肺癌開題報告

1、黃芪對肺癌小鼠模型的干預(yù)機制研究,導(dǎo)師:孫廣仁教授 學(xué)生：,選題依據(jù),選題目的： 通過建立小鼠肺癌模型，探討黃芪對肺癌的抑制和轉(zhuǎn)移的作用機制，以期在臨床上能有效的運用黃芪對肺癌治療提供實驗依據(jù)。建立肺癌小鼠肺模型，觀察黃芪對小鼠生存時間，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對小鼠腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機制研究黃芪對小鼠肺癌的作用機制，為臨床防治提供實驗依據(jù)。,選題意義,根據(jù)中國衛(wèi)生部腫瘤防治辦公室提供的2006年中國腫瘤發(fā)病率和十大惡性腫瘤發(fā)病率排序顯示，肺癌居男性惡性腫瘤發(fā)病首位，男女惡性腫瘤死亡率最高的均為肺癌2。2

2、000年世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計資料表明，每年全球的肺癌新發(fā)病例位1.2百萬，占全部惡性腫瘤的12.3，死亡1.1百萬，占腫瘤全部死因的17.8。更為嚴重的是，凡是煙草消費大國，其肺癌新發(fā)病率乃在不斷增長，成為越來越嚴重的危害人民生命和健康的常見疾病3。原發(fā)性肺癌是發(fā)達國家的主要腫瘤，以美國為例，1997年全美國肺癌的發(fā)生數(shù)男性為98300例，女性為79800例，分別是男女腫瘤發(fā)病率第二位。1997年因肺癌死亡的人數(shù)為160400人，居惡性腫瘤死亡率第1位，占全美國腫瘤死亡病人的294。,中醫(yī)藥在治療肺癌上有其自己的優(yōu)勢，近幾年來應(yīng)用辨證論治、專方、專藥及新藥新劑型等方法治療肺癌均有一定的進展，在穩(wěn)

3、定病灶、改善癥狀、提高生存質(zhì)量、延長生存期等方面都具有一定的療效和優(yōu)勢。因此研究中醫(yī)藥在肺癌治療中的作用有其很高的應(yīng)用價值，能更好的服務(wù)于臨床中肺癌的治療。 肺癌屬“肺積”、“息責(zé)”等范疇，屬于祖國醫(yī)學(xué)“咳嗽”、“咯血”、“肺積”，這與肺癌的臨床表現(xiàn)有相似之處。中醫(yī)學(xué)認為，肺癌是由于人體正氣不足，尤其是肺脾腎虛損，再加上六淫和七情等因素長期作用，導(dǎo)致肺氣不足，肺陰虧虛，升降失調(diào)，氣血瘀滯，內(nèi)結(jié)于肺，形成積塊而發(fā)生的6。,本研究主要是在建立小鼠肺癌模型，并在此基礎(chǔ)上用黃芪對該病進行治療，通過觀察小鼠的一般情況，小鼠瘤組織的重量及抑瘤率、小鼠肺轉(zhuǎn)移灶的影響。采用免疫組化方法，觀察黃芪對荷瘤小鼠腫瘤

4、壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)的變化。從微觀機制研究黃芪對小鼠肺癌的作用機制。預(yù)期成果不僅可為防治該病證提供新思路和理論依據(jù)，指導(dǎo)臨床對肺癌的預(yù)防、治療和康復(fù)，同時為的深層次機制和研究中藥微觀作用機制的研究進行資料積累，提供新思路和理論支撐。,課題設(shè)計,研究內(nèi)容與研究方法： 以小鼠轉(zhuǎn)移肺癌模型為研究對象，采用中西藥對比進行治療，動態(tài)觀察小鼠的體重改變、抑瘤率的比較、肺組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-等細胞因子的變化，從細胞分子水平闡釋這些變化，及黃芪和紫杉醇對肺癌的作用的相關(guān)性，觀察探討黃芪對肺癌的干預(yù)作用的動態(tài)變化及時效性，為防治肺癌提供新思路和理論依據(jù)。,技術(shù)

5、路線,動物實驗 1.肺癌的臨床診斷：肺癌的臨床診斷必須依據(jù)臨床表現(xiàn)和各種影像結(jié)果進行綜合分析，但最后的確診必須取得細胞學(xué)或病理組織學(xué)的證據(jù)。任何沒有病理學(xué)或病理組織學(xué)證據(jù)的診斷，都不能為最后的診斷結(jié)果。依據(jù)這樣的原則，肺癌的診斷可分為肺癌的定位診斷和肺癌的定性診斷兩種，所有的影像學(xué)診斷法方可認為是定位診斷，而所有以獲取細胞學(xué)或病理組織學(xué)為目的的診斷科認為是定性診斷。定位診斷是基礎(chǔ)，定性診斷是關(guān)鍵。,2. 肺癌模型建立的方法,（1）肺癌小鼠造模：在本院三級動物實驗室中，無菌操作，取肺癌瘤小鼠腹水，稀釋至含瘤細胞 2 1010 /L，置冰上，每小鼠右腋皮下接種 0. 2ml，分別給模型組、中藥組和

6、西藥組接種。接種次日24h后進行藥物抑藥瘤試驗；實驗設(shè)空白組和模型對照組，中藥組和西藥組。模型對照組中，每只小鼠腹腔注射等體積生理鹽水，中藥組中每只小鼠腹灌胃 0.4ml，100mg/ml。西藥對照組中。每只小鼠腹腔注射紫杉醇注射液0.2ml，20mg/ml 。每只小鼠每天用藥 1 次，連續(xù)用藥 15天，停藥次日處死小鼠，剝離腫瘤，稱體重及瘤重，計算抑瘤率。,（2）藥物干預(yù)階段,造模24h后，空白組、肺癌模型組小鼠不予藥物干預(yù)，以生理鹽水灌胃。中藥治療組小鼠黃芪煎湯灌胃。 藥物制備：黃芪25g加8倍水，浸泡半小時，頭次煎煮半小時，濾出藥渣后加水至藥面以上3ml，再煎20分鐘。將兩次藥液混合、過

7、濾，加壓濃縮至100%（即每毫升含生藥1.0g）的水提劑。 用藥方法：將藥物按成人日服量換算，計算出小鼠日服量，每日對治療組小鼠灌服中藥煎劑0.4ml/100g體重，對空白組及肺癌模型組小鼠灌服生理鹽水0.4ml/100g體重。 連續(xù)用藥15天，第16天處理所有小鼠。后脫頸處死小鼠,完整剖取接種的瘤塊,電子天平稱重，按公式:抑瘤率=(空白組平均瘤重-給藥組平均瘤重) /空白組平均瘤重100%。小鼠處死后，將整個肺取下。在雙盲條件下,計數(shù)肺轉(zhuǎn)移瘤灶的數(shù)目，按公式:肺轉(zhuǎn)移抑制率=(空白組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目-給藥組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目) /空白組平均肺轉(zhuǎn)移瘤灶數(shù)目100%。,3.檢測指標(biāo),（1）整體觀

8、測：在實驗過程中觀察小鼠癥狀、體重、生存時間、呼吸、被毛情況、食量、飲水量，胸腔，縱膈，胸水。（2）瘤體重測定：小鼠處死后，去腫瘤組織，精密電子天平稱重。（3）血生化指標(biāo)檢測：小鼠腹主動脈取血，以ELISA法測定、TNF-的含量，放免法測定血漿中MMP-9的含量（4）瘤組織處理：腫瘤組織用福爾馬林液充分固定，常規(guī)脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色，光鏡下觀察期組織學(xué)變化。肺組織用福爾馬林固定12h,進行HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察讀片,以進一步確認轉(zhuǎn)移灶的病理性質(zhì)及特征。,4.統(tǒng)計學(xué)處理,計量資料以S表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用q檢驗，計數(shù)資料用2檢驗，P0.0

9、5為顯著性差異，P0.01為非常顯著性差異，均用SAS軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。,技術(shù)路線圖,可行性分析,1根據(jù)內(nèi)經(jīng)中“在天為氣，在地成形，形氣相感而化生萬物矣”，“五氣入鼻，藏于心肺”，“肺者，氣之本。”，“諸氣者，皆屬于肺?！钡日撌?，腫瘤的病因不外乎內(nèi)因和外因兩個方面?！罢龤獯鎯?nèi)，邪不可干”，“邪之所湊，其氣必虛”。所以肺癌的發(fā)生也不外乎是氣虛所致。以此采用以補氣為主的黃芪治療。肺癌的發(fā)生與人體的免疫力下降有很大的關(guān)系，而現(xiàn)代的藥理研究顯示黃芪具有提高人體免疫力的作用，故采用黃芪干預(yù)肺癌的形成機制是可行的。所以理論上通過腫瘤種植建立轉(zhuǎn)移性肺癌的造模方法，建立肺癌的模型是可行的。,2實驗方法：本課

10、題針對中醫(yī)對腫瘤的病因病機和臨床表現(xiàn)的認識，借鑒現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實驗方法，在建立肺癌小鼠模型的基礎(chǔ)上，并對模型進行了病理檢查、炎癥因子等方面的檢測以及方藥驗證。研究的思路和方法注重中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)，對實驗結(jié)果的分析和相應(yīng)對策也是從中醫(yī)學(xué)中氣的本源出發(fā)，立足于病藥相應(yīng)的原則。 3實施保障：我們依托于山東中醫(yī)藥大學(xué)細胞生物學(xué)實驗室，屬國家中醫(yī)藥管理局三級重點實驗室，為開放實驗室，具備完成該項研究的實驗條件和所用儀器設(shè)備基本能夠滿足，實驗室操作人員經(jīng)驗豐富，具體實驗操作熟練，預(yù)計可以實現(xiàn)本項目的預(yù)期目標(biāo)。實驗中所涉及到的材料和試劑均為商品，在國內(nèi)能夠買到。,本課題特色、預(yù)期取得的結(jié)果,創(chuàng)新點： 1采用中醫(yī)學(xué)

11、和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)相比較的治療的方法，在肺癌病因和臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上，用直接種植腫瘤的辦法建立轉(zhuǎn)移性肺癌的小鼠模型。 2在肺癌小鼠模型建立的基礎(chǔ)上用單味中藥黃芪和紫杉醇相比較對該病證進行對照治療，分析小鼠肺改變，明確肺組織內(nèi)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-9腫瘤壞死因子TNF-等細胞因子的變化規(guī)律，從微觀角度闡釋該病證在治療過程中的動態(tài)變化，并初步明確藥物的作用機制或作用靶點。 3該課題觀察肺癌小鼠模型在黃芪的干預(yù)下的變化，以評價模型的穩(wěn)定性和確定中藥干預(yù)的最佳時機，具有創(chuàng)新性。,國內(nèi)外研究動態(tài),1小鼠肺癌模型研究概況 目前常用的小鼠肺癌動物模型有：（1）將肺癌細胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。（2）將小鼠

12、的氣管分離，經(jīng)過反復(fù)凍融處理，然后將肺癌細胞接種到氣管，結(jié)扎氣管兩端后12，再將氣管移植到重度復(fù)合免疫缺陷小鼠的皮下 。（3）切開胸壁皮膚，將肺癌細胞或肺癌組織直接種植到肺內(nèi)13-14。此方法有一定的創(chuàng)傷性和死亡率，肺癌細胞生長在肺實質(zhì)內(nèi)，但只能使 70%-90%的接種小鼠產(chǎn)生腫瘤，對進行進一步的肺癌研究造成一定的影響。（4）將肺癌細胞直接注入重度復(fù)合免疫缺陷型小鼠的氣管以建立細支氣管內(nèi)的肺癌模型15。,有學(xué)者采用將人類癌組織或腫瘤細胞懸液直接植入支氣管的方法，可以很好模擬支氣管肺癌的臨床特征，但是其技術(shù)要求較高，成功率較低8-9。也有人采用外科手術(shù)移植方法，同樣也是成功率低于 10%10。彭

13、鵬11采用清潔級小鼠C57 BL/6小鼠的腋后線第 6肋間胸腔( 胸腔模型組)或小鼠腋部皮下（皮下模型組）分別移植鼠源性 Lewis肺癌細胞 0.2ml可作為晚期肺癌動物模型。,現(xiàn)在常用的轉(zhuǎn)移性肺癌動物模型有：將肺癌細胞接種于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。將小鼠的氣管分離,經(jīng)過反復(fù)凍融處理 ,然后將肺癌細胞接種到氣管，結(jié)扎氣管兩端后，再將氣管移植到重度復(fù)合免疫缺陷小鼠的皮下21。胸壁皮膚，將肺癌細胞或肺癌組織直接種植到肺臟內(nèi)22，23。也有經(jīng)靜脈注射或心室內(nèi)注射等，建立肺癌轉(zhuǎn)移模型。,2肺癌的治療研究概況,肺癌的治療需依據(jù)病人的身體情況及肺癌的類型和分期采取不同的治療方案。一般而言，非小細胞肺

14、癌采取手術(shù)為主的綜合治療，小細胞肺癌則采用以化療放療為主的綜合治療3。在化療方面，臨床上分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌兩種化療方案。小細胞癌被列入有可能用化療治愈的疾病，目前的標(biāo)準(zhǔn)化療方案是CAV(環(huán)磷酰胺CTX，阿霉素ADR，長春新堿VCR)和EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）非小細胞肺癌對化療不敏感，常用的化療方案有EP（鬼臼乙叉VP-16，順鉑DDP）NP（去長春花堿NVB, 順鉑DDP）GP(吉西他濱GEM，順鉑和卡鉑Carboplatin）TP(紫杉醇TAX，順鉑和卡鉑Carboplatin）DP（多西紫杉醇DOP ，順鉑和卡鉑Carboplatin）。并且21世紀(jì)惡性腫瘤一個重要

15、的治療方向是分子靶向治療，目前應(yīng)用于肺癌的分子靶向藥物有表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑的吉非替尼和埃羅替尼。這類藥物有一個非常顯著的特點是靶人群，如吉非替尼對女性不吸煙的肺腺癌有特別的效果3。,從中醫(yī)理論上看，正氣虛損(氣虛或陰虛)容易發(fā)生腫瘤。周延峰用消瘤方治療非小細胞肺癌顯示消瘤方能提高機體免疫功能，降低患者血液粘度，抑制腫瘤血管生成，促進腫瘤細胞凋亡，下調(diào)突變性P53基因27。陳璐7指出補腎化癖解毒方藥對小鼠移植性肺癌及小鼠肺轉(zhuǎn)移均有明顯的抑制作用并且補腎化癖解毒方藥能提高西藥順鉑(DDP)對兩者的抑制率。黃健飛28指出極低濃度的丹參注射液對荷瘤小鼠的移植瘤有明顯抑制作用，其余濃度的丹

16、參注射液對荷瘤小鼠的移植瘤無明顯抑制作用，不同濃度的丹參注射液無明顯抑制荷瘤小鼠肺部轉(zhuǎn)移的作用，但低濃度和中濃度的丹參注射液能降低轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MMP-9的表達。李保國29指出復(fù)方紫杉醇注射液對移植于 C57BL/6 小鼠的Lewis 肺癌具有明顯的抑制作用，其機制可能與誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡有關(guān)。裘維焰30等指出四君子湯與IFN-，合用時免疚調(diào)節(jié)作用有著明顯影響，并可提高抑瘤率。王立強31等指出蘆薈苦素是蘆薈抗腫瘤、抗白血病的有效成分之一。其抗腫瘤機制可能為促進分裂中期微管聚集，干擾腫瘤細胞的有絲分裂過程和提高機體免疫力。,3黃芪、腫瘤壞死因子及基質(zhì)金屬蛋白酶的變化,癌的發(fā)生是一個多因素多階段復(fù)雜的

17、過程，不僅有外因，還有遺傳因素，免疫狀態(tài)等宿主因素。據(jù)最新統(tǒng)計，中國死于惡性腫瘤的前五位癌癥主要依次為：胃癌，肝癌，食管癌，肺癌，大腸癌32。目前每年全世界至少有700萬人死于癌癥，我國約130萬。因此21世紀(jì)攻克癌癥這一世界難題，具有十分重要的意義。,（1）黃芪,現(xiàn)代藥理研究資料表明，黃芪的免疫調(diào)節(jié)包括對抗免疫抑制劑、增強體液免疫和細胞免疫功能、調(diào)整補體系統(tǒng)、提高紅細胞的免疫功能等方面作用。研究證實，黃芪能增加脾臟的重量、細胞數(shù)及抗體反應(yīng)，對抗由強的松造成的免疫抑制及由環(huán)磷酞胺造成的脾臟重量下降，并能提高“虛證”小鼠血漿cAMP含量，加速淋巴細胞轉(zhuǎn)化，增強T細胞功能，顯著提高E一玫瑰花結(jié)形成

18、率，還有誘生和促誘生干擾素、增強NK細胞及巨噬細胞活性的功能。黃芪的有效成分黃芪多糖能提高抗體形成細胞數(shù)，抑制Ts細胞，其對正常人及腫瘤患者外周血單個核細胞在體外分泌腫瘤壞死因子具有明顯的促進作用32。,黃芪免疫調(diào)節(jié)作用機制尚不完全清楚。一般認為黃芪的作用多系整體調(diào)節(jié)的結(jié)果，即所謂“虛者補之，損者益之”。黃芪在生長過程中從土壤中選擇性吸收硒，因而黃芪富含硒。硒對各種金屬如福、汞、甲基汞等一些化學(xué)致癌物質(zhì)有拮抗作用；硒是谷膚甘膚過氧化酶的一個組成部分，此酶可以保護細胞免受生物氧化過程的損害;硒還能抑制癌細胞的氧化磷酸化作用。最近一項對過敏性哮喘豚鼠的研究顯示黃芪能顯著抑制過敏性哮喘豚鼠氣道壁細胞

19、NF-kB的表達，此可為黃芪的作用機制之一37。此外黃芪總貳可使小鼠肝癌(HepA)和肉瘤(5180)細胞阻止于GO/G 1期，并可誘導(dǎo)其凋亡38；使活化T淋巴細胞內(nèi)游離鈣增加并增強鈣離子內(nèi)流的驅(qū)動力39通過提高細胞表面粘附分子的表達而促進淋巴細胞與內(nèi)皮細胞的粘附，從而促進淋巴細胞再循環(huán)40。柏長青等41指出黃芪提取物注射液能夠明顯降低肺癌患者化療期間常見毒副反應(yīng)的發(fā)生率和嚴重程度，改善患者化療期間的生存質(zhì)量。趙鐵華42等指出黃芪等中草藥具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用。,（2）腫瘤壞死因子（TNF-）,TNF-是由受激的巨噬細胞分泌，局部注射TNF-會誘導(dǎo)小鼠腫瘤壞死，因此被命名為腫瘤壞死因子（TNF

20、）。TNF-為一種重要的炎癥介質(zhì)，由巨噬細胞、淋巴細胞、肺泡上皮細胞等釋放，能激活中性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等促進炎癥顆粒釋放，而且還能與香煙煙霧、LPS等協(xié)同活化炎癥細胞的核因子-B(NF-B)系統(tǒng)，促使炎性細胞因子的mRNA轉(zhuǎn)錄，從而合成炎性細胞因子如IL-1、IL-8、TNF-等，而這些炎癥因子又可以反過來活化炎癥細胞，促進炎癥細胞的合成及釋放炎性介質(zhì)。這就構(gòu)成了炎癥細胞-細胞因子之間的逐步放大環(huán)，促使炎癥慢性化。TNF-最初是在移植腫瘤的小鼠血清中被發(fā)現(xiàn)的43。腫瘤壞死因子（TNF）是體內(nèi)具有多種生物活性的細胞因子，根據(jù)其來源不同可分為兩種，TNF-和TNF-。,TNF-

21、水平升高可以促進腫瘤血管新生、促進腫瘤細胞生長，還激活金屬基質(zhì)蛋白酶等某些降解酶的活性，有利于腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移55-56。有研究表明TNF-表達的強弱與腫瘤細胞的分化程度，臨床分期有關(guān)57-58，但其機制尚不清楚。Selfart等59研究了117名肺癌患者（包括77名非小細胞肺癌患者和40名小細胞肺癌患者）和131名健康人TNF238和TNFIntron1252的基因多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌組TNF238和TNFIntron1252的基因多態(tài)性與對照組相比有顯著性差異，而小細胞肺癌組與對照組相比則無明顯差異。,（3）基質(zhì)金屬蛋白酶,基質(zhì)金屬蛋白酶(martixmetalloproteinase，MMp)是一組具有相同功能、結(jié)構(gòu)高度同源、依賴鋅離子的內(nèi)肽酶的總稱，其主要作用是降解細胞外基質(zhì)(ECM)和基底膜。在正常肺組織中ECM 能維持肺泡結(jié)構(gòu)，其合成與降解保持動態(tài)平衡以保證正常肺功能。平衡破壞時，將會產(chǎn)生以肺結(jié)構(gòu)改變?yōu)樘卣鞯姆闻菁膊。绶伟?、肺纖維化(IPF)等?；|(zhì)金屬蛋白酶具有降解細胞外基質(zhì)的功能，因此是腫瘤細胞向周圍生長乃至向遠處轉(zhuǎn)移的重要工具60-61，幾乎所有類型的人類腫瘤包括肺癌和食管癌中都有MMp尤其是MMP-l、MMP-2、MMP-3和MM