DNA損傷修復(fù)與抗腫瘤藥物研究.ppt

1、馮冰虹教授,DNA損傷修復(fù)與抗腫瘤藥物研究,2,基因突變（gene mutation）: 在生物進化過程中，由于生物體內(nèi)外環(huán)境多種因素的影響，使遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變而引起遺傳信息的改變，均可稱為突變。 從分子水平來看，突變主要表現(xiàn)為DNA分子上堿基的改變。 在復(fù)制過程中發(fā)生的DNA突變稱為DNA損傷（DNA damage）。,突變的意義,3,（一）突變是進化、分化的分子基礎(chǔ)。 （二）只有基因型改變，而無可察覺表型改變的 突變（基因多態(tài)性：用于描述個體之間的 基因型差別現(xiàn)象）。 （三）致死性的突變（利用此特性消滅有害病原 體）。 （四）突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)。,4,第一節(jié) DNA損傷的因素和類型

2、,一、引起DNA 損傷的因素,5,自發(fā)突變： 頻率：10-9,誘變因素,病毒等,DNA損傷的后果,6,（一）DNA 的自發(fā)性損傷,7,1、DNA的復(fù)制錯誤,（二）環(huán)境造成的DNA 損傷,8,1、紫外線引起的DNA損傷,胸腺嘧啶二聚體 DNA之間交聯(lián) DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián) DNA鏈斷裂,9,2、電離輻射引起DNA損傷,10,3、烷化劑引起DNA損傷,11,4、堿基類似物、修飾劑引起堿基對的改變,（1）堿基類似物用作促突變劑或抗癌藥物,5-氟尿嘧啶（5-FU）、5-溴尿嘧啶（5-BU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）。,（2）某些化學(xué)物質(zhì)能專一修飾DNA鏈上堿基,亞硝酸鹽：使C脫氨變成U，經(jīng)復(fù)制使G-C

3、A-T 羥胺：使T脫甲基變成C，結(jié)果A-T G-C 黃曲霉素B：專一攻擊DNA上堿基，導(dǎo)致序列變化,這些均為誘發(fā)突變的化學(xué)誘變劑或致癌劑,二、DNA 損傷的類型,12,單點突變、多點突變 轉(zhuǎn)換、顛換,鏈內(nèi)共價交聯(lián) 鏈間共價交聯(lián),電離輻射、某些化學(xué)試劑使鏈內(nèi)磷酸二酯鍵斷裂,單個堿基、多個堿基、一段序列的插入或缺失,DNA分子內(nèi)發(fā)生較大片段的交換。,1. 堿基和糖基破壞, 損傷因素,酸、熱去嘌呤作用、堿基修飾劑、自由基、活性氧、紫外線,損傷類型,堿基丟失/插入、堿基置換、DNA片段缺失/插入,13,2. 錯配,損傷因素,堿基類似物、堿基修飾劑、自發(fā)脫氨基,常見錯配類型,UT,14,3. DNA鏈斷

4、裂,損傷因素,電離輻射、化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo),損傷類型,單鏈斷裂、雙鏈斷裂（最嚴重損傷，不能原位修復(fù)，易致畸),15,4. DNA交聯(lián),化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)(如絲裂霉素),損傷因素,損傷類型,鏈內(nèi)交聯(lián) 同一DNA鏈上堿基共價結(jié)合 嘧啶二聚體DNA鏈上相鄰的兩個嘧啶堿 基之間共價結(jié)合，形式有TT、CT、CC,鏈間交聯(lián),不同DNA鏈之間的堿基共價結(jié)合,DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián),DNA與蛋白質(zhì)以共價鍵結(jié)合,16,DNA交聯(lián)示意圖,17,第二節(jié) DNA損傷的修復(fù)的機制,18,常見的DNA損傷及其修復(fù)機制,19,修復(fù)(repairing) 是對已發(fā)生分子改變的補償措施，使其回復(fù)為原有的天然狀態(tài)。,光修復(fù)(light repa

5、iring) 切除修復(fù)(excision repairing) 重組修復(fù)(recombination repairing) SOS修復(fù) 錯配修復(fù),修復(fù)的主要類型,一、DNA損傷的修復(fù)的概念和類型,20,二、DNA損傷的修復(fù)的機制,光復(fù)活酶與DNA鏈上嘧啶二聚體部位結(jié)合 受波長為260-380 nm的近紫外線 作用激活使二聚體解聚 酶從DNA鏈上解離，DNA恢復(fù)正常結(jié)構(gòu),（一）回復(fù)修復(fù), 酶學(xué)光復(fù)活,21,光修復(fù)酶(photolyase),UV,22,23, 嘌呤直接插入 O6-甲基鳥嘌呤-DNA的甲基轉(zhuǎn)移 單鏈重接（單鏈斷裂修復(fù)）,24,2020/10/13,25,25,（二） 切除修復(fù),定義

6、,在多種酶的作用下，先將損傷區(qū)域切除，然后利用互補鏈為模板，合成一段正確配對的堿基順序來修補,切除過程,切除方式,堿基切除修復(fù)、核苷酸切除修復(fù),識別并切除修復(fù)合成并連接,26,2.1堿基切除修復(fù)（base-excision repair, BER）,所有細胞中都帶有能識別受損核酸位點的糖苷水解酶，它能特異性切除受損核苷酸上的N-糖苷鍵，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點（AP位點）。,27,DNA分子中一旦產(chǎn)生了AP位點，AP核酸內(nèi)切酶就會把受損核苷酸的糖苷-磷酸鍵切開，并移去包括AP位點核苷酸在內(nèi)的小片段DNA，由DNA聚合酶I合成新的片段，最終由DNA連接酶把兩者連成新的被修復(fù)的DNA鏈堿

7、基切除修復(fù)(base-excision repair)。,28,.糖甘水解酶識別改變了的堿基，把堿基從N-糖苷鍵處切下來，在DNA鏈上形成去嘌呤或去嘧啶位點，統(tǒng)稱為AP位點。,29,由AP磷酸內(nèi)切酶將受損核甘酸的糖苷-磷酸鍵切開,5,3,30,DNA連接酶連接,利用DNA聚合酶I在切除損傷部位，補上核苷酸,31,2020/10/13,32,32, 核苷酸切除,被切除的不是單個堿基，而是一段寡核苷酸。是細胞內(nèi)更為重要的一種修復(fù)方式, 切除修復(fù)的特點,是DNA修復(fù)的一種普遍形式,33,2.2核苷酸切除修復(fù)（Nucleotide excision repair, NER）,是機體正常細胞針對DNA鏈

8、上較大損傷的修復(fù)過程，它由多種DNA修復(fù)酶組成。,34,2.2核苷酸切除修復(fù)（Nucleotide excision repair, NER）,損傷發(fā)生后，首先由DNA切割酶(excinuclease)在己損傷的核苷酸5和3位分別切開磷酸糖苷鍵， 產(chǎn)生一個由1213個核苷酸(原核生物)或2729個核苷酸(人類或其他高等真核生物)的小片段， 移去小片段后由DNA聚合酶(原核)或（真核)合成新的片段，并由DNA連接酶完成修復(fù)中的最后一道工序。,35,識別損傷部位,損傷的兩邊切除幾個核苷酸,DNA 聚合酶以母鏈為模板復(fù)制合成新子鏈,DNA連接酶將切口補平,36,（三） 重組修復(fù),定義,重組酶系將未受

9、損傷的DNA片段移到損傷部位， 提供正確的模板，進行修復(fù),分類, 同源性重組,兩段雙鏈DNA同源性大于200 bp，大腸桿菌及酵母中Rec A蛋白、人細胞中Rad51是關(guān)鍵,非同源性重組,同源性低，DNA雙鏈斷裂的主要修復(fù)方式，關(guān)鍵分子是DNA-PK及XRCC4，非精確修復(fù),37,2020/10/13,38,38,復(fù)制中出現(xiàn)損傷,重組修復(fù),DNA聚合酶填補缺損,39,2020/10/13,40,40,（四）錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）,DNA 錯配修復(fù)是細胞復(fù)制后的一種修復(fù)機制, 具有維持DNA 復(fù)制保真度, 控制基因變異的作用。 錯配修復(fù)實際上是一種特殊的核苷酸切除修復(fù)

10、，它專門用來修復(fù)在DNA復(fù)制中出現(xiàn)的新合成DNA鏈上的錯配的堿基。但如何避免將DNA鏈上正確的堿基切除呢？這就需要將old strand 和new strand區(qū)分開來。,41,原核生物利用甲基化區(qū)分old strand 和new strand，因此原核細胞中的錯配修復(fù)也稱甲基化指導(dǎo)的錯配修復(fù)（methyl-directed mismatch repair）。,42,錯配修復(fù)系統(tǒng)識別母鏈靠Dam甲基化酶（Dam methylase），它能使位于5GATC序列中A的N6位甲基化。一旦復(fù)制叉通過復(fù)制起始位點，母鏈就會在開始DNA合成前的一小點時間（幾秒鐘至幾分鐘）內(nèi)被甲基化。剛合成的DNA新鏈上的

11、GATC序列還沒有來得及甲基化，而作為模板的old strand早已被甲基化了，利用這種差別區(qū)分old strand 和 new strand。,43,此后，一旦發(fā)現(xiàn)錯配堿基，錯配修復(fù)系統(tǒng)就會根據(jù)“保存母鏈，修正子鏈”的原則，找出錯誤堿基所在的DNA鏈即將未甲基化的鏈切除，并以甲基化的鏈為模板進行修復(fù)合成。 GATC中A甲基化與否常用來區(qū)別新合成的鏈（未甲基化）和模板鏈（甲基化） 。這一區(qū)別很重要,44,錯配修復(fù)（mismatch repair）,Dam甲基化酶使母鏈位于5GATC序列中腺苷酸甲基化 甲基化緊隨在DNA復(fù)制之后進行 根據(jù)復(fù)制叉上DNA甲基化程度，切除尚未甲基化的子鏈上的錯配堿基

12、 通過3個蛋白質(zhì)（MutS、MutH和MutL）校正,45,根據(jù)母鏈甲基化原則找出錯配堿基的示意圖,1. MutS發(fā)現(xiàn)錯配堿基,2.在水解ATP的作用下，MutS， MutL與堿基錯配點的DNA雙鏈結(jié)合,3.MutS-MutL在DNA雙鏈上移動，發(fā)現(xiàn)甲基化DNA后由MutH切開非甲基化的子鏈,46,甲基化指導(dǎo)的錯配修復(fù)示意圖,錯配堿基位于切口3下游端，,錯配堿基位于切口5上游端，,47,（五）SOS修復(fù), 定義,DNA損傷時應(yīng)急產(chǎn)生的修復(fù)作用，解除修復(fù)系統(tǒng)抑制，使其產(chǎn)物 (多種修復(fù)蛋白)參與修復(fù),48,SOS修復(fù)中LexA-RecA操縱子的作用機理,49,當(dāng)細菌DNA遭到破壞時，細菌細胞內(nèi)會啟

13、動一個被稱為SOS的誘導(dǎo)型DNA修復(fù)系統(tǒng)。 在正常情況下，DNA損傷的修復(fù)基因的操縱子被LexA蛋白所阻遏。 SOS修復(fù)系統(tǒng)受到LexA阻遏蛋白的抑制，平時該蛋白表達水平很低。 SOS體系的誘導(dǎo)表達過程其實就是LexA阻遏蛋白從這個基因的上游調(diào)控區(qū)移開的過程。,阻遏蛋白LexA的降解與細菌中的SOS應(yīng)答,50,當(dāng)有紫外線照射時，細菌體內(nèi)的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，從而導(dǎo)致與DNA損傷修復(fù)有關(guān)的基因表達。 RecA蛋白：是SOS反應(yīng)的最初的發(fā)動因子。在單鏈DNA和ATP存在時，RecA蛋白被激活，表現(xiàn)出水解酶活性，分解LexA阻遏物。,51,表達RecA蛋白與這些缺

14、口處單鏈DNA相結(jié)合，被激活成蛋白酶。具有蛋白酶活性的RecA蛋白將LexA蛋白切割成沒有阻遏作用的和具有與操縱區(qū)DNA結(jié)合活性的兩個片段，導(dǎo)致SOS體系的高效表達，使DNA得以修復(fù)。,52,SOS反應(yīng),紫外線,與DNA 損傷修復(fù)有關(guān)的酶和蛋白質(zhì),DNA,53,當(dāng)修復(fù)完成后，活化信號消失，RecA蛋白回復(fù)到非蛋白水解酶的形式，LexA蛋白開始逐步積累，并重新建立起阻遏。RecA蛋白的合成停止，DNA恢復(fù)復(fù)制，RecA蛋白被稀釋到原來的本底水平。,54,三、 DNA 修復(fù)的細胞周期檢查點控制,真核生物細胞DNA受到損傷時細胞除了誘導(dǎo)修復(fù)基因的轉(zhuǎn)錄外，還可暫時阻斷細胞周期，防止受損DNA繼續(xù)復(fù)制，

15、如無法修復(fù)，則可誘導(dǎo)細胞進入凋亡。這些都是細胞通過細胞周期檢查點控制（checkpoint control，又稱關(guān)卡控制）對DNA損傷的應(yīng)答反應(yīng)。,55,酵母細胞的細胞周期檢查點控制機制,56,哺乳類動物的細胞周期檢查點控制機制,57,四、DNA損傷應(yīng)答的研究進展,（一）乙酰轉(zhuǎn)移酶 T i p 6 0在 DNA損傷應(yīng)答中作用的研究進展 T i p 6 0 ( T a t i n t e r a c t i v e p r o t e i n ) 是進化上極為保守的乙酰轉(zhuǎn)移酶， 它在細胞周期阻滯、 凋亡、D N A損傷修復(fù)等眾多生理學(xué)過程中都發(fā)揮著重要的作用。 作為許多轉(zhuǎn)錄因子的共調(diào)節(jié)因子， T

16、 i p 6 0 既可以激活也可以抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)發(fā)生D N A損傷時， 它被招募到損傷位點， 參與D N A損 傷應(yīng)答的感受、 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和修復(fù)過程中。 除此之外， T i p 6 0還與許多病理過程有關(guān)， 尤其是在腫瘤發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。,58,T i p 6 0可以p 5 3依賴和不依賴兩種方式參與 D N A損傷應(yīng)答：,59,（二）調(diào)控 D N A損傷修復(fù)基因的miRNA,60,61,62,第三節(jié) DNA損傷和修復(fù)的基因,63,一、甲基化損傷修復(fù)相關(guān)基因,甲基轉(zhuǎn)移酶（MGMT）把O6-甲基鳥嘌呤的甲基轉(zhuǎn)移到自身的半胱氨酸殘基上，修復(fù)甲基化的DNA。 MGMT突變可作為甲基化損傷的基

17、因型標(biāo)記物。,64,二、切除修復(fù)相關(guān)的酶和基因,尿嘧啶糖基化酶為主要的始動因素，可作為DNA損傷的生物標(biāo)記物。 大腸桿菌Uvr基因家族、人ecrr基因和切除修復(fù)基因等,65,三、錯配修復(fù)相關(guān)基因,MSH2、MLH1等蛋白參與錯配修復(fù)，而錯配修復(fù)的缺陷往往是癌變的第一步。 錯配修復(fù)基因：Muthls系統(tǒng)、人類的hmsh2/3、hpmsl1/2、Mutsa、msh6。 錯配修復(fù)基因的微衛(wèi)星序列的不穩(wěn)定性 （microsatellite instability， MI）,66,四、 DNA聚合酶,DNA聚合酶參與輻射損傷和化學(xué)損傷的修復(fù)，并對細胞的生長具有調(diào)節(jié)作用。 DNA聚合酶 的突變可導(dǎo)致堿基切

18、除修復(fù)功能的缺陷。,67,五、 DNA加合物,英文名稱：DNA adduct 定義：DNA分子與化學(xué)誘變劑間反應(yīng)形成的一種共價 結(jié)合的產(chǎn)物。這種結(jié)合激活了DNA的修復(fù)過程。 如果這種修復(fù)不是發(fā)生在DNA復(fù)制前，會導(dǎo)致核 苷酸的替代、缺失和染色體的重排。 DNA加合物可作為DNA損傷的暴露標(biāo)記物和效應(yīng)標(biāo)記物，其去除的速度也可作為DNA修復(fù)功能的生物標(biāo)記物。,68,DNA損傷和修復(fù)的生物學(xué)意義,避免基因組的不穩(wěn)定性、癌癥和細胞死亡是至關(guān)重要的。 DNA修復(fù)途徑可以識別和修復(fù)特異的DNA損傷，保證生物物種的遺傳穩(wěn)定性。,69,第四節(jié) 與DNA修復(fù)有關(guān)的人類遺傳疾病,著色性干皮病(Xeroderma

19、pigmentosum) 布倫氏癥候群(Blooms syndrome) 遺傳性大腸癌(Hereditary nonpolyposis colon cancer；HNPCC),70,71,著色性干皮病(Xeroderma pigmentosum),是一種隱性遺傳性疾病，有些呈性聯(lián)遺傳。因核酸內(nèi)切酶異常造成DNA修復(fù)障礙所致。臨床以光暴露部位色素增加和角化及癌變?yōu)樘卣鳌?1. 幼年發(fā)病，常有家族發(fā)病史。 2. 面部等暴露部位出現(xiàn)紅斑、褐色斑點及斑片，伴毛細血 管擴張，間有色素脫失斑和萎縮或疤痕。皮膚干燥。數(shù)年內(nèi)發(fā)生基底細胞癌、鱗癌及惡性黑素瘤。 3.皮膚和眼對日光敏感。 4.病情隨年齡逐漸加重，多數(shù)患者于20歲前因惡性腫瘤而死亡。 5.組織病理 晚期出現(xiàn)表皮非典型性增生、日光角化及鱗癌和基底細胞癌等惡性腫瘤。,72,著色性干皮病患兒臉部特征,73,著色性干皮病背部,著色性干皮病組織切片,74,著色性干皮病的并發(fā)癥,75,著色性干皮病的治療,避免紫外線照射 避免腫瘤致病因子 對癥治療,76,遺傳性大腸癌的臨床特征,發(fā)病早 (45 歲) 腫瘤好發(fā)部位 腸外腫瘤的類型,77,遺傳性大腸癌(HNPCC),息肉較少 30-60% 有內(nèi)