna的拷貝數(shù)。2離心收集細菌。3加入強堿溶液裂解菌體必要時可以適量加入溶菌酶。此時大分子量線狀的細菌染色質dna和蛋白質發(fā)生變性而閉合環(huán)狀的質粒dna多數(shù)仍不變性處于自然狀態(tài)。精品.4幾分鐘后加入中和液將ph值調至中性。在高鹽濃度條件下大部分染色質dna與蛋白質不能復性交連成不溶性網(wǎng)狀結構在去污劑sds的作用下形成絮狀沉淀。而質粒dna分子量小且為閉合環(huán)狀結構少數(shù)變性的質粒dna也能夠迅速復性呈溶解狀態(tài)。95離心去除大部分細胞碎片、染色質dna、rna和蛋白質。質粒dna保留在上清中。6最后再用rna酶消化酚/氯仿抽提、透析和乙醇或異丙醇沉淀等方法進一步去除殘余蛋白質和核酸純化質粒dna?！驹噭┢鞑摹?lb培養(yǎng)基蛋白胨10g酵母抽提液5gnacl10g加蒸餾水至1000ml用naoh調ph至7.5高壓蒸汽消毒20min。2i號液50mmol/l葡萄糖25mmol/l tris-clph 8.010mmol/l edta必要時在使用前加溶菌酶4mg/ml3i號液0.2mol/l naoh含1sdsii號液必須在實驗時新鮮配制4i號液5mol/lkac60ml冰醋酸11.5ml水28.5m