沙眼衣原體檢測(cè)新進(jìn)展

沙眼衣原體檢測(cè)新進(jìn)展,楊會(huì)林,衣原體Chlamydia,一類能通過(guò)細(xì)菌濾器，專性真核細(xì)胞內(nèi)寄生，有獨(dú)特發(fā)育周期的微生物；體積略大于病毒，光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)，具有DNA、RNA兩種核酸、核糖體和近似細(xì)胞壁的膜；以二分裂方式進(jìn)行增值；能被抗生素抑制，現(xiàn)歸于廣義的細(xì)菌范疇。,沙眼衣原體C. trachomatis,具有特殊發(fā)育周期，鏡檢可觀察到兩種不同形態(tài)結(jié)構(gòu)：1.原體（EB）：存在于細(xì)胞外，具有高度感染性2.始體（RB）：存在于細(xì)胞內(nèi)，繁殖型，代謝活潑，無(wú)感染性,衣原體分類,按第九版Bergey細(xì)菌學(xué)分類手冊(cè)，衣原體分類上屬于衣原體目（Chlamydiales）,下有衣原體科（Chlamydiceae）、衣原體屬(Chlamydia)。根據(jù)衣原體的抗原結(jié)構(gòu)和DNA同源性特點(diǎn)，衣原體分為四個(gè)種，包括沙眼衣原體（C. trachomatis）、肺炎衣原體（C.pneumoniae）、鸚鵡熱衣原體（C.psittaci）和家畜衣原體（C.pecorum）。前三種對(duì)人致病，以沙眼衣原體（CT）常見(jiàn)。,沙眼衣原體C. trachomatis,分A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、I、Ia、J、K、L1、L2、L2a、L3等18個(gè)血清型，不同血清型能引起不同疾病。分3個(gè)生物型，即小鼠生物型、沙眼生物型和性病淋巴肉芽腫型。后兩者與人類疾病相關(guān)。,CT抗原結(jié)構(gòu),屬特異性抗原：衣原體胞壁脂多糖（LPS） 識(shí)別表位位于2-酮基-3-脫氧辛酸（KDO）三糖 可與腸道菌Re突變株發(fā)生交叉反應(yīng)種特異性抗原：主要外膜蛋白（MOMP），可進(jìn)行補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和中和試驗(yàn)檢測(cè)型特異性抗原：位于MOMP上,沙眼衣原體(CT)感染,感染眼結(jié)膜引起沙眼，包涵體結(jié)膜炎；沙眼衣原體是性傳播疾病的主要病原體。在男性主要引起非淋菌性尿道炎或可合并附睪炎、前列腺炎、性病淋巴肉芽腫等；在女性可引起尿道炎、宮頸炎、輸卵管炎、盆腔炎等。嚴(yán)重患者可導(dǎo)致不孕及異位妊娠；能通過(guò)性接觸或非性接觸方式感染新生兒、兒童，引起新生兒肺炎和新生兒包涵體結(jié)膜炎，給預(yù)防沙眼衣原體感染帶來(lái)很大困難。,沙眼衣原體(CT)感染,沙眼衣原體感染,沙眼衣原體感染,沙眼衣原體(CT)感染,常與淋病奈瑟菌混合感染（50%）。淋病奈瑟菌對(duì)衣原體繁殖起著激活和促進(jìn)作用。衣原體感染能增加人群獲得HIV的概率。最近有研究提出，CT感染能提高患癌癥風(fēng)險(xiǎn)。CT感染可破壞p53蛋白，增加突變細(xì)胞存活的風(fēng)險(xiǎn)，最終引發(fā)癌癥。,沙眼衣原體感染流行病學(xué),傳播途徑：通過(guò)性接觸傳播，母嬰垂直傳播，接觸沙眼患者的毛巾、不潔洗臉?biāo)湍樑鑲鞑?；在女性宮頸炎和男性尿道感染中，臨床上常表現(xiàn)為無(wú)癥狀，呈隱性感染，成為攜帶者，更易導(dǎo)致感染傳播。,沙眼衣原體感染流行病學(xué),據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，每年有9200萬(wàn)新發(fā)的沙眼衣原體感染病例。在美國(guó)，Datta SD 等調(diào)查顯示，14歲-39歲的群體中，沙眼衣原體的感染率約為4.6%；在歐洲，Redmond S等的一項(xiàng)大規(guī)模調(diào)查顯示，18歲-26歲之間有過(guò)性經(jīng)驗(yàn)的群體中，沙眼衣原體的感染率約為3.6%；Peters R等統(tǒng)計(jì)指出，在非洲一些國(guó)家的的鄉(xiāng)下，女性沙眼衣原體的感染率可達(dá)16%以上；,沙眼衣原體感染流行病學(xué),在中國(guó)Li CL等于2012年湖北省的一項(xiàng)婚前篩查報(bào)告顯示，有3.6%的婚前女性感染沙眼衣原體；Chen XS 等2013年一份針對(duì)女性性工作者的研究顯示，在女性性工作者中，衣原體感染率高達(dá)17.3%；有調(diào)查統(tǒng)計(jì)顯示，深圳地區(qū)非淋球菌性尿道炎患者中，男性患者沙眼衣原體的檢出率為30.57%，女性為21.19%。,沙眼衣原體感染防治,沙眼衣原體對(duì)阿奇霉素、強(qiáng)力霉素、喹諾酮類抗生素敏感，確診后容易治療。防治沙眼衣原體感染和傳播的主要難點(diǎn)在于準(zhǔn)確、及時(shí)找到病原菌。,CT標(biāo)本采集及運(yùn)送,標(biāo)本采集：1.沙眼及包涵體結(jié)膜炎患者：擦凈膿性分泌物，用拭子在結(jié)膜上穹窿或下穹窿用力涂擦，或取眼結(jié)膜刮片；2.泌尿生殖系統(tǒng)感染患者：男性患者用無(wú)菌棉拭子插入尿道口2cm出旋轉(zhuǎn)35秒后取出；女性患者選取宮頸移行部位采樣。3.小兒肺炎患者：用拭子在鼻咽后部或咽部采集。4.性病肉芽腫標(biāo)本：采集淋巴結(jié)膿汁。標(biāo)本運(yùn)送：置于2SP培養(yǎng)基運(yùn)送，2SP培養(yǎng)基含蔗糖、磷酸鹽緩沖液、胎牛血清、抗生素等成分。標(biāo)本采樣后5天內(nèi)檢驗(yàn)，標(biāo)本應(yīng)暫存于4。,沙眼衣原體的檢測(cè)技術(shù),直接涂片鏡檢：檢測(cè)包涵體細(xì)胞培養(yǎng)抗原檢測(cè)： 直接熒光抗體測(cè)定、酶免疫測(cè)定、膠體金法抗體檢測(cè)核酸檢測(cè)： 核酸探針檢測(cè)、PCR、熒光定量PCR、PCR產(chǎn)物直接測(cè)序,直接涂片染色鏡檢,CT寄生于細(xì)胞內(nèi)形成包涵體，通過(guò)碘染色或吉姆薩染色可見(jiàn)細(xì)胞內(nèi)包涵體,直接涂片染色鏡檢,方法學(xué)評(píng)價(jià)：直接涂片染色鏡檢，操作簡(jiǎn)便；包涵體的檢出對(duì)急性、嚴(yán)重的新生兒包涵體性結(jié)膜炎的診斷價(jià)值大；泌尿生殖道內(nèi)完整細(xì)胞少，細(xì)胞內(nèi)包涵體脆性較大，造成敏感性較低。,細(xì)胞培養(yǎng)法,由于CT專性細(xì)胞內(nèi)寄生，可用68天齡雞胚卵黃囊及各種傳代細(xì)胞培養(yǎng)。在適宜條件下，將含CT的標(biāo)本接種于經(jīng)放線菌酮處理過(guò)的單層小鼠成纖維細(xì)胞（McCoy）或人宮頸癌細(xì)胞（Hela-299），孵育后染色，鏡下檢測(cè)包涵體。,衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法,細(xì)胞培養(yǎng)步驟：制備致密單層細(xì)胞。以Hela-299細(xì)胞為例，六孔板每孔接種75萬(wàn)細(xì)胞，孵育24小時(shí)；以30ug/ml DEAE-葡聚糖處理細(xì)胞30min，提高細(xì)胞膜內(nèi)吞能力；棄掉DEAE-葡聚糖，換5ml未加血清的培養(yǎng)液，加入菌液。菌液的量要根據(jù)菌液濃度而定，過(guò)高會(huì)造成細(xì)胞病變過(guò)快，提前大量死亡，過(guò)少會(huì)造成陽(yáng)性率過(guò)低，無(wú)法觀察或計(jì)數(shù)；六孔板3000rpm 1238g 離心。通過(guò)物理作用加速促進(jìn)衣原體進(jìn)入細(xì)胞。有文獻(xiàn)報(bào)道，通過(guò)離心可以提高感染效率100倍；,衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法,孵箱中孵育兩小時(shí)，提供衣原體進(jìn)一步感染的時(shí)間，也給細(xì)胞一個(gè)回復(fù)狀態(tài)的時(shí)間。更換感染液：細(xì)胞培養(yǎng)液+1g/mL放線菌酮。4872小時(shí)碘染色或Giemsa染色或Macchavello染色觀察結(jié)果。,衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法,衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法,特異性100%和敏感性80%90%。被認(rèn)為是CT檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”分離培養(yǎng)操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，所需時(shí)間長(zhǎng)標(biāo)本敏感性受標(biāo)本采集、運(yùn)送、保存等的影響較大各實(shí)驗(yàn)室技術(shù)水平不同，標(biāo)準(zhǔn)化難度大多用于科研和臨床疑難病例的最終鑒定,膠體金法,膠體金法,衣原體標(biāo)本預(yù)處理后與膠體金標(biāo)記抗體及二抗結(jié)合優(yōu)點(diǎn)：快速簡(jiǎn)單，半小時(shí)內(nèi)出結(jié)果，易于觀察判斷；缺點(diǎn)：敏感性低、不能定量檢測(cè)；不同公司試劑和同一公司試劑批間差異大。,酶免疫測(cè)定（EIA）,用ELISA方法，使用酶標(biāo)記的單克隆或多克隆抗體檢測(cè)CT的可溶性抗原。常用脂多糖（LPS）單克隆抗體或多克隆抗體進(jìn)行檢測(cè)。,酶免疫測(cè)定（EIA）,敏感性為64%98%，特異性為93%98%簡(jiǎn)便。適用于自動(dòng)化。適于短時(shí)間內(nèi)大批量標(biāo)本的檢測(cè)與其它微生物感染偶有交叉反應(yīng)，如金黃色葡萄球菌、淋病奈瑟菌、A群、B群鏈球菌等。,微量熒光免疫法抗體檢測(cè),檢測(cè)患者血清中有無(wú)CT抗體。性病性淋巴肉芽腫、附睪炎、輸卵管炎患者血清中CT水平明顯升高，該方法有助于診斷。部分患者感染CT后并不產(chǎn)生或僅產(chǎn)生少量抗體，此時(shí)檢測(cè)容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。檢測(cè)重復(fù)性差，目前并無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。不建議單獨(dú)用于CT感染診斷。,直接熒光抗體測(cè)定（DFA）,用熒光物標(biāo)記CT單克隆或多克隆抗體（多為抗沙眼衣原體MOMP單克隆抗體），與相應(yīng)抗原結(jié)合反應(yīng)，直接進(jìn)行觀察。,直接熒光抗體測(cè)定（DFA）,在男性和女性樣本中敏感性分別為70%100%和68%100%，特異性分別為87%99%和82%100%；檢測(cè)快速簡(jiǎn)便；不像培養(yǎng)法必須有活力的CT。對(duì)子宮內(nèi)膜和輸卵管樣本，DFA法敏感性高于培養(yǎng)法，且適用于直腸樣本；敏感性與特異性取決于單克隆或多克隆抗體；熒光容易淬滅，結(jié)果判斷有主觀性和經(jīng)驗(yàn)性，不適合于大批量樣本檢測(cè)。,核酸雜交法,用125I標(biāo)記CT rDNA探針檢測(cè)宮頸拭子。敏感性與特異性分別為細(xì)胞培養(yǎng)法的82.8%和99.4%。用吖啶酯標(biāo)記單鏈DNA探針，與標(biāo)本中 CT rRNA雜交，用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定。敏感性與特異性分別為60%93%和95.8% 98.8%。,PCR檢測(cè),提取DNA，設(shè)計(jì)引物及探針，擴(kuò)增特定DNA片段1.普通PCR：易污染引起假陽(yáng)性，不能定量檢測(cè)。2.熒光定量PCR：全閉管擴(kuò)增系統(tǒng)，避免污染；以參照物為標(biāo)準(zhǔn)，能對(duì)拷貝數(shù)進(jìn)行定量分析。,熒光定量PCR檢測(cè),PCR檢測(cè),特異性高，敏感性好。熒光定量PCR無(wú)電泳所致的交叉污染定量檢測(cè)。目前有研究認(rèn)為泌尿生殖系統(tǒng)中CT的感染量與患者的臨床表現(xiàn)有關(guān)。CT定量檢測(cè)有助于臨床診斷與療效判斷。男性可以以尿標(biāo)本代替?zhèn)鹘y(tǒng)的尿道拭子，方便收集樣本，容易為患者接受?？梢栽O(shè)計(jì)同一病原體不同DNA片段的二重PCR技術(shù)，有效檢測(cè)某一目的基因發(fā)生突變的標(biāo)本?？梢詸z測(cè)不同病原體的二重PCR，如雅培公司CT/NG試劑盒。較傳統(tǒng)檢測(cè)方法通量高，適用于大規(guī)模流行病學(xué)研究。,EIA、PCR、DFA三種方法比較,PCR產(chǎn)物直接測(cè)序,CT MOMP基因經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增后，再將PCR產(chǎn)物測(cè)序，可以完成對(duì)CT的分型檢測(cè)。單血清型CT感染檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。適于單血清型CT感染分型檢測(cè)及大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查。測(cè)序方法不適于雙重或多重感染。而CT雙重或多重感染率為5%15%,CT檢測(cè)技