融合蛋白柔性linker的選擇

1、.蛋白融合linker的設(shè)計與選擇 接頭序列(linker)設(shè)計是基因融合技術(shù)能否成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。即通過一段適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄袑⒉煌哪康幕蜻B接起來, 使其在適當(dāng)?shù)纳矬w內(nèi)表達(dá)成為一條單一的肽鏈, 其中起連接作用的氨基酸稱為linker1。融合蛋白中的兩種成分能否分別形成正確的空間結(jié)構(gòu)、 更好的發(fā)揮生物學(xué)活性, 與連接融合蛋白中兩種成分的接頭序列密切相關(guān)。重組生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影響目的蛋白各自的功能。因此, linker序列的設(shè)計和選擇對融合基因的構(gòu)建至關(guān)重要。 針對linker序列的設(shè)計和選擇己有諸多相關(guān)的研究2。目前的研究主要有兩種, 即螺旋形式的lin

2、ker肽如a(eaaak)na和低疏水性、 低電荷效應(yīng)的氨基酸組成的接頭, 以后者應(yīng)用較廣泛。這種低疏水性、 低電荷效應(yīng)的氨基酸組成的多肽接頭能夠充分伸展以分開兩種融合的組分, 使之能在互不干擾的情況下充分折疊成各自的天然構(gòu)象。ryoichi等3在兩種不同功能的融合蛋白之間插入了不同類型的linker序列, 包括可形成螺旋狀的不同長度的肽鏈、 柔性linker以及葡萄糖球菌蛋白a(pa)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)螺旋狀的linker同柔性linker及pa一樣, 可以有效的將融合蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域分開, 甚至可增強融合蛋白的功能。linker的長度是融合基因構(gòu)建的又一個重要的因素。如果linker 的長度過長,

3、 則使融合蛋白對蛋白酶比較敏感, 導(dǎo)致活性融合蛋白在生產(chǎn)過程中的產(chǎn)量下降; 應(yīng)用較短的linker, 可以克服重組蛋白酶分解的問題, 但可使兩個融合分子相距太近導(dǎo)致蛋白功能的喪失。linker的長度不應(yīng)小于3.5 nm , 這是由于相鄰肽鍵的距離為0.38 nm, 因此連接肽至少應(yīng)包含10個氨基酸。目前最為常用的是huston設(shè)計合成的(ggggs)3序列。研究發(fā)現(xiàn), 連接肽為(gly4ser)3的融合蛋白表現(xiàn)出較高的復(fù)性效率。這可能是(gly4ser)3連接肽較長且柔軟, 在復(fù)性時能夠降低融合蛋白的兩組份間的空間位阻, 從而更有利于融合蛋白各個結(jié)構(gòu)域的正確折疊。所以, linker 的長度不

4、能過長也不能過短。精品. linker的選擇, 還應(yīng)考慮linker內(nèi)部的氨基酸序列, 研究發(fā)現(xiàn), linker組成相同但序列不同時, 構(gòu)建的融合蛋白的穩(wěn)定性存在顯著差異; 編碼linker的核苷酸組成, 調(diào)整編碼linker的核苷酸組成, 雖不改變原接頭linker 的氨基酸序列, 但融合蛋白的表達(dá)存在顯著差異。linker序列中有太多的螺旋和角結(jié)構(gòu)會限制融合蛋白的伸縮性, 進(jìn)而影響融合蛋白的生物學(xué)活性?？傊? linker的選擇不是一成不變的, 而要根據(jù)融合蛋白分子的大小和特性來決定。細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、 分泌的一大類多功能、 高活性的生物物質(zhì)。它在介導(dǎo)機體多

5、種免疫反應(yīng)及對各類免疫活性細(xì)胞的分化、 發(fā)育和活化中起著十分重要的作用。細(xì)胞因子融合蛋白(cytokine fusion protein)技術(shù)是當(dāng)今免疫學(xué)研究的一個熱點方向。該方法是基于這些細(xì)胞因子具有相同或相關(guān)的功能活性而各自作用靶點不同, 利用基因工程技術(shù)將兩種或多種細(xì)胞因子融合在一起, 其融合基因表達(dá)產(chǎn)物既具有其組成因子獨特的生物學(xué)活性或使其某些活性顯著提高, 還可能會通過生物學(xué)活性的互補及協(xié)同效應(yīng)發(fā)揮出較單一細(xì)胞因子簡單配伍所不具備的復(fù)合生物學(xué)功能, 甚至還可能會產(chǎn)生一些新的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能, 這種新型的人工蛋白具有極高的應(yīng)用價值和良好的發(fā)展前景。早在1986年seno等用含ecor

6、i的12個核苷酸(4肽)ccggaattcatg為接頭, 將ifn和il2片段加以連接, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的融合蛋白具有ifn與il2的雙重活性。迄今為止, 國內(nèi)外已相繼報道了多種有價值的細(xì)胞因子融合蛋白?，F(xiàn)就細(xì)胞因子融合蛋白技術(shù)的原則、 構(gòu)建類型、 應(yīng)用現(xiàn)狀以及發(fā)展前景做一簡要概述。1 細(xì)胞因子蛋白融合技術(shù)1.1 蛋白融合的構(gòu)建原則 基因工程構(gòu)建細(xì)胞因子融合蛋白須滿足以下幾個條件: (1)各融合分子的目的dna片段置于同一套調(diào)控序列(包括啟動子、 增強子、 核糖體結(jié)合序列、 終止子等)的控制之下。(2)融合分子間須以富含疏水性氨基酸的接頭linker連接, 同時也要考慮接頭序列的長度和核苷酸、

7、氨基酸的組成、 排列順序等因素。如融合蛋白內(nèi)部接頭的不同, 可導(dǎo)致融合蛋白各部分化學(xué)結(jié)構(gòu)的改變, 而影響到各融合分子的空間構(gòu)象, 導(dǎo)致其生物學(xué)活性差異。所以, 設(shè)計肽鏈之間的接頭時, 要盡可能不影響兩端蛋白的自然折疊, 使各融合成分互不干擾。(3)為了保證融合蛋白的生物學(xué)活性, 還需考慮構(gòu)成融合蛋白各成份本身的特性及其相互作用機制。如腫瘤壞死因子(tnf)和精品.干擾素(ifn)在抑制腫瘤細(xì)胞、 增強抗病毒活性等方面有協(xié)同作用。有學(xué)者構(gòu)建了tnf和ifn的融合蛋白, 但發(fā)現(xiàn)該融合蛋白的抗病毒和抗腫瘤活性與單獨應(yīng)用tnf和ifn相比, 抗病毒活性降低24倍, 抗腫瘤活性降低15倍, 與構(gòu)建融合蛋

8、白的初衷相背。分析原因, 可能是這兩種細(xì)胞因子的理化性質(zhì)差異較大, ifn活性穩(wěn)定, 而tnf活性極易喪失, 其融合蛋白在一定程度上影響了彼此的活性。1.2 蛋白融合linker的設(shè)計與選擇 接頭序列(linker)設(shè)計是基因融合技術(shù)能否成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。即通過一段適當(dāng)?shù)暮塑账嵝蛄袑⒉煌哪康幕蜻B接起來, 使其在適當(dāng)?shù)纳矬w內(nèi)表達(dá)成為一條單一的肽鏈, 其中起連接作用的氨基酸稱為linker1。融合蛋白中的兩種成分能否分別形成正確的空間結(jié)構(gòu)、 更好的發(fā)揮生物學(xué)活性, 與連接融合蛋白中兩種成分的接頭序列密切相關(guān)。重組生成的融合蛋白要求插入融合蛋白中的linker不能影響目的蛋白各自的功能。因此

9、, linker序列的設(shè)計和選擇對融合基因的構(gòu)建至關(guān)重要。針對linker序列的設(shè)計和選擇己有諸多相關(guān)的研究2。目前的研究主要有兩種, 即螺旋形式的linker肽如a(eaaak)na和低疏水性、 低電荷效應(yīng)的氨基酸組成的接頭, 以后者應(yīng)用較廣泛。這種低疏水性、 低電荷效應(yīng)的氨基酸組成的多肽接頭能夠充分伸展以分開兩種融合的組分, 使之能在互不干擾的情況下充分折疊成各自的天然構(gòu)象。ryoichi等3在兩種不同功能的融合蛋白之間插入了不同類型的linker序列, 包括可形成螺旋狀的不同長度的肽鏈、 柔性linker以及葡萄糖球菌蛋白a(pa)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)螺旋狀的linker同柔性linker及pa一

10、樣, 可以有效的將融合蛋白的兩個結(jié)構(gòu)域分開, 甚至可增強融合蛋白的功能。linker的長度是融合基因構(gòu)建的又一個重要的因素。如果linker 的長度過長, 則使融合蛋白對蛋白酶比較敏感, 導(dǎo)致活性融合蛋白在生產(chǎn)過程中的產(chǎn)量下降; 應(yīng)用較短的linker, 可以克服重組蛋白酶分解的問題, 但可使兩個融合分子相距太近導(dǎo)致蛋白功能的喪失。linker的長度不應(yīng)小于3.5 nm , 這是由于相鄰肽鍵的距離為0.38 nm, 因此連接肽至少應(yīng)包含10個氨基酸。目前最為常用的是huston設(shè)計合成的(ggggs)3序列。研究發(fā)現(xiàn), 連接肽為(gly4ser)3的融合蛋白表現(xiàn)出較高的復(fù)性效率。這可能是(gl

11、y4ser)3連接肽較長且柔軟, 在復(fù)性時能夠降低融合蛋白的兩組份間的空間位阻, 從而更有利于融合蛋白各個結(jié)構(gòu)域的正確折疊。所以, linker 的長度不能過長也不能過短。linker的選擇, 還應(yīng)考慮linker內(nèi)部的氨基酸序列, 研究發(fā)現(xiàn), linker組成相同但序列不同時, 構(gòu)建的融合蛋白的穩(wěn)定性存在顯著差異; 編碼linker的核苷酸組成, 調(diào)整編碼linker的核苷酸組成, 雖不改變原接頭linker 的氨基酸序列, 但融合蛋白的表達(dá)存在顯著差異。linker序列中有太多的螺旋和角結(jié)構(gòu)會限制融合蛋白的伸縮性, 進(jìn)而影響融合蛋白的生物學(xué)活性?？傊? linker的選擇不是一成不變的,

12、而要根據(jù)融合蛋白分子的大小和特性來決定。2 細(xì)胞因子融合方式及其應(yīng)用根據(jù)細(xì)胞因子融合分子的不同, 可把細(xì)胞因子融合蛋白大致分成以下幾類:精品.2.1 不同或相同細(xì)胞因子的融合蛋白 細(xì)胞因子具有多功能性和通用性, 其作用的靶點各有不同。利用細(xì)胞因子的這一特點, 可以通過基因融合技術(shù)創(chuàng)制出更佳的細(xì)胞因子融合蛋白, 其融合基因表達(dá)產(chǎn)物很可能表現(xiàn)出雙因子簡單配伍所沒有的復(fù)合功能, 而且有可能會增強各個組份間的協(xié)同作用。il3和gmcsf均為造血刺激因子, 它們對不同發(fā)育階段的造血干細(xì)胞及祖細(xì)胞均具有促增殖和分化的作用, 且共用受體鏈。鑒于兩者功能互補, curtis等于1991年構(gòu)建并報道了第一個由不

13、同細(xì)胞因子組成的融合蛋白人gmcsf/il3和il3/gmcsf融合蛋白, 分別稱為plxy321和pixy344。為確保其各自的天然構(gòu)象, 在gmcsf與 il3兩者之間均引入了一段疏水氨基酸序列, 從而保證其與受體的結(jié)合。體外受體結(jié)合實驗證明, pixy321與只表達(dá)il3受體的jm1細(xì)胞株或只表達(dá)gmcsf的hl60細(xì)胞株結(jié)合時其親和力比單體略高, 說明該融合蛋白可經(jīng)il3、 gmcsf結(jié)構(gòu)域與其各自的受體結(jié)合。同時, pixy321對aml193細(xì)胞株的增殖作用及刺激骨髓集落的形成都明顯高于單獨使用il3、 gmcsf或il3加gmcsf的作用, 其作用可提高510倍。il2、 il6

14、是兩個具有多種免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子。1992年fernad等構(gòu)建了兩個人il2/il6融合基因, 目的在于構(gòu)建表達(dá)一種具有雙重功能的免疫調(diào)節(jié)因子, 實驗表明融合蛋白與野生型il2的活性一致, 較il6活性中度下降。出現(xiàn)此結(jié)果的原因可能是由于局部構(gòu)象的改變或者是il2與il6之間的相互作用干擾所致。體外進(jìn)一步研究表明, 該融合蛋白既可誘導(dǎo)t、 b細(xì)胞表達(dá)il2r和il6r, 并且還可作為分子橋梁促進(jìn)和穩(wěn)定t、 b細(xì)胞間的相互作用。國內(nèi)的趙春華等也構(gòu)建和高效表達(dá)了具有促進(jìn)細(xì)胞集落形成、 促進(jìn)lak的增殖作用的il2/il6融合蛋白。將兩種相同的細(xì)胞因子融合在一起也可以起到明顯的生物學(xué)功能。馬大龍

15、等構(gòu)建了人雙體il6、 雙體il3融合蛋白, 研究表明雙體il6與單體il6在生物學(xué)活性上差別不大, 但雙體il3對人骨髓細(xì)胞的集落刺激作用明顯高于單體il3的作用。il7是t、 b淋巴細(xì)胞成熟分化過程中重要的細(xì)胞因子, 可以增強成熟t細(xì)胞的增殖及其功能, 并有促進(jìn)ctl增殖、 分化并加強其殺傷活性, 刺激lak細(xì)胞活性的能力。lai等4用一段柔性接頭將il7和人肝細(xì)胞生長因子片段( hepatocyte growth factor beta2 chain, hgf beta)連接, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)融合蛋白能選擇性的高效刺激b祖細(xì)胞系的增殖。胰島素樣生長因子(igf)常與其他生長因子一起發(fā)揮協(xié)同作用

16、, 是最好的二聯(lián)細(xì)胞因子融合蛋白的備選因子。igf ii可刺激多種組織中細(xì)胞的增殖或分化。將igf ii與一段信號肽以及胰島素樣的昆蟲激素bomyxin的n端序列融合表達(dá), 便可得到分泌形式的具有生物活性的bomigf。difalco等制備了一種bomigf和il3的融合蛋白, 體外試驗中它可刺激正常外周血細(xì)胞中的骨髓干細(xì)胞集落形成, 體內(nèi)試驗結(jié)果亦顯示該融合蛋白能動員具有高度增殖活性的骨髓干細(xì)胞進(jìn)人外周血, 進(jìn)而定居至脾臟而發(fā)揮造血功能。2.2 細(xì)胞因子與其受體的融合蛋白 細(xì)胞因子與其受體結(jié)合時, 可促進(jìn)其與其他相關(guān)分子的結(jié)合, 進(jìn)而提高其生物學(xué)活性的發(fā)揮。il6在肝細(xì)胞的增殖中起著增強作用

17、。il6和il6ra (gp80)的結(jié)合使其易于和另一個受體il6r(gp130)結(jié)合。可溶性il6r蛋白(sil6r)與il6結(jié)合后, 靶細(xì)胞對il精品.6的敏感性增高, 并可使僅表達(dá)膜結(jié)合型il6r的細(xì)胞(il6r/gp130)對il6起反應(yīng)。在sil6r/il6雙基因轉(zhuǎn)染的小鼠中, sil6r發(fā)揮錨定il6的作用, 延長血漿il6半衰期, 同時細(xì)胞對il6的敏感性顯著提高。bcl2蛋白家族是細(xì)胞程序性死亡的重要調(diào)節(jié)因子, bclxl是bcl2蛋白家族中的重要成員之一, 它能在多種類型的細(xì)胞上抑制由各種刺激所誘發(fā)的細(xì)胞死亡。粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(gmcsf)具有刺激粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集

18、落增長的能力, 其功能的發(fā)揮依賴于它與gmcsf特異性受體的結(jié)合。antonella等5將人gmcsf與bclxl蛋白融合, 該融合蛋白可與人單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞和骨髓祖細(xì)胞的上的gmcsf受體結(jié)合誘導(dǎo)其增殖, 并使bclxl進(jìn)入細(xì)胞抑制細(xì)胞的死亡, 加速細(xì)胞的增殖。2.3 細(xì)胞因子與抗原融合蛋白 某些細(xì)胞因子可以招募抗原提呈細(xì)胞(apc), 促進(jìn)apc 的成熟和信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 調(diào)節(jié)t細(xì)胞的功能, 從而提高機體對抗原的免疫應(yīng)答。因此, 人們通過基因融合技術(shù), 將細(xì)胞因子與抗原融合, 使其更好的發(fā)揮基因佐劑作用。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的免疫球蛋白(獨特型, id)可以作為腫瘤特異性抗原, 在b細(xì)胞淋巴瘤中已證明

19、用免疫球蛋白的可變區(qū)(即獨特型)免疫動物, 可保護動物免受隨后的腫瘤攻擊。tao等從b淋巴瘤細(xì)胞(38c13)分離出id, 將其與gmcsf基因融合, 構(gòu)建了id與gmcsf融合蛋白, id的免疫原性顯著增強, 可誘導(dǎo)出具有抗腫瘤作用的特異性抗id抗體。隨后chen等又構(gòu)建了id il2和id il4兩種融合蛋白, 均具有比較高的免疫原性。用id il2融合蛋白進(jìn)行免疫可產(chǎn)生高滴度的抗獨特型抗體igg2a和lgg3, 而id il4和id gmcsf融合蛋白則無此作用。這3種融合蛋白都能誘導(dǎo)抗獨特型抗體的產(chǎn)生, 且不需要載體蛋白和佐劑。楊登科等6構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌的ag85b和il2嵌合基因疫

20、苗, 研究發(fā)現(xiàn)該融合蛋白具有ag85b和il2的雙重功能活性, 兩者融合后產(chǎn)生協(xié)同作用, 在體外促進(jìn)了外周血單核細(xì)胞的增殖和th1型細(xì)胞因子的分泌。hitoki等7構(gòu)建了il12和鼠疫耶爾森菌f1v融合蛋白(il12/f1v, 莢膜蛋白抗原(f1ag), 毒力抗原(vag)共表達(dá)基因疫苗, 研究發(fā)現(xiàn), 用肺鼠疫攻毒后, il12(低表達(dá))/f1v相比il12(低表達(dá))/f1、 il12(低表達(dá))/v和il12(低表達(dá))/載體(vector) dna疫苗而言, 80%的小鼠獲得保護。mark等8構(gòu)建了豚鼠髓脂質(zhì)堿性蛋白(guinea pig myelin basic protein, gpmbp

21、; neuroantigen or nag)的主要致腦炎肽和白細(xì)胞介素16(il16)融合蛋白, 研究發(fā)現(xiàn)該融合蛋白是路易鼠實驗性自身免疫性腦脊髓炎的有效抑制劑并證實il16是研制致耐受性疫苗的最佳候選細(xì)胞因子。細(xì)胞因子與抗原融合產(chǎn)生的佐劑效應(yīng), 可能比游離的細(xì)胞因子產(chǎn)生的佐劑效應(yīng)具有更多的優(yōu)點。因而, 在疫苗研究中, 細(xì)胞因子作為免疫佐劑越來越受到人們的重視。2.4 細(xì)胞因子與抗體融合蛋白 將抗體分子的片段與細(xì)胞因子融合, 該融合蛋白不但結(jié)合了抗體與抗原特異性結(jié)合的特性, 還具有細(xì)胞因子的多功能活性, 從而可借助抗體將細(xì)胞因子導(dǎo)向到特定的靶部位, 使其高效發(fā)揮生物學(xué)功能, 減輕全身毒副作用。

22、il2是免疫反應(yīng)的重要介導(dǎo)分子, 也是重要的抗腫瘤細(xì)胞因子之一。在體外, il2可促使細(xì)胞毒性t細(xì)胞、 nk細(xì)胞及輔助t細(xì)胞增殖、 誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞毒性的細(xì)胞因子, 誘導(dǎo)lak細(xì)胞增殖?？贵wil2融合蛋白可將il2靶向腫瘤灶, 提高腫瘤局部il2的濃度, 從而達(dá)到更好的抗腫瘤效應(yīng), 同時也有助于減輕il2的毒性。heuser等構(gòu)建了抗黏蛋白的scfv精品.fcil2融合蛋白(c595 scfvfcil2), 實驗表明此融合蛋白能同時特異性地結(jié)合muci+的腫瘤細(xì)胞和cd25+的免疫效應(yīng)細(xì)胞。體外試驗還發(fā)現(xiàn), 該融合蛋白能刺激活化的t細(xì)胞增殖, 介導(dǎo)靜息的nk細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷。在免疫重建的sci

23、d鼠黑色素瘤肝、 肺轉(zhuǎn)移瘤模型中, 腫瘤特異性的融合蛋白ch225 il2和ch14.18 il2可抑制轉(zhuǎn)移灶的生長, 甚至在注射腫瘤細(xì)胞后8 d, 腫瘤己形成情況下, 也能完全消退微轉(zhuǎn)移病灶。該研究表明借助抗體將細(xì)胞因子導(dǎo)向到腫瘤部位的免疫治療方法可有效對抗人類黑色素瘤的播散。reinartz等將il6與抗獨特型單克隆抗體重組, 制備了chaca125il6融合蛋白并將其用于卵巢癌的研究。小鼠抗獨特型單抗aca125模擬卵巢癌細(xì)胞上的ca125抗原, 可誘導(dǎo)抗-抗獨特型抗體反應(yīng), 該反應(yīng)與卵巢癌患者生存時間呈正相關(guān)。試驗結(jié)果表明: 融合蛋白接種后抗ca125(ab3)的濃度較il6與chac

24、a聯(lián)用高, 且未觀察到抗人il6抗體的產(chǎn)生, 而聯(lián)用情況下可以檢測到抗人il6抗體產(chǎn)生。il12是介導(dǎo)先天免疫及細(xì)胞免疫的重要細(xì)胞因子, 具有很強的抑制腫瘤及阻止腫瘤轉(zhuǎn)移的活性。在體外, il12對于腫瘤細(xì)胞沒有直接的作用, 但il12能激活t細(xì)胞及nk細(xì)胞, 刺激cd4+ t細(xì)胞向th1細(xì)胞分化, 后者產(chǎn)生的細(xì)胞因子可激活ctl 和巨噬細(xì)胞。il12也是血管形成的強效抑制劑, 可通過誘導(dǎo)ifn等的分泌抑制血管形成, 進(jìn)而抑制體內(nèi)腫瘤的生長。纖連蛋白(fibronectin, fn)為一種高分子量多功能糖蛋白, 是血管形成的標(biāo)志, 主要聚集于新生血管的周圍, 在腫瘤的浸潤事件中起重要作用。ha

25、lin等采用抗fn的scfv l19與il12融合, 發(fā)現(xiàn)該融合蛋白具有強大的抗腫瘤活性, 可導(dǎo)致腫瘤組織中的t細(xì)胞、 nk細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤。此外, 在鼠腫瘤肺轉(zhuǎn)移動物模型中證實, 應(yīng)用該融合蛋白治療比應(yīng)用等量的il12具有更強的抗轉(zhuǎn)移效應(yīng)。gmcsf能刺激造血細(xì)胞的增殖及分化, 也是一種多功能的免疫調(diào)節(jié)因子。gmcsf能提高各種apc的抗原提呈及促進(jìn)單核細(xì)胞表達(dá)mhcii類分子、 粒細(xì)胞表達(dá)黏附分子及刺激t細(xì)胞增殖。動物試驗證實, 注射gmcsf后, 通過增強t細(xì)胞免疫, 能提高抗腫瘤疫苗的保護效應(yīng)。helguera等將鼠gmcsf與her2抗體融合, 觀察到該融合蛋白既保持了與人her2

26、/neu抗原的特異性結(jié)合能力, 同時也保持了與重組鼠gmcsf相似的生物學(xué)活性, 在小鼠體內(nèi)能夠明顯抑制表達(dá)her2/neu的腫瘤細(xì)胞生長, 能同時增強th1和th2型細(xì)胞的免疫應(yīng)答。2.5 細(xì)胞因子與毒素融合蛋白 細(xì)胞因子與毒素的融合蛋白是以細(xì)胞因子取代毒素分子的識別區(qū)域, 使毒素蛋白能選擇性地殺傷含有相應(yīng)細(xì)胞因子受體的靶細(xì)胞, 從而達(dá)到治療那些細(xì)胞因子引起病理性作用的疾病, 如自身免疫性疾病、 移植排斥反應(yīng)等。腫瘤細(xì)胞因其惡性增殖、 缺少接觸抑制的特性, 不同腫瘤細(xì)胞均有其異于正常組織細(xì)胞的受體特征, 將細(xì)胞因子與毒素蛋白融合, 可利用細(xì)胞因子作為靶向載體將細(xì)胞毒素運送到腫瘤微環(huán)境, 使該

27、融合蛋白能選擇性殺傷含有相應(yīng)細(xì)胞因子受體的靶細(xì)胞, 實現(xiàn)靶向腫瘤的治療作用。白喉毒素具有高效的細(xì)胞毒性, 利用其與不同的目的基因融合成的各種毒素復(fù)合物, 可對表達(dá)一些特異性受體或蛋白的細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用, 尤其是一些腫瘤細(xì)胞。體外試驗表明, 白喉毒素il2的融合蛋白(dab389il2)對表達(dá)高親和力il2受體的細(xì)胞株起毒性作用, 而缺乏完整的高親和力受體的細(xì)胞株(有p55亞單位而無p75亞單位)則對該融合毒素相對耐受。saleh等報道dab389 il精品.2在皮膚t細(xì)胞淋巴瘤(cutaneous t cell lymphoma, ctcl)期臨床試驗中單獨使用顯示出顯著的臨床治療效果。dab

28、389il2已成為美國食品與藥品管理局(fda)批準(zhǔn)的臨床治療藥物。張建新等基于骨髓瘤、 原發(fā)性肝癌等腫瘤細(xì)胞表面il6受體可過度表達(dá)的事實, 用il6 cdna取代白喉毒素的受體結(jié)合區(qū), 構(gòu)建表達(dá)了白喉毒素/il6融合蛋白。研究表明, 此種融合蛋白對表面有大量il6受體的骨髓瘤細(xì)胞(u266)有較強的細(xì)胞毒作用而il6受體較少的正常細(xì)胞對其有一定的耐受性。前列腺特異性抗原啟動子(prostatespecific antigen promoter, pspa)具有高度的組織特異性, 僅在pspa陽性的前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)。yu等構(gòu)建了以人免疫缺陷病毒為基礎(chǔ)的病毒表達(dá)載體, 在該載體中使pspa和

29、dta(白喉毒素a基因)基因形成融合基因。結(jié)果表明, pspa可以高效、 特異地在前列腺癌細(xì)胞中啟動dta基因表達(dá)并產(chǎn)生自殺作用。體外實驗表明, 它在雄激素存在的情況下可以殺死psa陽性的前列腺癌細(xì)胞。在異種移植psa陽性的前列腺癌細(xì)胞鼠體內(nèi)試驗證實, 可以使腫瘤細(xì)胞快速退化, 并使其存活時間超過一年而沒有腫瘤的進(jìn)展, 但在psa陰性的對照卻沒有這種效果。這一研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)染基因可以對進(jìn)展的前列腺腫瘤產(chǎn)生治療效果。假單胞菌外毒素a(pseudomonas exotoxin a, pe)為不可逆性蛋白合成抑制劑, 將其細(xì)胞結(jié)合域刪除即為pe40, 其僅表現(xiàn)出極低的細(xì)胞和動物毒性。將編碼tgf的基

30、因與pe40基因融合, 其表達(dá)產(chǎn)物既有tgf受體結(jié)合活性又保留有pe的細(xì)胞毒性。某些腫瘤如人類胰腺癌組織過度表達(dá)上皮生長因子受體(egfreceptor), 其配體之一即tgf。實驗證明tp40這一雙功能蛋白能抑制或殺傷表達(dá)高水平egf受體的腫瘤細(xì)胞。2.6 細(xì)胞因子與血清白蛋白融合 血清白蛋白是血漿的重要成分, 正常情況下不易透過腎小球, 體內(nèi)分布極廣而且沒有酶學(xué)和免疫學(xué)活性, 是理想的藥物載體。白蛋白融合技術(shù)具有以下優(yōu)點: 白蛋白與目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)蛋白翻譯系統(tǒng)通過肽鍵連接, 不需額外的體外處理; 白蛋白的表達(dá)水平較高, 與其融合后可以提高目的蛋白的表達(dá)水平; 白蛋白是一個穩(wěn)定的“惰性”蛋

31、白, 與其融合后可以提高目的蛋白的穩(wěn)定性; 白蛋白融合蛋白具有較長的藥物半衰期。如人血清白蛋白(has)自身在血漿中的半衰期長達(dá)19 d, 將小分子蛋白藥物與hsa融合可有望提高在血液中的半衰期。目前, 多種蛋白與hsa 融合后在實驗動物體內(nèi)半衰期的延長得到了證實。唱韶紅等用畢赤酵母中表達(dá)的hsahifn2b融合蛋白在獼猴體內(nèi)的半衰期約為普通 ifn的20 倍。美國馬里蘭州人類基因組科學(xué)(hgs)公司進(jìn)行了一系列hsa融合蛋白質(zhì)藥物的研究, hsa/ifn融合蛋白9、 hsa/ifn 融合蛋白(albuferon)10、 hsa/ril2 融合蛋白(albuleukin)11、 hsa/rgc

32、sf 融合蛋白(albugranin)12、 hsa/rhgh 融合蛋白(albutropin)13都具有明顯的半衰期延長作用。3 細(xì)胞因子融合蛋白技術(shù)在獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展前景細(xì)胞因子的種類繁多且每一種細(xì)胞因子的作用又具有多樣性, 其在機體內(nèi)環(huán)境中的相互作用更為復(fù)雜, 因而細(xì)胞因子融合蛋白的研究幾乎涵蓋了所有常見的細(xì)胞因子。在功能上相關(guān)的細(xì)胞因子或分子, 其融合蛋白的生物學(xué)活性若能夠高于或等于各個組份簡單相加的效果, 即具有其他單體分子無法比擬的高效性, 便有構(gòu)建融合蛋白分子的意義14。其次, 細(xì)胞因子融合蛋白在與特定的靶向性分子結(jié)合之后, 可將有一定毒性的細(xì)胞因子選擇性的、 特異性的濃集于病灶

33、局部, 使全身性的不良反應(yīng)降至最低點, 即具有某些單體細(xì)胞因子所不具有的特異性, 也是融合蛋白的研究方向之一。此外, 諸多融合蛋白雖有衍生因子的雙重活性, 但其活性較野生型低或在實際應(yīng)用中與衍生因子配伍不明顯, 解決分子的生物學(xué)活性與毒副作用問題是細(xì)胞因子融合蛋白發(fā)展的實踐需求。但是, 細(xì)胞因子融合蛋白也有其缺點, 如在重復(fù)使用時由于已產(chǎn)生了中和抗體而抑制了其活性的發(fā)揮。因此, 在構(gòu)建細(xì)胞因子融合蛋白時, 必須慎重選擇所融合的細(xì)胞因子, 并且在設(shè)計中盡可能降低分子量以減少免疫原性。精品.融合蛋白技術(shù)是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ纳锕こ碳夹g(shù), 在腫瘤治療研究中15, 很多制品已進(jìn)入了臨床試驗, 并取得了

34、令人鼓舞的進(jìn)展。目前, 有關(guān)動物細(xì)胞因子的研究也得到了迅猛發(fā)展, 一些重組細(xì)胞因子已在動物疾病的預(yù)防、 治療和診斷, 特別是在發(fā)展安全、 高效基因工程疫苗等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景。相信在不遠(yuǎn)的將來, 人們可以應(yīng)用細(xì)胞因子融合蛋白技術(shù)設(shè)計和獲得高表達(dá)、 高活性的融合蛋白制劑, 從而為動物疾病的防控帶來新的希望?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】 1 gustavsson m, lehtio j, denman s, et al. stable linker peptides for a cellulosebinding domainlipase fusion protein expressed in pichia

35、pastorisj. protein eng, 2001, 14(9): 711-715.2 chiquito jc, feng ja. linker: a program to generate linker sequences for fusion proteinsj. protein eng, 2000, 13(5): 309-312.3 ryoichi a, hiroshi u, atsushi k, et al. design of linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion proteinj

36、. protein eng, 2001, 14(bsupp1): 529-532.4 lai l, zeff r, gold schneider i. a recombinant singlechain il7/ hgf beta hybrid cytokine induces juxtacrine interactions of the il7 and hgf (cmet) receptors and stimulates the proliferation of cfus12, clps and preprob cellsj. blood, 2006, 107(5): 1776-1784.

37、5 antonella a, richard jy. the cytokine, granulocytemacrophage colonystimulating factor (gmcsf), can deliver bclxl as an extracellular fusion protein to protect cells from apoptosis and retain differentiation inductionj. j biol chem, 2007, 282(15): 11246-11254.6 楊登科, 靳鳳爍, 張 勇, 等. ag85b/ il2 融合蛋白在體外對

38、pbmc 增殖及th1 型細(xì)胞因子分泌的影響j. 醫(yī)學(xué)臨床研究, 2006, 23(2): 181-187.7 hitoki y, teri h, xinghong yang, et al. a nasal interleukin12 dna vaccine coexpressing yersinia pestis f1v fusion protein confers protection against pneumonic plaguej. infec immu, 2008, p 4564-4573.8 mark dm, derek ja. a fusion protein consisti

39、ng of il精品.16 and the encephalitogenic peptide of myelin basic protein constitutes an antigenspecific tolerogenic vaccine that inhibits experimental autoimmune encephalomyelitisj. j immunol, 2007, 179: 1458-1465.9 osborn bl, olsen hs, nardelli b, et al. pharmacokinetic and pharmacodynamic studies of a human serum albumininterferonalpha fusion protein in cynomolgus monkeysj. pharmacol exp ther, 2002, 303(2): 540-548.10 sung c, nardelli b, lafleur dw, et al. an ifnbetaalbumin fusion protein that displays improved pharmacokinetic a