資料課件講義分析21_jxkj

1、第二十一章色譜聯(lián)用分析法第二十一章色譜聯(lián)用分析法儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法兩種色譜聯(lián)用（色譜-色譜）分析法提高分離能力色譜聯(lián)用分析法色譜與質(zhì)譜、波譜聯(lián)用的分析方法提高定性能力儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法色譜-質(zhì)譜、波譜聯(lián)用分析法將分離能力很強的色譜儀與定性、定結(jié)構(gòu)能力很強的質(zhì)譜或光譜儀器通過適當?shù)慕涌?interface)相結(jié)合成完整的分析儀器，借助計算機技術(shù)進行物質(zhì)分析的方法。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法第一節(jié)色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析法主要包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用GC-MS高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用HPLC-MS毛細管電泳質(zhì)譜聯(lián)用CE-MS儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法一、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（一

2、）原理由于GC的試樣呈氣態(tài)，流動相也是氣體， 與質(zhì)譜儀的進樣要求相匹配，故最容易將這兩種儀器聯(lián)用。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法分離試樣中各組分，起著樣品制備的作用氣相色譜儀起著氣相色譜和質(zhì)譜之間適配器的作用接口質(zhì)譜儀氣相色譜儀的檢測器獲得色譜和質(zhì)譜數(shù)據(jù)，進行數(shù)據(jù)采集和處理計算機系統(tǒng)儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（二）氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器主要由色譜單元、質(zhì)譜單元和接口三大部分組成1接口(interface)實現(xiàn)聯(lián)用的關(guān)鍵接口裝置的作用將色譜與質(zhì)譜聯(lián)接起來，以除去載氣、降低氣相色譜儀柱后流出物的氣壓，同時對試樣起富集的作用，并把組分送到質(zhì)譜儀的離子源。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法GC-M

3、S對接口的一般要求是：能使色譜分離后的各組分盡可能多地進入 質(zhì)譜儀，并使載氣盡可能少地進入質(zhì)譜系統(tǒng)。維持離子源的高真空。組分在通過接口時應(yīng)不發(fā)生化學變化。接口對試樣的有效傳遞應(yīng)具有良好的重現(xiàn)性。接口的控制操作應(yīng)簡單、方便、可靠。接口應(yīng)盡可能的短,以使試樣盡可能快速通過接口。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法GC-MS的接口有直接導(dǎo)入型和濃縮型裝置結(jié)構(gòu)簡單，容易維護，但它無濃縮作用直接導(dǎo)入型噴射式濃縮型接口具備去除載氣、濃縮樣品的功能，即具有分子分離的能力儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法2質(zhì)譜單元GC-MS中的質(zhì)譜應(yīng)滿足下列要求：u 真空系統(tǒng)不受載氣流量的影響u 靈

4、敏度和分辨率與色譜系統(tǒng)匹配u 掃描速度與色譜流出速度相適應(yīng)儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（1）離子源電子轟擊源（EI）是GC-MS中最常用的離子源優(yōu)點：譜圖重現(xiàn)性好有較多的碎片離子，提供豐富的結(jié)構(gòu)信息靈敏度高化學電離源（CI）也是GC-MS配置的離子源之一儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（2）質(zhì)量分析器 四極質(zhì)量分析器掃描速度快，并可從正離子到負離子檢測自動切換，而且靈巧輕便，價格便宜，是GC-MS中最流行的質(zhì)量分析器。 離子阱質(zhì)量分析器 飛行時間質(zhì)量分析器儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法3色譜單元用于GC-MS色譜系統(tǒng)應(yīng)該符合質(zhì)譜儀的一些特殊要求。主要是：固定相應(yīng)選擇耐高溫，不易流失的固定

5、液， 最好用鍵合相。載氣應(yīng)不干擾質(zhì)譜檢測，一般常用氦氣。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（三）氣相色譜質(zhì)譜分析的應(yīng)用GC-MS聯(lián)用分析的靈敏度高，適合于低分子化合物(相對分子質(zhì)量1000）的分析，尤其適合于揮發(fā)性成分的分析。 在藥物的生產(chǎn)、質(zhì)量控制和研究中 在中藥揮發(fā)性成分的鑒定 食品和中藥中農(nóng)藥殘留量的測定 體育競賽中 環(huán)境監(jiān)測等藥品的檢測儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法二、高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（一）原理以高效液相色譜為分離手段，以質(zhì)譜為鑒定和測定手段，通過適當接口(interface)將二者聯(lián)接成完整儀器。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（二）高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀器1高效液相色譜質(zhì)譜接口

6、和離子化接口裝置必須既能滿足液、質(zhì)兩譜在線聯(lián)用的真空匹配要求，又能實現(xiàn)被分析組分的離子化。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法離子化方式有兩種：試樣在離子源中以氣體形式被離子化是從固體表面或溶液中濺射出帶電離子大氣壓離子化-最常用 電噴霧離子化（ESI） 大氣壓化學離子化 (APCI) 大氣壓光離子化(APPI)儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（1）電噴霧離子化接口電噴霧離子化是將溶液中試樣離子轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子的一種接口離子蒸發(fā)形成氣態(tài)離子帶電液滴的形成溶劑蒸發(fā)和液滴碎裂儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法電噴霧接口示意圖儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法電噴霧離子化過程示意圖儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分

7、析法u HPLC-ESI-MS譜圖主要給出準分子離子的相關(guān)信息，例如在單電荷情況下的M+H+、M+Na+、MH-等，對于生物大分子如蛋白質(zhì)、肽等， 還能產(chǎn)生大量的多電荷離子。u ESI常用于強極性、熱不穩(wěn)定化合物及高分子化合物的測定。u ESI的主要缺點是只能允許非常小的流動相流量。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（2）大氣壓化學離子化接口大氣壓化學離子化接口將溶液中組分的分子轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離子的一種接口u APCI適用分析有一定揮發(fā)性的中等極性與弱極性，相對分子質(zhì)量在2000以下的小分子化合物。u 最大優(yōu)點是使HPLC與MS有很高的匹配度,允許使用流速高及含水量高的流動相，極易與RP- HPLC

8、條件匹配。u 與ESI相比，APCI對流動相種類、流速及添加物的依賴性較小。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（2）質(zhì)量分析器 四極質(zhì)量分析器 離子阱質(zhì)量分析器 飛行時間質(zhì)量分析器儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法串聯(lián)四極質(zhì)量分析器-使用較廣泛將三個四極質(zhì)量分析器串聯(lián)起來使用u 第一個四極質(zhì)量分析器進行質(zhì)量分離u 第二個四極質(zhì)量分析器-碰撞池，產(chǎn)生產(chǎn)物離子u 產(chǎn)物離子由第三個四極質(zhì)量分析器分離分析串聯(lián)四極質(zhì)量分析器能夠進行選擇反應(yīng)監(jiān)測，選擇性更高，使用串聯(lián)四極質(zhì)量分析器的質(zhì)譜稱為串聯(lián)質(zhì)譜。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法3色譜單元u HPLC-MS中的色譜柱一般短柱，以縮短分析時間，最常用的固定相

9、為ODS。u HPLC-MS對流動相的基本要求是不含非揮發(fā)性鹽類，以防其析出堵塞毛細管等。u 所用溶劑的純度最好都是色譜純。u 流動相中揮發(fā)性電解質(zhì)如甲酸、乙酸、氨水、乙酸銨等的濃度也不能太高。u 流動相的pH、流速均對檢測靈敏度有很大影響。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（三）高效液相色譜質(zhì)譜分析的特點和應(yīng)用1高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的特點適用的范圍寬。提供各種信息?？僧a(chǎn)生準分子離子和多級質(zhì)譜可提供豐富的結(jié)構(gòu)信息。有很高的靈敏度和樣品通量?？稍谏V分離不完全的情況下對復(fù)雜基質(zhì)中的痕量組分進行快速定性和定量分析。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法2高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的應(yīng)用和分析條件液相色譜質(zhì)譜

10、聯(lián)用技術(shù)在藥學、臨床醫(yī)學、生物學、食品化工等許多領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法u HPLC-MS分析實驗條件的選擇：（1）流動相和流量：常用流動相為水、甲醇、乙腈及它們的混合物，可用醋酸、甲酸或它們的銨鹽溶液調(diào)節(jié)pH，應(yīng)避免磷酸鹽或離子對試劑等。流量對LC-MS分析有較大影響。（2） 離子檢測模式：堿性物質(zhì)選擇正離子檢測模式， 可用醋酸或甲酸使試樣酸化至pKa2。酸性物質(zhì)及 含有較多強電負性基團的物質(zhì)，選擇負離子檢測模 式。（3） 溫度：接口的干燥氣體溫度應(yīng)高于待分析物沸點20左右，同時要考慮物質(zhì)的熱穩(wěn)定性和流動相中有機溶劑的比例。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法三、毛

11、細管電泳質(zhì)譜聯(lián)用CE的高效分離能力與MS鑒定結(jié)構(gòu)能力的有機結(jié)合儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法若實現(xiàn)毛細管電泳-ESI-質(zhì)譜聯(lián)用，須解決的問題：電壓匹配問題。CE是依賴電滲作為流體的動力，若與質(zhì)譜聯(lián)接時， 質(zhì)譜的高真空與CE造成的真空差，將會引起CE的電滲流的擾動，破壞分離。CE的進樣量小，要求MS要有很高的靈敏度。CE分離工作大都是使用磷酸鹽緩沖溶液來完成，與MS聯(lián)用時，只能用易揮發(fā)鹽的緩沖鹽溶液。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法四、色譜質(zhì)譜的掃描模式及其提供的信息色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析掃描模式u 全掃描（fullscanning）u 選擇離子監(jiān)測(SIM)u 選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)儀器分析第二

12、十一章色譜聯(lián)用分析法（一）全掃描全掃描是質(zhì)量分析器在給定的時間范圍內(nèi)對給定質(zhì)荷比范圍進行無間斷地掃描， 獲得樣品中每一個組分（或在某一特定時刻）的全部質(zhì)譜。在這種掃描模式下，可以獲得各種定性和定量信息。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法1色譜質(zhì)譜三維譜X坐標表示質(zhì)荷比m/z，Y坐標表示時間或連續(xù)掃描的次數(shù)，Z坐標表示離子流的強度(離子豐度)。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法2.質(zhì)譜M或+將全掃描得到的分子離子準分子離子（M+H+、MH-、M+Na+等）及所有碎片離 子的質(zhì)荷比與其對應(yīng)的離子流的相對強度作圖給出總離子流色譜圖上每一個色譜峰的質(zhì)譜儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法3.總離子流色譜圖（T

13、IC）是總離子流強度隨時間（掃描次數(shù)）變化的色譜圖其中對應(yīng)某一時間點的峰高是該時間點流 進的組分的所有質(zhì)荷比的離子強度的加和。給出保留值、峰高和峰面積儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法4.質(zhì)量色譜圖是從計算機存儲的總離子流色譜圖的數(shù)據(jù)中，按質(zhì)荷比調(diào)出的色譜圖。質(zhì)量色譜可以鑒別某化合物或具有某基團的一組化合物的存在。即使沒有實現(xiàn)色譜完全分離的峰也可進行定量。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（二）選擇離子監(jiān)測u 選擇離子監(jiān)測是對一個或一組特定離子進行檢測的技術(shù)。u 只檢測一個質(zhì)量的離子稱為單離子監(jiān)測(SIM)u 檢測多離子的稱為多離子檢測(MID)u 選擇離子監(jiān)測可以

14、把全掃描模式所得的復(fù)雜 的總離子色譜圖變得非常簡單，即獲得的質(zhì) 量色譜圖。提高了靈敏度，同時有更快的掃 描速度。選擇離子監(jiān)測主要用于定量分析。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（三）選擇反應(yīng)監(jiān)測選擇反應(yīng)監(jiān)測是串聯(lián)質(zhì)譜的一種檢測模式，即 監(jiān)測一個或幾個特定的離子反應(yīng)，監(jiān)測幾個離子反應(yīng)又稱為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)。選擇反應(yīng)監(jiān)測能對復(fù)雜混合物中的痕量組分進行快速鑒別和定量分析，選擇性高，靈敏度高。此外，產(chǎn)物離子掃描、前體離子掃描和中性丟失掃描三種模式也是串聯(lián)質(zhì)譜的檢測模式。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法第二節(jié)其他聯(lián)用分析法一、氣相色譜傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用（一）氣相色譜傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用儀器由氣相

15、色譜儀、接口、傅立葉變換紅外光譜儀及計算機系統(tǒng)四部分組成。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（二）氣相色譜傅立葉變換紅外光譜聯(lián)用獲得的譜圖1. 實時三維譜圖在相在應(yīng)相軟應(yīng)件軟控件制控下制，下儀，器儀進器行進實時行傅實立時葉傅變立換葉，變在換顯，示在顯 器上示實器時上顯實示時G顯C餾示分GC的餾氣分態(tài)的氣譜態(tài)圖IR譜圖，其x軸為波數(shù)，軸y為軸波為數(shù)吸，光y軸度為，吸z軸光為度時，間軸為時間2. 重建色譜圖由紅外檢測器記錄的干涉圖經(jīng)計算機處理后得到的色譜圖3. 紅外光譜圖儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法重建色譜圖包括：（1）化學圖（2）Gram-Schmidt重建色譜圖（3）紅外總吸收度重建色譜圖儀

16、器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法二、高效液相色譜核磁共振波譜聯(lián)用核磁共振波譜是測定有機化合物結(jié)構(gòu)的最強有力的技術(shù)之一但是實現(xiàn)這種聯(lián)用又是最具有挑戰(zhàn)性的一門技術(shù)HPLC流動相中的質(zhì)子嚴重干擾組分的1H-NMR譜梯度洗脫時，溶劑的濃度不斷變化，值也不斷變化核磁共振波譜的靈敏度較低NMR難于與HPLC在線聯(lián)用儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法HPLC-NMR能夠獲得復(fù)雜試樣中微量組分的定性信息及二級結(jié)構(gòu)信息，能測定這些組分的氫譜、碳譜及各種相關(guān)譜，必將成為復(fù)雜試樣如中藥的活性成分、生物樣品中的藥物及其代謝物等微量組分的定性分析和結(jié)構(gòu)鑒定的最重要手段，目前已經(jīng)出現(xiàn)了LC-NMR-MS聯(lián)用技術(shù)用于代謝組學研

17、究。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法三、色譜色譜聯(lián)用u 色譜色譜聯(lián)用是由多種不同類型的色譜組合而成的聯(lián)用系統(tǒng)，又稱為色譜，其主要作用是提高色譜分辨能力和增加峰容量。由同類流動相、相同分離機制但不同選擇性色譜 柱串聯(lián)組成，例如GC-GC、HPLC-HPLC及SFC-SFC等。由不同類流動相、不同分離機制及不同選擇性色 譜柱組成，例如HPLC-GC、HPLC-SFC、SFC-GC、HPLC-CE及GC-TLC、SFC-TLC、HPLC-TLC等。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法（一）全二維氣相色譜全二維氣相色譜（C2D-GC）是將分離機制不同而又相互獨立的兩根色譜柱串聯(lián)起來，經(jīng)柱1 分離后的每一個流分都經(jīng)過接口進行聚焦，然 后以脈沖方式依次進入柱2進行第二次分離， 組分從柱2流出后進入檢測器，信號經(jīng)計算機系統(tǒng)處理后，得到以柱1保留時間為縱坐標， 柱2保留時間為橫坐標的二維色譜圖。儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法1.全二維氣相色譜儀器u （1）接口u （2）色譜柱u （3）檢測器儀器分析第二十一章色譜聯(lián)用分析法2全二維氣相色譜的特點和應(yīng)用特點：u 峰容量大。u 分析速度快u 靈